TNF結(jié)合肽和TNFR封閉肽對(duì)TNF

1、TNF結(jié)合肽和TNFR關(guān)閉肽對(duì)TNF尹丙姣,喻明霞,王晶,姜曉丹,李卓婭【關(guān)鍵詞】TNFBilgialharateristisandeffetfTNFbindingpeptideandTNFRblkingpeptideinvitrKeyrdsTNF;TNFbindingpeptide(TBP);TNFRblkingpeptide(TRBP)摘要目的:檢測(cè)TNF結(jié)合肽TBP和TNFR關(guān)閉肽TRBP的生物學(xué)特性及成效。要領(lǐng):以GFPTNF交融卵白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)行,檢測(cè)TBP和TRBP的特異性。用非變性PAGE檢測(cè)TBP和TRBP的互補(bǔ)結(jié)合性。用細(xì)胞毒按捺實(shí)行,不雅察TBP和TRBP對(duì)TNF殺傷U937

2、細(xì)胞的按捺作用。用硝基藍(lán)四氮唑NBT復(fù)本來(lái)領(lǐng)和RTPR技能,檢測(cè)TBP和TRBP對(duì)TNF誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞的呼吸發(fā)作和對(duì)促炎癥因子IL1和IL8RNA程度的按捺作用。結(jié)果:TBP和TRBP能按捺GFPTNF交融卵白與細(xì)胞膜上TNFR的結(jié)合。非變性PAGE證明,TBP與TRBP之間的結(jié)合,為非配體和受體的結(jié)合;TBP和TRBP對(duì)TNF的細(xì)胞毒效應(yīng)均有按捺作用,且隨著劑量的增長(zhǎng)而加強(qiáng),二者聯(lián)用(即pep.38+X4)結(jié)果更好。TBP和TRBP聯(lián)用,能有用地按捺TNF和IFN誘導(dǎo)的單核細(xì)胞呼吸發(fā)作的強(qiáng)度,按捺TNF誘導(dǎo)的IL1和IL8RNA的轉(zhuǎn)錄。結(jié)論:TBP和TRBP具有結(jié)合TNF和TNFR的

3、特異性,但二者的結(jié)合為非配體和受體的彼此結(jié)合。TBP和TRBP對(duì)TNF介導(dǎo)的種種生物學(xué)效應(yīng)均具有按捺作用,二者聯(lián)用結(jié)果更明顯。關(guān)鍵詞TNF;TNF結(jié)合肽;TNFR關(guān)閉肽腫瘤壞死因子TNF是一種重要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子,可到場(chǎng)機(jī)體抗腫瘤、抗熏染、調(diào)治免疫應(yīng)答及炎癥反響等多種生理和病理歷程1-3。在急性炎癥反響中,TNF是一種起始的關(guān)鍵性的細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)其他炎性細(xì)胞因子如IL1、IL6及IL8的表達(dá),從而加劇炎癥反響,引起發(fā)熱、內(nèi)毒素樣休克等病癥。在類風(fēng)濕性樞紐炎、潰瘍性結(jié)腸炎及多發(fā)性硬化等自身免疫性疾病的發(fā)病歷程中,TNF也起關(guān)鍵性作用。因此,以TNF及TNFR為靶點(diǎn)方案

4、藥物,可有用地阻斷上述病理歷程,到達(dá)治療TNF相干的炎癥性疾病的目的。本室曾別離以TNF和TNFRI為誘餌,從噬菌體隨機(jī)環(huán)肽庫(kù)中挑選出能與TNF結(jié)合的環(huán)九肽,即TNF結(jié)合肽TNFbandingpeptide,TBP和能與TNFR結(jié)合又不激活受體后反響的環(huán)九肽,即TNFR關(guān)閉肽TNFRblkingpeptide,TRBP4。本實(shí)行中進(jìn)一步不雅察了TBP和TRBP對(duì)TNF介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)、誘導(dǎo)IL1、IL8的表達(dá),以及促外周血單核細(xì)胞呼吸發(fā)作的按捺作用,為研制TNF相干的抗炎藥物奠基了基矗1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料STNF尺度品和TT為Siga公司產(chǎn)物。TRIzlRNA提取試劑為GIB公司產(chǎn)物。RTk

5、it為BI公司產(chǎn)物。TaqDNA聚合酶為bistar公司產(chǎn)物。PR引物為上海博亞公司產(chǎn)物。TBP和TRBP由西安美聯(lián)公司合成并環(huán)化,純度均為95%。綠色熒光卵白GFPTNF交融卵白由本室制備。人單核細(xì)胞株U937細(xì)胞和小鼠成纖維細(xì)胞株L929細(xì)胞,均由本實(shí)行室保存供實(shí)行利用。1.2要領(lǐng)2結(jié)果2.1TBP和TRBP按捺TNF和TNFR結(jié)合的作用利用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡技能證明,合成多肽能按捺GFPTNF交融卵白與細(xì)胞膜上的TNFR結(jié)合。此中,TBP(Pep.38)與TRBP(pep.X4)聯(lián)用的按捺結(jié)果最好,能使U937細(xì)胞結(jié)合GFPTNF熒光卵白的陽(yáng)性細(xì)胞率低落50%,并可明顯減低L929細(xì)

6、胞膜上的熒光強(qiáng)度圖1,提示人工合成的TBP和TRBP仍具有按捺TNF和TNFR結(jié)合的作用。圖1TBP和TRBP對(duì)GFPTNF交融卵白與L929細(xì)胞TNFR結(jié)合的按捺作用略Fig1InhibitryeffetfTBPandTRBPnbindingfGFPTNFtTNFRnL929ells(200)A:GFPTNF;B:GFPTNF+unrelatedpeptided;:GFPTNF+(pep.38+pep.X4).圖2TBP和TRBP及TBP加TRBP的PAGE闡發(fā)略Fig2SDSPAGEanalysisfTBP,TRBPandTBPplusTRBP1:pep.38;2:pep.X4;3:pep

