8生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分的測定

1、第八章 生物樣品內(nèi)中藥制劑化學(xué)成分的測定1 1 概述生物藥物分析的對象藥物所到之生物體的體液、器官、組織、排泄物等。生物藥物分析的目標(biāo)母體藥物和代謝產(chǎn)物生物藥物分析的意義藥物質(zhì)量的正確評價臨床合理用藥21 概述 生物藥物分析的特點生物樣品中被測組分的存在形式多樣原型藥（游離型）、結(jié)合型、代謝物、綴合物等被測組分濃度低(10-6-10-9g/ml)，變化幅度大樣品干擾物質(zhì)多，部分樣品穩(wěn)定差樣品量少要求較快提供結(jié)果測定數(shù)據(jù)的處理和闡明有時不太容易31 概述 生物藥物分析的任務(wù)分析方法學(xué)的研究藥物濃度的監(jiān)測藥代動力學(xué)的研究生物樣品內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)的測定42 藥物在生物體內(nèi)的存在狀態(tài)與生物轉(zhuǎn)化藥物在生物體

2、內(nèi)的存在狀態(tài)藥物代謝保證臨床用藥的安全、合理和有效藥物代謝的部位：肝臟、腎、脾、肺、腸粘膜、胎盤等藥物代謝反應(yīng)第一階段（一相）：細(xì)胞色素P450等催化下的氧化、還原、水解等反應(yīng)，增大極性第二階段（二相）：與葡萄糖醛酸、硫酸鹽等結(jié)合，進(jìn)一步增大極性，隨尿排出53 生物樣品的制備 常用生物樣品生物樣品的選取原則能夠反映出濃度與藥效之間的關(guān)系易于獲得便于處理根據(jù)不同目的和要求進(jìn)行選取63 生物樣品的制備 常用生物樣品常用生物樣品的種類、特點與采集 血漿(plasma)血樣 血清(serum) 全血(whole blood)尿液(urine)用于藥物劑量回收、藥物腎清除率及生物利用度的研究 尿液藥物濃

3、度變化大，應(yīng)測定一定時間內(nèi)尿中藥 物總量。 尿液與血液中藥物的相關(guān)性差。 尿中藥物大多呈綴合狀態(tài)。73 生物樣品的制備 常用生物樣品常用生物樣品的種類、特點與采集唾液(saliva)用于藥物濃度監(jiān)測和藥代動力學(xué)研究其他動物臟器組織勻漿等樣本的代表性力求取樣條件標(biāo)準(zhǔn)化樣品的貯存血樣離心，冷凍保存尿液立即測定，否則應(yīng)冷藏或加防腐劑83 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理提取方法的選擇依據(jù)藥物的理化性質(zhì)-酸堿度、極性、揮發(fā)性、可能的生物轉(zhuǎn)化途徑等藥物的濃度范圍藥物測定的目的生物樣品的類型樣品處理與分析技術(shù)的關(guān)系93 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理藥物的提取蛋白質(zhì)處理利用蛋白質(zhì)脫水沉淀有機溶劑、中性鹽等利用蛋白質(zhì)

4、形成不溶性鹽沉淀酸性沉淀劑（TCA、高氯酸、苦味酸等）重金屬鹽（Zn2+、Cu2+）103 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理藥物的提取蛋白質(zhì)處理其他方法加熱離心、超濾和透析分析游離的待測組分酶消化法分析與蛋白質(zhì)強結(jié)合的待測組分113 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理藥物的提取綴合物（結(jié)合物）水解酸水解無機酸 簡便快速，但專屬性差，有可能造成被測物分解。酶水解葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)芳基硫酸酯酶(arylsulfatase) 專屬性強，一般不會造成被測物分解，但水解時間長，費用高。溶劑解123 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理藥物的提取冷凍干燥適用于-大批量的生物樣品-水溶性很強的樣品-揮發(fā)性

5、樣品-對熱不穩(wěn)定的樣品133 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理藥物的分離與凈化液-液萃取萃取率：不低于50%影響提取率的因素pH值提取溶劑離子強度離子對提取143 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理藥物的分離與凈化液-固萃取固相提取柱（使用硅藻土、氧化鋁、離子交換樹脂、活性炭等填充劑）“干混合物”萃取待測組分的富集真空揮發(fā)或通氣流揮發(fā)衍生化處理153 生物樣品的制備 樣品預(yù)處理待測物的損失吸附、化學(xué)降解、衍生化反應(yīng)、絡(luò)合、蒸發(fā)樣品玷污增塑劑脂肪酸和酯類其他164 生物樣品內(nèi)藥物分析方法分析方法建立的一般步驟 以純品進(jìn)行測定 確定線性范圍、最適測定濃度、靈敏度、最佳測定條件等空白樣品測定以水代替空白樣品，添加

