第五章分子生物學(xué)研究法上課件

1、第五章分子生物學(xué)基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白質(zhì)操作技術(shù) 現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，得益于上個(gè)世紀(jì)中葉以來(lái)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、雜交、電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、表達(dá)、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類(lèi)分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過(guò)它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來(lái)自其它生物的

2、基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件（三大成就）：一、在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者（即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題）；二、50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；三、50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。5.1 基因操作的基本工具5.2 DNA操作技術(shù)5.3 RNA基本操作技術(shù)5.4 SNP的理論與應(yīng)用5.5 基因克?。╟lone）技術(shù)5.6 蛋白質(zhì)與蛋

3、白質(zhì)組學(xué)技術(shù)（一）限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)并產(chǎn)生具有粘性末端（不是整齊地切開(kāi)，即在兩條鏈上的切開(kāi)位點(diǎn)不對(duì)稱）的小片段。 5.1 基因操作的基本工具圖5-1 幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切位點(diǎn)（二）基因克隆的載體基因克隆即重組DNA技術(shù),指在體外對(duì)DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶學(xué)方法將不同來(lái)源的DNA分子在體外剪切和重新連接,組裝成一個(gè)新的DNA分子。在此基礎(chǔ)上,將這個(gè)DNA分子導(dǎo)入到一定的宿主細(xì)胞,使它

4、能夠在宿主細(xì)胞中擴(kuò)增,形成大量的子代分子,此過(guò)程即稱為基因克隆.基因克隆包括四個(gè)基本技術(shù)環(huán)節(jié):目的基因和載體的獲得;目的基因與載體連接,形成重組分子;重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞;含有重組DNA分子的細(xì)胞的篩選和擴(kuò)增；基因克隆又稱為DNA重組技術(shù),DNA克隆或分子克隆?；蚩寺≥d體的三要素：自我復(fù)制能力；攜帶外源基因片段大?。徊迦胛稽c(diǎn)多少；易于鑒定識(shí)別程度。大腸桿菌質(zhì)粒載體: 1、pSC101質(zhì)粒載體低拷貝數(shù)嚴(yán)緊型復(fù)制控制的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個(gè)寄主細(xì)胞僅有12個(gè)拷貝。長(zhǎng)9.09kb，帶有四環(huán)素抗性基因（tetr）及EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及S

5、maI等7種限制性核酸內(nèi)切酶的單酶切位點(diǎn)，在HindIII、BamHI和SalI等3個(gè)位點(diǎn)插入外源基因，會(huì)導(dǎo)致tetr失活。大腸桿菌pSC101質(zhì)粒載體示意圖。是第一個(gè)真核基因克隆載體。缺點(diǎn)：它是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制（在寄主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制除了受本身的復(fù)制機(jī)構(gòu)的控制外，還受染色體的嚴(yán)緊控制，因此拷貝數(shù)較少，一般只有12個(gè)/每染色體。）的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細(xì)胞中提取pSC101 DNA，產(chǎn)量很低。2、ColE1質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制控制的多拷貝質(zhì)粒。一般情況下，當(dāng)培養(yǎng)基中氨基酸被耗盡，或是在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復(fù)制便被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)也隨之停止。而松弛型

6、質(zhì)粒DNA卻繼續(xù)復(fù)制數(shù)小時(shí)，使每個(gè)寄主細(xì)胞中ColE1質(zhì)粒的拷貝數(shù)達(dá)到10003000個(gè)，占細(xì)胞總DNA的50%左右。3、穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmid vector） 指由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。由于這類(lèi)質(zhì)粒載體可以保證外源DNA序列在不同物種的細(xì)胞之間得到擴(kuò)增，能在原核和真核細(xì)胞之間往返穿梭，具有廣泛的用途。5. 2. 1 核酸的凝膠電泳自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白

7、質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。 5.2 DNA操作技術(shù)一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場(chǎng)中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對(duì)之間

8、。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力 凝膠類(lèi)型及濃度 分離DNA的大小范圍（bp） 0.3%瓊脂糖 50 0001 000 0.7%瓊脂糖 20 0001 000 1.4%瓊脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。（溴化乙錠是高度靈敏的熒光染色劑，具有高致癌性! 普通淺黃色乳膠手套不

