實(shí)驗(yàn)一植物組織總DNA的提取及DNA的濃度測(cè)定（4學(xué)時(shí)）ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)十一 植物組織總DNA的提取及DNA的濃度測(cè)定 掌握用CTAB法提取植物總DNA的方法和根本原理。學(xué)習(xí)利用紫外分光光度法測(cè)定DNA溶液的濃度。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理 通常采用機(jī)械研磨的方法破碎植物的組織和細(xì)胞，由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對(duì)DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需參與抗氧化劑或強(qiáng)復(fù)原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，資料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。 CTAB, SDS等離子型外表活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。 再參與苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白量變性，并使抽提液分相，因核酸(

2、DNA、RNA)水溶性很強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中參與異丙醇或乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于雙蒸水或TE溶液中，即得植物總DNA溶液。之后可參與RNA酶降解其中的RNA，再用氯仿除去RNA酶，得到較純的DNA制劑。 DNA的吸收光譜峰在260 nm處，據(jù)計(jì)算，測(cè)定此波長(zhǎng)下DNA溶液的OD值，當(dāng)OD260=1時(shí)，雙鏈DNA含量約為50 g/ml，據(jù)此可用紫外分光光度計(jì)測(cè)定溶液中DNA含量。 由于蛋白質(zhì)的吸收峰在280 nm處，在測(cè)定DNA含量時(shí)，還常計(jì)算OD260/OD280之值，如該值為1.8-2.0時(shí)，以為已到達(dá)較高的純度，如低于此值，闡明其內(nèi)含雜質(zhì)較多

3、，能夠影響酶切反響。水稻種類的幼苗葉片三、實(shí)驗(yàn)資料四、實(shí)驗(yàn)器具、藥品試劑 水浴鍋，研缽，微量移液器，槍頭，離心管，臺(tái)式離心機(jī)，液氮，恒溫箱，標(biāo)簽紙，紫外分光光度計(jì)，磁力攪拌機(jī)，剪刀等。 2% CTAB抽提緩沖溶液，異丙醇, 氯仿-異戊醇等 CTAB法流程圖植物資料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解枯燥溶解離心洗滌異丙醇沉淀DNA溶液五、實(shí)驗(yàn)方法(1) 2%CTAB抽提緩沖液在65水浴中預(yù)熱。(2)取少量葉片約0.2 g置于研缽中，用液氮磨至粉狀；(3) 在液氮揮發(fā)將盡而植物組織尚未解凍時(shí)迅即參與700 l的2%CTAB抽提緩沖液，悄然攪動(dòng)；(4) 將磨碎液分倒入1.5 ml的滅菌離心管中，磨碎

4、液的高度約占管的三分之二；(5) 置于65的水浴槽或恒溫箱中，每隔10 min悄然搖動(dòng)，40 min后取出；1. DNA的提取 6冷卻2 min后，參與氯仿-異戊醇24：1至滿管，猛烈振蕩23 min，使兩者混合均勻；7放入離心機(jī)中10 000 rpm離心10 min，與此同時(shí)，將600 l的異丙醇參與另一新的滅菌離心管中；8 用移液器悄然地汲取上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管漸漸上下?lián)u動(dòng)30 sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；910000 rpm離心1 min后，立刻倒掉液體，留意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；1060 sec后，直立離心管，

5、參與720 l的75%乙醇及80 l 5 M的醋酸鈉，悄然轉(zhuǎn)動(dòng)，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；11放置30 min，使DNA塊狀物的不純物溶解；12 10000 rpm離心1 min后，倒掉液體，再參與800 l 75%的乙醇，將DNA再洗 30 min；1310000 rpm離心30 sec后，立刻倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，枯燥DNA自然風(fēng)干或用風(fēng)筒吹干；14參與50 l 0.5 TE(含RNase)緩沖液，使DNA溶解，置于37恒溫箱約15 h，使RNA消解；15置于-20保管、備用。稱取樣品，液氮研磨，參與預(yù)熱的(65 ) CTA

6、B及-巰基乙醇 保溫1h,期間不停的搖均汲取上清液,移至新的離心管中,參與等體積氯仿：異戊醇24：1，輕緩顛倒混勻,10000rpm,10min 取上清液，移至新的離心管中,加等體積氯仿：異戊醇,顛倒混勻, 10000rpm,10min取上清液，參與0.6-0.7V的異丙醇預(yù)冷，后4 /-20 保溫沉淀10000rpm,10min離心取沉淀，70%乙醇清洗兩次，吹干用TE溶解DNA,然后低溫保管 取提取的DNA溶液2 l(約100-200 ng)至一干凈的離心管，參與198 l蒸餾水稀釋。先200 l蒸餾水至比色杯，進(jìn)展紫外光空白測(cè)定，然后倒掉蒸餾水，參與200 l已稀釋的DNA溶液，測(cè)定260 nm及280 nm的光吸收值OD260及OD280，計(jì)算DNA濃度及OD260/OD280比值。計(jì)算公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù)以上濃度單位為g /ml2. DNA濃度的測(cè)定1葉片磨得越細(xì)越好。2移液器的運(yùn)用。3由于植物細(xì)胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中參與EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。六、本卷須知七、作業(yè)(1)本實(shí)驗(yàn)所