6、對照品后測定 了解提取回收率和最低檢測濃度的大致情況空白樣品中添加對照品后測定（回收率實驗）實際樣品測定174 生物樣品內(nèi)藥物分析方法 方法的評價準(zhǔn)確度（accuracy）回收率相對穩(wěn)定與參比方法相比較相關(guān)系數(shù)r 0.95精密度（precision） 各濃度點RSD不應(yīng)大于15%，最低定量限不應(yīng)大于20%。靈敏度檢測限(LOD)、定量限(LOQ)、最低檢測濃度184 生物樣品內(nèi)藥物分析方法 方法的評價方法的專屬性（specificity） 注重考慮代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)和同時服用藥物的干擾線性范圍-相關(guān)系數(shù)r 0.99 樣品穩(wěn)定性考察長期貯存(-20 /-70)、短期室溫貯存冷凍-解凍循環(huán)穩(wěn)定性貯

7、備液穩(wěn)定性195 生物藥物分析的常用測定方法 光譜法紫外可見分光光度法熒光分光光度法色譜法電泳法免疫分析法206 應(yīng)用實例人尿中槲皮素含量測定 取15mL氬氣消泡后的尿液，用0.12mol/L醋酸鹽(含1%抗壞血酸)調(diào)尿液pH至5，樣品中加入1g漆樹黃酮做內(nèi)標(biāo)，用葡萄糖醛酸苷酶/芳基磺胺酶在37溫孵1h震蕩水解，取500mg反相C18填料，甲醇濕潤裝柱，隨后用1%甲酸5mL平衡ODS柱，酶解后的尿液上樣，流速為5mL/min左右，用3mL5%甲醇和3mL90%甲醇(含1%甲酸和1%抗壞血酸)洗脫，最后用3mL甲醇洗脫。餾分合并，真空吹干，殘渣用150uL甲醇復(fù)溶后進(jìn)樣。NielsenSE, e

8、t al. J Chromatogr (B),1998,707(2):81289121五靈膠囊中五味子乙素在小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究色譜條件：KromasilC-18色譜柱 (4.6mm150mm,粒度:5um); 流動相為甲醇-水(80:20); 流速1.0mlmin; 檢測波長254nm; 柱溫為室溫。給藥方法：昆明小鼠456只，雄性，置相對濕度45%75%、溫度(251)動物試驗室飼養(yǎng)3d，禁食過夜，自由飲水，次日按體重分層，隨機分組，每時間點為一組，每組4只，五靈膠囊按16.6g/kg (相當(dāng)于人體給藥劑量10倍,其中含五味子乙素45.0mg)給藥,分別在0.16, 0.32, 0.5,

9、 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5 ,5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 18.0, 20.0, 24.0, 26.0, 28.0, 32.0h眼眶采血，置于肝素鈉的離心管內(nèi)，室溫放置30min，3000rmin離心10min,分離血漿,每組血漿合并置-20凍存。乙素供試品按45.0mg/kg給藥,分別在0.16, 0.32, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0h采血，同上法操作得血漿，-20凍存。22五靈膠囊中五味子乙素在小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)研究血漿供試品溶液、血漿乙素供試品溶液與陰性供試品溶液的制備 取上述依時間點取每組小鼠混勻血漿0.7ml，分別加0.25g硫酸胺，振蕩混勻1min，再加乙腈-甲醇(4:1)溶液4ml，振蕩混勻3min，3000rmin離心20min，取上清液置蒸發(fā)皿內(nèi)，于40水浴上用氮氣吹干，殘渣加色譜甲醇溶解至1ml，搖勻，-20放置過夜。次日用0.22Lm微孔濾膜抽濾，作為血漿供試品溶液。取上述乙素供試品依時間點取每組混勻血漿0.7ml，按供試品溶液的制備方法制得血漿乙素供試品溶液,另取五靈膠囊缺五味子陰性樣品和供試品