9、能很好的阻擋，最好用藍(lán)色實(shí)驗(yàn)用手套。）DNA脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE pulsed-field gel electrophoresis） 示意圖 在脈沖電場(chǎng)中，DNA分子的遷移方向隨著電場(chǎng)方向的周期性變化而不斷改變。在標(biāo)準(zhǔn)的PFGE中，第一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向在另一側(cè)成45夾角。由于瓊脂糖凝膠的電場(chǎng)方向、電流大小及作用時(shí)間都在交替變化，使得DNA分子能夠隨時(shí)調(diào)整其游動(dòng)方向，以適應(yīng)凝膠孔隙的無(wú)規(guī)則變化。 5. 2. 2 細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖通過(guò)細(xì)菌轉(zhuǎn)化方法將體外構(gòu)建好的雜種DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。外源DNA通過(guò)自身載體上的復(fù)制起始點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制增殖，能在宿主細(xì)胞中長(zhǎng)期保存下來(lái)，并能以完整的

10、形式從細(xì)胞中被分離純化出來(lái)。細(xì)菌轉(zhuǎn)化（transformation），是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自供體菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。 細(xì)菌轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選 為提高效率，可對(duì)受體菌進(jìn)行物理或化學(xué)處理，增加其獲取DNA的能力。經(jīng)過(guò)這種處理的細(xì)胞被稱作感受態(tài)細(xì)胞（competent cells）。藍(lán)白斑篩選原理圖兩種增強(qiáng)轉(zhuǎn)化的處理方法： CaCl2法將快速生長(zhǎng)期大腸桿菌置于經(jīng)0預(yù)處理的低滲CaCl2溶液中，細(xì)胞膨脹，膜通透性改變，易與外源DNA相粘附。將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細(xì)

11、胞吸收。將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞置于選擇性培養(yǎng)基上，篩選陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到51062107個(gè)轉(zhuǎn)化子/g超螺旋質(zhì)粒DNA（轉(zhuǎn)化后的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子transformant ）。 電擊法電脈沖（電場(chǎng)強(qiáng)度、方向或電流的周期性變化）可以在細(xì)胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。隨著跨膜電壓增加，大疏水性孔洞會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性孔洞，介質(zhì)中的DNA易于進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。電脈沖處理的具體方法：將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期的E. coli菌液冷卻至4后離心，洗菌后用10%的甘油懸浮，將高密度菌液（21010/ml）置于特制的電極杯中進(jìn)行電擊。獲得最大轉(zhuǎn)化效率時(shí)場(chǎng)強(qiáng)一般為12.515kV/cm，時(shí)間跨度一般為4.55.5毫秒。電擊轉(zhuǎn)化與溫

12、度有關(guān)，一般在04進(jìn)行。由于轉(zhuǎn)化載體上常帶有LacZ基因（大腸桿菌乳糖操縱子中的一個(gè)基因），多用帶有不同抗生素（常用的抗生素包括氨芐青霉素、卡那霉素和四環(huán)素等）的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合藍(lán)白斑篩選法鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 5. 2. 3聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是快速擴(kuò)增DNA序列最常用的方法。PCR反應(yīng)的模板DNA若是基因組上的某個(gè)片段，就稱為genomic PCR，若是mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA，就稱為RT-PCR。PCR技術(shù)的原理：首先將雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)的溫度下加熱分離成兩條單鏈DNA分子，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種脫氧核苷三磷酸合成新生的DNA互補(bǔ)

13、鏈。 步驟（三步）： DNA解鏈（變性） 引物與模板DNA相結(jié)合（退火） DNA合成（鏈的延伸）經(jīng)不斷重復(fù)循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)（兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)），理論上的最高值應(yīng)是2n, 實(shí)得1.8n（n：循環(huán)次數(shù)）。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù) PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較DNA解鏈（PCR的第一步）：高溫處理將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（94）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。94加熱，淬火引物與模板DNA相結(jié)合（第二步）：退火降低反應(yīng)溫度（退火，約50），約1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DN

14、A結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。5060，退火引物與模板DNA相結(jié)合DNA合成（第三步）：將反應(yīng)混合物的溫度上升到72左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。PCR擴(kuò)增，72左右, 按每分鐘1000個(gè)堿基對(duì)設(shè)計(jì)循環(huán)往復(fù)常規(guī)PCR技術(shù)能擴(kuò)增兩引物之間的DNA區(qū)段，然而，有時(shí)我們也希望擴(kuò)增位于靶DNA區(qū)段之外的未知DNA序列，這就需要應(yīng)用反向PCR（reverse PCR）技術(shù)。 先用一種在靶DNA區(qū)段上沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的核酸限制內(nèi)切酶，從距靶DNA區(qū)段有一定距離的兩側(cè)位置切割DNA分子，然后將這些片段

