尿素-SDS-PAGE測(cè)定小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量方法的建立 (共6頁(yè))

1、尿素(nio s)-SDS測(cè)定(cdng)小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量方法的建立王麗榮，程福亮，陳雷(chn li)，谷?。ㄉ綎|寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司， 山東 泰安 271000）摘要：目的 建立一種簡(jiǎn)易快速測(cè)定小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量的SDS電泳方法。方法通過(guò)改進(jìn)分離膠交聯(lián)度為6%，丙烯酰胺總濃度為15%，并加入6%的尿素，對(duì)所測(cè)得的多肽相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果 得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)r2達(dá)到0.9938，測(cè)得條帶的相對(duì)分子質(zhì)量分別為9.2129KD。結(jié)論 本研究建立的方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，且小分子多肽成像清晰，是一種具有很高實(shí)用價(jià)值的測(cè)定方法。關(guān)鍵字：SDS；小分子多肽；尿素；

2、相對(duì)分子質(zhì)量；轉(zhuǎn)移因子口服液Development of Urea-SDSMethod for the relative molecular mass of small molecular peptideWANG LI-Rong CHENG Fu-Liang CHEN Lei GU Wei(Shandong BaoLai-LeeLai bioengineering Co. Ltd, Tai an, Shandong, 271000)Abstract: Objective In order to establish a simple and rapid measuring method SDSo

3、f the relative molecular mass of small molecular peptide. Method by improving the separation gel, the crosslinking degree was 6%, total acrylamide concentration was 15%, and 6% of urea was added, the relative molecular mass peptides was obtained by linear regression analysis. Results the linear corr

4、elation coefficient of the standard curve is 0.9938, and the relative molecular mass of the target protein bands was measured to be 9.2129 KD. Conclusions this study established the method of simple operation, short time consuming, and clear imaging, so, as a kind of measuring method of the relative

5、 molecular mass peptides of small molecular peptide, it has a high practical value.Key words: SDS; small molecular peptide; relative molecular mass; urea蛋白質(zhì)的生化分析和基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化中，難免會(huì)需要分離某種或某些小分子蛋白質(zhì)成分。近年來(lái)，用電泳法測(cè)定分子量在幾千道爾頓小分子多肽分子量的研究報(bào)道較少。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)方法用作蛋白質(zhì)大分子量測(cè)定的技術(shù)最早由Shapiro等人于20世紀(jì)60年代建立1,2，之后Weber等

6、人進(jìn)行了改進(jìn)，顯示出了該方法在分離鑒定和純化蛋白質(zhì)方面的優(yōu)越性3。20世紀(jì)80年代初，Schabgger等4應(yīng)用脲分離蛋白質(zhì)復(fù)合體亞單位的11種蛋白質(zhì)，進(jìn)行了系統(tǒng)地研究和摸索，能夠分離較大相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和基因工程藥物的大量涌現(xiàn)，具有高生物活性的小分子多肽的分離、純化和鑒定已顯得尤為突出，而小分子多肽分子量的測(cè)定，目前多采用Tricine-SDS系統(tǒng)5,6,7，但系統(tǒng)中的Tricine價(jià)格昂貴，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，且由于小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量小，易受電泳緩沖系統(tǒng)、凝膠濃度、電泳時(shí)間、染色和脫色等的影響，極易引起條帶擴(kuò)散、不易著色，使分辨率降低，因而直接影響多肽分子量

7、的測(cè)定?，F(xiàn)有多肽分子量的三層膠電泳測(cè)定方法操作復(fù)雜，且結(jié)果也不理想。報(bào)道也有張曉楠等8采用尿素SDS法快速測(cè)定了Mr為250017000的多肽，郭燕捷等9和石繼紅等10也分別對(duì)小分子肽類進(jìn)行了測(cè)定。Kyte等11發(fā)現(xiàn)由25250個(gè)殘基組成的多肽可用含有8mol/ L尿素和0.1%SDS的20%PAGE來(lái)分離。轉(zhuǎn)移因子(TF)屬于(shy)淋巴因子，可特異或非特異性地調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)、增強(qiáng)其細(xì)胞免疫收稿日期(rq)作者簡(jiǎn)介王麗榮(1985-）,女,漢，碩士(shush)研究生，山東萊陽(yáng)人，主要研究方向：禽病學(xué)、中藥發(fā)酵。和骨髓造血功能，已在臨床應(yīng)用多年，在原發(fā)性免疫缺陷病或慢性病毒感染疾病中作為