7、.38+X4.圖3TBP和TRBP對(duì)TNF介導(dǎo)的U937細(xì)胞毒效應(yīng)的按捺作用略Fig3InhibitryeffetnyttxiityfU937ellsediatedbyTNF2.4TBP與TRBP對(duì)外周血單核細(xì)胞的影響利用NBT復(fù)原法檢測(cè)表白,同時(shí)賜與外源性IFN和TNF別離為5g/L和5103U/L激活單核細(xì)胞的作用,顯著強(qiáng)于單獨(dú)的TBP和TRBP的作用,表示為呼吸發(fā)作的強(qiáng)度明顯加強(qiáng)圖4。TBP和TRBP聯(lián)用,能有用地按捺TNF和IFN誘導(dǎo)的單核細(xì)胞呼吸發(fā)作的強(qiáng)度,使反響體系中NBT的復(fù)本來(lái)領(lǐng)削弱,A630值明顯低落按捺率為56.25%。RTPR檢測(cè)也證明,TBP和TRBP聯(lián)用能按捺TNF誘

8、導(dǎo)的IL1和IL8RNA轉(zhuǎn)錄的程度圖5。對(duì)RTPR產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)的條帶舉行掃描表現(xiàn),其對(duì)IL1和IL8RNA轉(zhuǎn)錄的按捺率別離為55.10%和52.53%。上述結(jié)果表白,TBP和TRBP可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地按捺TNF與TNFR的結(jié)合,低落單核細(xì)胞對(duì)IFN刺激的敏感性而按捺其活化。圖4TBP和TRBP對(duì)TNF和IFN誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞呼吸發(fā)作的影響略Fig4TheeffetfTBPandTRBPnrespiratryburst(RB)fperipheralbldnytesinduedbyTNFandIFN3討論本課題組曾經(jīng)以TNFRI為誘餌從噬菌體隨機(jī)線肽庫(kù)中挑選出TRBP含14個(gè)氨基酸的線肽5,6。

9、體外實(shí)行證明,其對(duì)TNF的生物學(xué)效應(yīng)具有按捺作用;但是據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,環(huán)肽與線肽比擬具有較龐大的構(gòu)象、不變好、生物半衰期長(zhǎng)等長(zhǎng)處7。因此,本課題組又別離以TNF和TNFRI為誘餌,從噬菌體隨機(jī)環(huán)肽庫(kù)中挑選TBP和TRBP環(huán)九肽,本研究通過(guò)體外實(shí)行進(jìn)一步證明了其生物學(xué)成效。將噬菌體展示的肽舉行人工合成,有大概其空間構(gòu)象產(chǎn)生改變而影響其效應(yīng)。因此,起首必需證明TBP和TRBP是否仍舊保存了其別離結(jié)合TNF和TNFR的特性。本研究中,我們用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡技能證明,兩種合成肽通過(guò)別離與TNF和TNFR結(jié)合,而競(jìng)爭(zhēng)性地按捺GFPTNF與細(xì)胞膜上TNFR的結(jié)合,從而使GFPTNF+的U937細(xì)胞的比率

10、低落,熒光強(qiáng)度顯著削弱。以上提示,TBP和TRBP與噬菌體上展示的肽一樣,仍具有別離結(jié)合TNF和TNFR的活性。本實(shí)行中進(jìn)一步檢測(cè)了TBP和TRBP對(duì)TNF細(xì)胞殺傷效應(yīng)的按捺作用。結(jié)果表白,TBP和TRBP對(duì)TNF的殺傷效應(yīng)均有按捺作用,并隨著劑量的增長(zhǎng)而加強(qiáng),并且TBP和TRBP聯(lián)用(pep.38+pep.X4)的按捺結(jié)果更佳,這些結(jié)果表白,合成肽與噬菌體展示的肽一樣,同樣具有按捺TNF殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)。本實(shí)行證明,別離用5g/L和5103U/L的外源性IFN和TNF,就可誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞的呼吸發(fā)作及IL1RNA和IL8RNA的轉(zhuǎn)錄。但TBP和TRBP可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)地按捺TNF與人外周血單核

11、細(xì)胞外貌TNFR的結(jié)合,低落單核細(xì)胞對(duì)IFN的敏感性,從而按捺單核細(xì)胞的活化,表示為呼吸發(fā)作強(qiáng)度顯著削弱,復(fù)原NBT的本領(lǐng)低落;及使單核細(xì)胞中IL1和IL8等RNA的程度落落。參考文獻(xiàn):1BeatlerB,eraiA.ahetinandTNFastsidesfthesaebilgialinJ.Nature,1986,320(6063):584-588.2BeutlerBA.TherlefturnersisfatrinhealthanddiseaseJ.JRheuatlSuppl,1999,57:16-21.3VanderPllT,LrySF.TNFinsepsis:ediatrfultiplerganfailureressentialpartfhstdefenseJ.Shk,1995,3(1):1-12.4尹丙姣,王晶,喻明霞,等.TBP和TRBP的挑選及其特異性斷定J.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版,2022,346:660-663.5何亞萍,尹丙姣,李卓婭,等.TNF受體關(guān)閉肽對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞成效的影響J.中國(guó)免疫學(xué)雜志,2022,6(19):385-388.6YanfaskySD,BaldinDN,ButlerJH,etal.Highaffinitytyp