15、作分子內(nèi)連接成環(huán)形。根據(jù)已知的靶DNA序列按向外延伸的要求設(shè)計(jì)一對(duì)向外引物，保證被擴(kuò)增的是位于靶DNA區(qū)段兩側(cè)的未知DNA序列。反向PCR的基本操作程序。波紋線表示靶DNA區(qū)段，箭頭表示限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，分別用方框表示靶DNA區(qū)段的左側(cè)和右側(cè)序列。用一種在靶序列上沒(méi)有酶切位點(diǎn)的核酸限制性內(nèi)切酶消化DNA；產(chǎn)生大小不同的線性DNA片段群體，其中靶DNA區(qū)段的DNA分子長(zhǎng)度不超過(guò)23kb，經(jīng)連接后重新環(huán)化；按靶序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物與互補(bǔ)序列退火結(jié)合，其延伸方向如箭頭所指；經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的主要是線性雙鏈DNA分子，它是由左側(cè)序列和右側(cè)序列首尾連接而成，其接點(diǎn)是所用限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)。5. 2.

16、4 實(shí)時(shí)定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由于PCR敏感性高（在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將特異的一段DNA序列擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)倍以上 ），擴(kuò)增產(chǎn)物總量變異系數(shù)大，定量不準(zhǔn)確。90年代末期出現(xiàn)了Q-PCR，利用熒光檢測(cè)PCR儀繪制DNA擴(kuò)增過(guò)程中的累積速率動(dòng)態(tài)變化圖，基本消除在測(cè)定終端產(chǎn)物豐度時(shí)變異系數(shù)較大的問(wèn)題?；旌显赑CR反應(yīng)液中的熒光探針只有與大片段DNA結(jié)合后，才能夠被激發(fā)出熒光。隨著新合成DNA片段的增加，由于結(jié)合到DNA上的熒光探針增加，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光相應(yīng)增加。非序列特異性熒光染料SYBR Green I , 激發(fā)光波長(zhǎng)520nm。 SYBR Green

17、I作探針的實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程示意圖（熒光強(qiáng)度反映PCR產(chǎn)物的量）Han P., Li Q., and Zhu Y.X. (2008) The Plant Cell 20:1482-1493. （野生型擬南芥）（野生型擬南芥的突變體）P169為確保熒光檢測(cè)的確實(shí)是靶DNA，又設(shè)計(jì)了僅能與目的DNA特異結(jié)合的熒光探針。TaqMan探針是一段與靶DNA序列中間部位結(jié)合的單鏈DNA，長(zhǎng)50bp-150bp，該DNA的5和3端帶有短波長(zhǎng)和長(zhǎng)波長(zhǎng)兩個(gè)不同熒光基團(tuán)，由于彼此距離靠近，在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）作用下發(fā)生熒光淬滅，因而檢測(cè)不到熒光。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，TaqMan 探針結(jié)合到目的DN

18、A序列上，并且會(huì)被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐個(gè)切除而降解。切下來(lái)的熒光基團(tuán)解除了熒光淬滅的束縛，會(huì)在激發(fā)光下發(fā)出熒光，因此，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度直接反映了所擴(kuò)增靶DNA的總量。TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù) TaqMan探針具有三個(gè)要素。（見(jiàn)P168）在此狀態(tài)下兩個(gè)熒光基團(tuán)十分接近，不發(fā)熒光。Ct值是產(chǎn)物熒光強(qiáng)度首次超過(guò)設(shè)定閾值時(shí)，PCR反應(yīng)所需的循環(huán)數(shù)。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以確定樣品中待檢測(cè)靶DNA的絕對(duì)含量。 用實(shí)時(shí)定量PCR法分析未知樣品靶基因的絕對(duì)表達(dá)量。（P169）5. 2. 5 基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建把某種生物的基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆

19、。匯集包含基因組中所有DNA序列的克?。ɡ碚撋厦總€(gè)序列至少有一個(gè)代表），這樣的克隆片段的總匯，稱為基因組DNA文庫(kù)。 Clark和Carbon于1975年提出公式：N=ln(1-p) / ln(1-f)式中：N表示一個(gè)基因組文庫(kù)所應(yīng)該包含的重組克隆數(shù)目；p表示所期望的靶基因在文庫(kù)中出現(xiàn)的概率；f表示重組克隆平均插入片段的長(zhǎng)度與基因組DNA總長(zhǎng)的比值。為獲得整個(gè)基因簇或一個(gè)基因及其兩翼延伸序列，基因組文庫(kù)中的DNA片段常大于20kb。以人為例，其基因組大小為3109bp若p=99%，平均插入片段大小為20kb，則N=6.9105。構(gòu)建基因組文庫(kù)最常用的是噬菌體載體（克隆能力約1520kb）和限制

20、性內(nèi)切酶部分消化法。例如用識(shí)別4個(gè)核苷酸的核酸限制性內(nèi)切酶Sau3A，與BamHI是一對(duì)同尾酶消化DNA，由Sau3A酶切產(chǎn)生的DNA片段可插入到經(jīng)BamHI消化的噬菌體載體上。用Sau3A限制性核酸內(nèi)切酶消化真核生物基因組DNA并利用噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的過(guò)程圖示。 噬菌體作為克隆載體此外，還有很多大容量克隆載體，如柯斯質(zhì)粒、細(xì)菌人工染色體（BAC）、P1源人工染色體（PAC）、酵母人工染色體（YAC）等都可用于基因組文庫(kù)的構(gòu)建。它們的優(yōu)點(diǎn)是可以插入更大片段DNA，但是穩(wěn)定性一般較差，在大量復(fù)制的過(guò)程中容易出現(xiàn)缺失現(xiàn)象。操作也相對(duì)較困難。5. 3 RNA基本操作技術(shù)真核生物基因組DNA龐

21、大，有大量重復(fù)序列，很難直接分離得到靶基因片段。而cDNA來(lái)自反轉(zhuǎn)錄的mRNA，無(wú)冗余序列，通過(guò)篩選cDNA文庫(kù)，可較快地分離到相關(guān)基因。細(xì)胞中的總RNA包括mRNA，rRNA ，tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一個(gè)典型的動(dòng)物細(xì)胞約含10-5g RNA，其中：80%-85%為rRNA15%-20%為tRNA及sRNAmRNA約占總RNA 的1%-5%rRNA分子具有確定的大小和核苷酸序列，特別是28S和18S特征性條帶是電泳鑒定總RNA純度和完整性的重要參數(shù)。Li Q et al. (2006) J. Integr. Plant Biol. 48: 114-120.圖5-14 PolyA

22、Ttract mRNA的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖。RNA的濃度和純度可以通過(guò)測(cè)定其OD260和OD280 來(lái)判斷。OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40g/ml，而OD260/OD280的比值如果在1.8-2.0之間，表示所提取的RNA純度較好，如果樣品中有蛋白質(zhì)或酚污染，則OD260/ OD280的比值將明顯低于1.8。由于RNA分子敏感脆弱，在自然狀態(tài)下難以被擴(kuò)增，為了研究mRNA所包含的功能基因信息，一般將其反轉(zhuǎn)錄成穩(wěn)定的DNA雙螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我復(fù)制的載體中。 圖5-15 cDNA合成過(guò)程示意圖。圖5-16 定向cDNA 合成及分子修飾因?yàn)榻^大多數(shù)

23、大腸桿菌細(xì)胞都會(huì)切除帶有5-甲基胞嘧啶的外源DNA，所以實(shí)驗(yàn)中常選用mcrA- mcrB-菌株以防止cDNA被降解。 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA的長(zhǎng)度一般在0.5-8 kb之間，質(zhì)粒載體和噬菌體類(lèi)載體都能滿足要求。cDNA文庫(kù)常用Uni-zap XR（一種噬菌粒載體）做載體，它具備噬菌體的高效性和質(zhì)粒載體系統(tǒng)利用藍(lán)白斑篩選的便利，可容納0-10 kb DNA插入片段，含有pBluescript載體的全部序列。重組后可通過(guò)體內(nèi)剪切反應(yīng)（In Vivo Excision）將cDNA插入片段轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒系統(tǒng)中進(jìn)行篩選、克隆和序列分析。 基因文庫(kù)的篩選基因文庫(kù)的篩選是指通過(guò)某種特殊方法從基因文庫(kù)中鑒定出