8、免疫治療藥物作用，目前已得到肯定，特別是對(duì)病毒性上呼吸道感染治療取得良好效果12。主要成份為小分子多肽和核苷酸，為免疫調(diào)節(jié)劑。本研究根據(jù)小分子多肽條帶分辨率高、操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間少、低成本等原則，旨在改進(jìn)低分子量蛋白轉(zhuǎn)移因子的尿素-SDS方法，并為小分子多肽相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定提供有效方法。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 垂直電泳儀及其配件、Power PAC200穩(wěn)壓穩(wěn)流電源，Bio-Rad公司；GDS28000凝膠圖像處理系統(tǒng)，英國(guó)UVP公司。低分子量蛋白Marker購(gòu)于北京天恩澤基因科技有限公司；小分子多肽樣品由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存。1.2試劑及配制（1）30%丙烯酰

9、胺：稱取29g丙烯酰胺和1g N, N-亞甲雙丙烯酰胺溶于80ml超純水中，然后定容至100ml。0.45um濾膜過(guò)濾后，測(cè)PH值。（2）10%SDS：稱取10gSDS 溶于80ml超純水中，然后定容至100ml。（3）1.5M Tris-CL：稱取18.171g Tris-Base 溶于80ml超純水中，用濃鹽酸調(diào)整PH值至8.8，然后定容至100ml。（4）0.5M Tris-CL：稱取6.057g Tris-Base 溶于80ml超純水中，用濃鹽酸調(diào)整PH值至6.8，然后定容至100ml。（5）10% APS： 稱取2.282g過(guò)硫酸銨溶于8ml超純水中，定容至10ml。（6）Runni

10、ng Buffer：稱取3.03克 Tris-Base，18.8g Glycine，5克SDS溶解定容至1000ml。（7）1SDS上樣緩沖液： 0.05M Tris-HCL，100mM -巰基乙醇，2% (m/V)SDS，0.1%(m/V) 溴酚藍(lán)，10%(V/V)甘油（8）染色液：0.1% (m/V)考馬斯亮藍(lán)R-250，25%(V/V)甘油，10%(V/V)冰醋酸（9）脫色液：10%(V/V)醋酸，5%(V/V)乙醇 量取100ml醋酸、50ml乙醇溶于800ml超純水中，定容至1000ml。1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備及樣品處理：用自來(lái)水清洗燒杯、電泳儀及其配件，然后四蒸水沖洗

11、干凈，晾干備用，玻璃板先用自來(lái)水清洗，擦干，酒精棉球擦干，自然晾干備用。1.3.2 配膠：如表一所示，制15分離膠。制備方法如下：在燒杯中依次加入2.3ml超純水、30%丙烯酰胺5ml、1.5M Tris-CL 2.5ml、10%SDS 0.1ml、10% APS 0.1ml，最后添加TEMED0.004ml。加入TEMED混合均勻后，立即用吸管加入膠板中(倒膠時(shí)，以梳子齒端為參照，預(yù)留1cm濃縮膠空間)。然后，膠上加滿蒸餾水封閉，以防蒸發(fā)。分離膠室溫30min左右即可完全凝固。5%濃縮膠：燒杯中依次加入合適量的超純水2.1ml、30%丙烯酰胺0.5ml、0.5M Tris-CL0.38ml、