24、含有所需重組DNA分子的特定克隆的過(guò)程。篩選的方法有很多種，如核酸雜交法，PCR篩選法和免疫篩選法等。1、核酸雜交法： 核酸雜交法以其廣泛的適用性和快速性成為基因文庫(kù)篩選中最常用的一種方法，用放射性標(biāo)記的特異DNA探針適用于高密度的菌落雜交篩選。 將待篩選菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，適當(dāng)溫育。同時(shí)保留原來(lái)的菌落平板作對(duì)照。取出已經(jīng)長(zhǎng)有菌落的膜，用堿液處理，使菌落發(fā)生裂解，DNA隨之變性。用蛋白酶K處理硝酸纖維素膜去除蛋白質(zhì)，形成菌落DNA的印跡。80烘烤濾膜，將DNA固定在膜上。將濾膜與放射性標(biāo)記的DNA或RNA探針雜交，通過(guò)放射性自顯影顯示雜交結(jié)果。通過(guò)對(duì)應(yīng)于平板上的位置找到相應(yīng)克隆。圖 5-

25、17 通過(guò)核酸雜交篩選目的克隆流程圖2、PCR篩選法將整個(gè)文庫(kù)（以質(zhì)粒的形式或者細(xì)菌的形式均可）保存在多孔培養(yǎng)板上，用設(shè)計(jì)好的目的基因探針對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行PCR篩選，鑒定出陽(yáng)性的孔，把每個(gè)陽(yáng)性孔中的克隆再稀釋到次級(jí)多孔板中進(jìn)行PCR篩選。重復(fù)以上程序，直到鑒定出與目的基因?qū)?yīng)的單個(gè)克隆為止。3、免疫篩選法該法僅適用于對(duì)表達(dá)文庫(kù)的篩選。若實(shí)驗(yàn)中靶基因的序列完全未知但是有針對(duì)該基因產(chǎn)物的特異性抗體，就可以采用免疫篩選法。圖5-18 噬菌體表達(dá)文庫(kù)的免疫化學(xué)篩選法示意圖 5. 4 SNP的理論與應(yīng)用SNP是Single Nucleotide Polymorphism的縮寫(xiě)，即單核苷酸多態(tài)性，指基因組DN

26、A序列中由于單個(gè)核苷酸（A，T，C和G）的突變而引起的多態(tài)性。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個(gè)堿基的變異，這種變異可由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說(shuō)的SNP并不包括后兩種情況。5. 4. 1 SNP概述科學(xué)上把染色體DNA同一位置上的每個(gè)堿基類(lèi)型叫做一個(gè)等位位點(diǎn)。SNP是基因組中最簡(jiǎn)單最常見(jiàn)的多態(tài)性形式，具有很高的遺傳穩(wěn)定性。SNP檢測(cè)和分析技術(shù)已經(jīng)成為繼限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）之后的第三代遺傳標(biāo)記。染色體上共同遺傳的SNP組合圖中SNP1和SNP2在同一條染色體上而且距離很近

27、，SNP1有等位位點(diǎn)A和G，SNP2有等位位點(diǎn)G和T。因此，染色體對(duì)有兩種可能的SNP組合。 單倍型基因型外顯子IV內(nèi)含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米globulin1不同單倍型和基因型之間的多態(tài)性比較 據(jù)估計(jì)，人類(lèi)DNA中每300-1000個(gè)堿基對(duì)就有一個(gè)SNP，因此，一個(gè)人類(lèi)個(gè)體大約攜帶300萬(wàn)-1000萬(wàn)個(gè)SNPs。位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)被稱作單倍型（haplotype），相鄰SNPs的等位位點(diǎn)傾向于以一個(gè)整體遺

28、傳給后代。 根據(jù)SNP在基因組中的分布位置分為編碼區(qū)SNP（cSNP），調(diào)控區(qū)SNP（pSNP）和非編碼區(qū)SNP（rSNP）三類(lèi)。編碼區(qū)內(nèi)的變異率僅占周?chē)蛄械?/5，cSNP的總量顯著少于其它兩類(lèi)SNPs。cSNP分為同義cSNP（synonymous cSNP），編碼序列的改變不影響所翻譯的氨基酸序列）和非同義cSNP（non-synonymous cSNP），堿基序列的改變使氨基酸序列發(fā)生改變，可能影響蛋白質(zhì)的功能。 5. 4. 2 SNP的檢測(cè)技術(shù)通過(guò)DNA測(cè)序法獲得新的SNP?；蚍中停╣enotyping）是指利用數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的SNP進(jìn)行特定人群的序列和發(fā)生頻率的研究，主要包括基因

29、芯片技術(shù)、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)（molecular beacons）技術(shù)和焦磷酸測(cè)序法（pyrosequencing）等。1基因芯片技術(shù)通過(guò)優(yōu)化芯片雜交程序，使探針只與完全互補(bǔ)的序列雜交而不與含有單個(gè)錯(cuò)配堿基的序列雜交。優(yōu)點(diǎn)是高通量，一次可對(duì)多個(gè)SNP進(jìn)行規(guī)模性篩選，被檢起始材料也很少，操作步驟簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)是芯片設(shè)計(jì)成本高。而且，由于DNA樣品的復(fù)雜性，有些SNP不能被檢測(cè)。2Taqman技術(shù)PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入2種不同熒光標(biāo)記的分別與兩個(gè)等位基因配對(duì)的探針。隨著PCR的進(jìn)行，與模板完全配對(duì)的探針逐步被Taq DNA聚合酶的53外切活性所切割，熒光基團(tuán)與3端的淬滅基團(tuán)分離，熒光基團(tuán)被激活。

30、不完全配對(duì)的探針（代表另一種等位基因）不能被有效切割，供體熒光基團(tuán)依然被淬滅。3分子信標(biāo)（molecular beacon）技術(shù)是一種呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光標(biāo)記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結(jié)合，莖干區(qū)由5-8個(gè)堿基對(duì)組成，5端帶有熒光發(fā)生基團(tuán)，3端帶有熒光淬滅基團(tuán)。自由狀態(tài)時(shí)，分子信標(biāo)呈發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，熒光幾乎完全淬滅。與靶分子相結(jié)合時(shí)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)之間的距離增大，分子信標(biāo)的熒光恢復(fù)。Taqman技術(shù)（上）及分子信標(biāo)技術(shù)（下）原理示意圖。在多細(xì)胞的高等生物個(gè)體水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物種的兩個(gè)或數(shù)個(gè)個(gè)體組成的群體。從同一受精卵分裂而來(lái)的單卵雙生子（monozygotic twin

31、s）便是屬于同一克隆。5. 5 基因克?。╟lone）技術(shù)在細(xì)胞水平上，克隆一詞是指由同一個(gè)祖細(xì)胞（progenitor cell）分裂而來(lái)的一群帶有完全相同遺傳物質(zhì)的子細(xì)胞。在分子生物學(xué)上，人們把將外源DNA插入具有復(fù)制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復(fù)制這種過(guò)程稱為克隆。 5. 5. 1 RACE技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends) 是由Frohman等(1988)發(fā)明的一項(xiàng)技術(shù)。是通過(guò)PCR進(jìn)行cDNA末端快速克隆的技術(shù)，無(wú)須建立cDNA文庫(kù)，可以在很短的時(shí)間內(nèi)獲得有利用價(jià)值的信息。RACE是基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)上由已知的一段cDNA片段，通過(guò)往兩

32、端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3端和5端的方法。 一般分5 RACE和3RACE兩種：3-RACE較簡(jiǎn)單，首先將mRNA或總RNA用PolyT引物反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)一般基因具有polyA尾巴的特點(diǎn)，選用特異引物(根據(jù)已知序列設(shè)計(jì))和PolyT引物PCR即可。5-RACE相對(duì)較難，目前流行幾種5-RACE。其一為加接頭(傳統(tǒng))，根據(jù)接頭引物和自己設(shè)計(jì)特異引物PCR，可以設(shè)計(jì)巢式PCR二次擴(kuò)增。另外，有利用反向PCR技術(shù)，連接成環(huán)再PCR。 巢式PCR（nest PCR）：是指利用兩套PCR引物（巢式引物）進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，此產(chǎn)物在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。