12、10%SDS0.03ml、10% APS0.03ml，先將分離膠上的超純水倒掉，并用濾紙小心吸干殘留水分，此時(shí)再將TEMED0.003ml加入燒杯中，混合均勻立即用移液槍滴加到分離膠上，插入合適的梳子。積層膠20min左右可完全凝固。表1：尿素(nio s)-SDS法制膠配方(pi fng)成分分離膠 15濃縮膠 5超純水(ml)2.32.130丙烯酰胺(ml)5.00.51.5M Tris-CL(ml）2.50.5M Tris-CL(ml)0.3810%SDS(ml)0.10.0310%APS(4)(ml)0.10.03TEMED(4) (ml)0.0040.003尿素(g)3.61.3.3

13、 加樣：小心拔掉梳子(sh zi)，組裝好電泳儀。然后倒入1Running Buffer。將蛋白Marker和處理好的樣品按順序加入膠孔，并做好記錄。1.3.4跑膠：加樣完畢即可跑膠，可固定電壓進(jìn)行跑膠。Bio-Rad電泳儀可固定在200V， 君意電泳儀固定在150V，當(dāng)染帶剛剛跑出膠板時(shí)，跑膠完成。1.3.5卸膠：小心拆卸膠板，用分離器小心將兩層玻璃板分離，切去積層膠。1.3.6染色：將分離膠放于染色盒中，倒入20ml染色液，然后一起放在搖床上，慢慢搖動(dòng)。染色20min即可。1.3.7脫色：將分離膠取出，放于脫色盒，倒入30ml脫色液，然后放在搖床上慢慢搖動(dòng)過(guò)夜，或隨時(shí)觀察，直至分離膠除有蛋

14、白的地方為藍(lán)色其余部分變?yōu)闊o(wú)色即可。1.3.8 小分子多肽樣品中蛋白遷移率的測(cè)定及其分子量的計(jì)算用倍率計(jì)讀出照片上各樣品色帶中心與溴酚藍(lán)前沿的距離，按標(biāo)記變化比率換算出實(shí)際尺寸進(jìn)行計(jì)算。電泳遷移率為Rf，即樣品遷移距離與溴酚藍(lán)遷移距離的比值。以標(biāo)準(zhǔn)組多肽的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，經(jīng)線性回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)未知樣品的遷移率在曲線上查出其對(duì)應(yīng)的分子量。2 結(jié)果與分析1 2 M97.4KD66.2KD43.0KD31.0KD20.1KD14.4KD2.1 小分子多肽樣品的尿素-SDS結(jié)果圖1 小分子多肽的尿素-SDS蛋白電泳結(jié)果1:陰性對(duì)照；2：小分子蛋白樣品結(jié)

15、果；M：低分子量蛋白Marker由圖可知(k zh)，小分子(fnz)蛋白樣品中蛋白濃度較高，SDS電泳結(jié)果顯示，蛋白大小(dxio)處于14.4KD以下，樣品純度較高，無(wú)其他蛋白雜帶，陰性對(duì)照無(wú)特定條帶。M A1 A2 A3 A4 A597.4KD43.0KD31.0KD20.1KD14.4KD66.2KD2.2 不同稀釋濃度小分子多肽樣品的尿素-SDS結(jié)果圖2：小分子多肽樣品不同稀釋濃度的尿素-SDS結(jié)果A1、A2、A3、A4和A5分別為依次為小分子多肽樣品10倍稀釋加樣量電泳結(jié)果；M：低分子量蛋白Marker通過(guò)10倍稀釋小分子多肽樣品，進(jìn)行尿素-SDS電泳，圖2顯示獲得了較好的結(jié)果，從

16、A1到A5，小分子蛋白樣品濃度逐漸降低，呈現(xiàn)較好的規(guī)律變化。2.3 尿素-SDS中蛋白條帶遷移率及分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項(xiàng)目數(shù)值Mr97.4KD66.2KD43.0KD31.0KD20.1KD14.4KDRf048.1111420Y21.7923921.602061.4771211.3802111.146128表1 尿素(nio s)-SDS中蛋白(dnbi)條帶遷移率的測(cè)定(cdng) 注：A為標(biāo)準(zhǔn)品各條帶對(duì)應(yīng)的分子量；Rf為標(biāo)準(zhǔn)品各條帶的遷移率測(cè)定值；Y為遷移率的對(duì)數(shù)值圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由表1中的數(shù)據(jù)繪制完成可進(jìn)行測(cè)定小分子蛋白分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，其中相關(guān)系數(shù)R20.99，表明建