33、 由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測(cè)的敏感性；又有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。 一般應(yīng)用于動(dòng)物方面。如：病毒，梅毒螺旋體，HIV，腫瘤基因等 。5 RACE3 RACE 利用mRNA的3末端的poly（A）尾巴作為一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA；再用RNase水解模板鏈；然后用一個(gè)基因特異引物GSP作為上游引物，用一個(gè)含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer）作為下游引物，以cDN

34、A第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3 末端的DNA片段擴(kuò)增出來(lái)。 RACE的另一種代表方法是自我連接法（Self-Ligation method）1、反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)2、Hybrid RNA的分解 3、單鏈cDNA的自身連接 4、PCR擴(kuò)增5未知區(qū)域 5、目的DNA片段的切割回收6、DNA序列測(cè)定 5. 5. 2 cDNA差示分析法(RDA, Representation Difference Analysis)充分發(fā)揮了PCR能以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈DNA模板，而僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板的特性，通過(guò)降低cDNA群體復(fù)雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴(kuò)增目的基因片段。PCR產(chǎn)物的

35、特異性和所得的cDNA片段純度均高。因?yàn)門(mén)ester和Driver在接受差示分析前均經(jīng)一個(gè)4堿基切割酶處理，形成平均長(zhǎng)度256bp的代表群，保證絕大部分遺傳信息能被擴(kuò)增。5. 5. 3 Gateway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)Gateway技術(shù)利用噬菌體進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNA片段重組，實(shí)現(xiàn)了不需要傳統(tǒng)的酶切聯(lián)接過(guò)程的基因快速克隆和載體間平行轉(zhuǎn)移。Gateway大規(guī)?？寺〔呗訲OPO反應(yīng):將目的基因PCR產(chǎn)物連入Entry載體。載體上的CCCTT被拓?fù)洚悩?gòu)酶所識(shí)別，通過(guò)與切口處的磷酸基團(tuán)形成共價(jià)鍵，將該酶偶聯(lián)在載體上。5GTGG粘性末端攻擊PCR產(chǎn)物的互補(bǔ)性末端并與接頭序列CACC退火，使PCR產(chǎn)物以正確方向

36、連入Entry載體。（見(jiàn)圖5-24a P186） LR反應(yīng)：將目的片段從Entry 載體中重組入表達(dá)載體。Entry載體上基因兩端具有attL1和attL2位點(diǎn)，目的載體上含有attR1和attR2位點(diǎn)，在重組蛋白的作用下發(fā)生定向重組，形成新的位點(diǎn)attB1和attB2，將目的基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中。（見(jiàn)圖5-24b P186）5. 5. 4 基因的圖位克隆法（Map-based cloning）所有具有某種表現(xiàn)型的基因都可以通過(guò)該方法克隆得到。通過(guò)構(gòu)建遺傳連鎖圖，將目的基因定位到某個(gè)染色體的特定位點(diǎn)，并在其兩側(cè)確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標(biāo)記。通過(guò)對(duì)不同的生態(tài)型及限制性內(nèi)切酶和雜交探針

37、的分析，找出與目的基因距離最近的分子標(biāo)記，通過(guò)染色體步移法將位于這兩個(gè)標(biāo)記之間的基因片段克隆并分離出來(lái)，根據(jù)基因功能互作原理鑒定目的基因。染色體步移法克隆基因示意圖在RFLP作圖中，連鎖距離是根據(jù)重組率來(lái)計(jì)算的，1cM（厘摩）相當(dāng)于1%的重組率。人類(lèi)基因組中，1cM1000kb；擬南芥菜中，1cM290kb；小麥中，1cM3500kb。 用圖位克隆法獲得水稻脆桿基因BC1 將BCl定位于水稻3號(hào)染色體（Chr3）分子標(biāo)記C524a和RM16之間；B. 覆蓋BCl位點(diǎn)的BAC大片段。C. BCl位點(diǎn)的精細(xì)定位。BCl位點(diǎn)被定位于分子標(biāo)記P2和P4之間與P3共分離。D. BCl基因結(jié)構(gòu)。紅色為編碼區(qū)，白色為5和3非翻譯區(qū)，黑色線段為內(nèi)含子。bcl-1和bcl-2表示兩個(gè)突變位點(diǎn)。 Li, Y., Qian, Q., Zhou, Y., Yan, M., Sun, L., Zhang, M., Fu, Z., Wang, Y., Han, B., Pang, X., Chen, M., and Li, J. (2003). BRITTLE CULM1, which