17、立的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來(lái)測(cè)定小分子多肽的分子量。2.4 小分子多肽樣品中蛋白遷移率的測(cè)定及其分子量的計(jì)算測(cè)定尿素-SDS電泳中小分子多肽樣品的遷移率為23.5，將此數(shù)值帶入到分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得到待測(cè)小分子多肽樣品的分子量為9.212977277KD。3 討論隨著生物活性多肽物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和多肽類藥物的研制，小分子多肽電泳變得越來(lái)越重要，已成為生物活性物質(zhì)純化分析過(guò)程中不可缺少、經(jīng)常使用的快速鑒定方法。凝膠電泳以其操作簡(jiǎn)單、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)Mr的測(cè)定。蛋白質(zhì)Mr的測(cè)定通常采用非連續(xù)的SDS緩沖系統(tǒng)，緩沖液采用Tris-HCl；而多肽Mr的測(cè)定，采用Tris-Tricine緩

18、沖液，可使小Mr多肽在濃縮膠中有效地濃縮，從而提高分辨率。SDS的有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，其孔徑隨著雙丙烯酰胺：丙烯酰胺比率的增加而減小，M r低于10000的小分子肽，即使用較高濃度的聚丙烯酰胺凝膠的SDS也不能完全分離。本研究建立的雙層膠尿素-SDS測(cè)定小分子多肽Mr的方法有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 操作簡(jiǎn)便。將常規(guī)的3層膠改為2層膠(分離膠和濃縮膠)；濃縮膠與分離膠采用了同一緩沖體系，簡(jiǎn)化了操作步驟，減少了由于凝膠制備而引起的諸多影響電泳的因素；(2)分辨率高。將3層膠改為2層膠后，分離膠的有效長(zhǎng)度增加，可使單位凝膠長(zhǎng)度下容納的電泳條帶數(shù)增加，從而使分辨率提高；(3)成本低。

19、替代了昂貴的Tris-Tricine緩沖系統(tǒng)，電極緩沖液可以重復(fù)利用；(4)電泳時(shí)間短。由原來(lái)56 h 縮短為2.5h ，達(dá)到了快速檢測(cè)目的。我們用含6 mo lL 1尿素的SDS方法，不需銀染而直接用考馬斯亮藍(lán)R2250 染色1.52 h，即可把標(biāo)準(zhǔn)品中的條帶顯示清楚，且簡(jiǎn)單方便，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)多肽M r的對(duì)數(shù)與遷移率呈良好的線性關(guān)系, 相關(guān)系數(shù)r2達(dá)到0.9938。該方法的建立為小分子多肽分子量的估算提供了一種較好方法。參考文獻(xiàn)1 張龍翔.生化實(shí)驗(yàn)方法(fngf)和技術(shù)M.北京(bi jn):教育(jioy)出版社,1982.2 郭曉君.SDS電泳技術(shù)的實(shí)驗(yàn)考慮及最新進(jìn)展J.生物化學(xué)與生物物理

20、進(jìn)展,1991,18 (1):32-37.3 Cleveland DW, Fischer SG, Kirschner MW etal. Peptide mapping by limited proteolysis in so- dium dodecyl sulfate and analysis by gel electrophoresis J.JBio Chem,1977,252 (3):1102- 1106.4 Schabgger H, Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 KDaJ. Anal Biochem.1987,166 (2):368-379.5鄒毅,祝沛平,趙曉麗等.用一種改進(jìn)的電泳方法測(cè)定抗凍蛋白的分子量J.生物技術(shù),1999, 9 (4):36-391.6楊聯(lián)萍,孔祥平,易學(xué)瑞.SDS電泳對(duì)分子多肽的分析J.生物工程進(jìn)展,1998,18 (6): 49-511.7Schgger H ,Jagow G.Tricine-sodium dodecyl s