人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則（2003）

1、 13/13 人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則 2003年03月20日 發(fā)布 本要點適用于供治療的體診斷用的利用雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體，適用于在人體應(yīng)用的利用重復(fù)DNA技術(shù)制備的基因工程抗體。 一、雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體 （一）雜交瘤細(xì)胞 1親本細(xì)胞 （1）骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0或其他適宜的骨髓瘤細(xì)胞系。應(yīng)為不合成或不分泌免疫球蛋白鏈型，具有符合骨髓瘤細(xì)胞的染色體特征，并有明確的來源歷史及符合要求的保存條件。 （2）免疫親代細(xì)胞 經(jīng)抗原免疫的鼠脾B淋巴細(xì)胞或外周血B淋巴細(xì)胞。 應(yīng)有明確的免疫原來源、性質(zhì)及動物種系，免疫原詳細(xì)的制備過程。 適宜的免疫方案及免疫淋巴細(xì)胞制備的方法。 2細(xì)

2、胞融合與克隆化 采用適宜的方法進行融合、篩選及克隆化。 3雜交瘤細(xì)胞檢定 （1）抗體分泌穩(wěn)定性 連續(xù)克隆化后抗體陽性率達100%，經(jīng)體外連續(xù)傳代3個月以上和反復(fù)凍存、復(fù)，細(xì)胞系能保持穩(wěn)定分泌特異性抗體。 （2）細(xì)胞核學(xué)特征 檢查細(xì)胞分裂中期染色體，應(yīng)符合雜交瘤細(xì)胞特征。 4鼠源病毒檢查 按附錄要求檢測鼠源病毒。 5支原體檢查 按現(xiàn)行中國藥典生物制品無菌試驗規(guī)程進行。 6無菌試驗 按現(xiàn)行中國藥典生物制品無菌試驗規(guī)程進行。 （二）單克隆抗體的檢定 1免疫球蛋白類及亞類 用免疫雙擴散法或其他適宜的方法測定。 2親和力 用可靠、準(zhǔn)確的方法測定單克隆抗體（以下簡稱為單抗）的親和常數(shù)或相對親和力。一般情況

3、下，對于免疫原為可溶性的單抗，測其親和常數(shù)，對于免疫原為顆粒性抗原的單抗，測其相對親和力。 3特異性 測定單抗對靶抗原的特異性；對多株單抗識別的抗原決定簇進行相關(guān)性分析。 4交叉反應(yīng) 按附錄要求。 免疫組織化學(xué)法測定單抗與人體組織交叉反應(yīng)，用冰凍及石蠟包埋的各種正常臟器組織測定。來源于腫瘤相關(guān)抗原的單抗應(yīng)進行與各種腫瘤組織的交叉反應(yīng)試驗。 5效價測定 用適宜方法測定。 （三）其他原材料 1細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清 支原體檢測應(yīng)為陰性。經(jīng)小量試驗適于雜交瘤細(xì)胞生長。 2培養(yǎng)液 應(yīng)有培養(yǎng)液來源，質(zhì)量指標(biāo)。 3化學(xué)試劑 規(guī)格應(yīng)達到分析純以上。 二、基因工程抗體 參考人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則和

4、本指導(dǎo)原則中的有關(guān)要求進行。 三、細(xì)胞庫的建立應(yīng)分別建立原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫的三級管理細(xì)胞庫，一般情況下主細(xì)胞庫來自原始細(xì)胞庫、工作細(xì)胞庫來自主細(xì)胞庫。各級細(xì)胞庫應(yīng)有詳細(xì)的制備過程、檢定情況及管理規(guī)定等。 四、單抗生產(chǎn) 包括用小鼠腹水法和細(xì)胞培養(yǎng)法制備。 （一）小鼠腹水法 1小鼠 制備腹水必需使用合格的SPF級BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠雜交子一代。 2動物實驗設(shè)施 動物實驗設(shè)施應(yīng)有相關(guān)部門頒發(fā)的二級以上合格證。 3腹水制備 取適量擴增培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞注射小鼠腹腔制備腹水，小鼠可以預(yù)先用液體石蠟或降植烷等處理。 （二）細(xì)胞培養(yǎng)法 可以采用發(fā)酵罐培養(yǎng)，亦可用細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)

5、收集上清液制備單克隆抗體。培養(yǎng)基用無牛血清或低牛血清培養(yǎng)基，不能用-酰胺類抗生素。 （三）抗體純化 可采用鹽析法、分子篩層析、離子交換親和層析等適宜的方法。 1盡可能選用一些不引起免疫球蛋白聚合、變性等的純化方法及條件。 2應(yīng)驗證所用的純化方法能去除可能存在的非目標(biāo)產(chǎn)物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生產(chǎn)腹水抗體的刺激物、毒素、其它熱原質(zhì)、培養(yǎng)液成分或?qū)游鲋龀龀煞值取?3應(yīng)驗證所用的純化方法能有效的去除/滅活病毒。 4連續(xù)產(chǎn)生的各批產(chǎn)品必須符合質(zhì)檢要求，批間具有良好的重復(fù)性。 5純化后處理 必要時對純化后抗體采用適宜方法進行處理。 （四）半成品、成品制備 五、檢定 包括原液（

6、小鼠腹水、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、純化抗體）、半成品及成品的檢定等。 （一）物理化學(xué)檢測 1外觀 液體制劑應(yīng)為接近無色微帶乳光的澄清液體，不應(yīng)含有異物、渾濁或搖不散的沉淀。 2pH值 電位法測定 3蛋白質(zhì)含量的測定 用Lowry法或其它適宜的方法測定。 4純度測定 （1）電泳法 用還原和非還原條件SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。掃描后免疫球蛋白含量應(yīng)達到95%以上，二聚體10%。 （2）HPLC法 純度應(yīng)95%。 （3）多聚體測定 用FPLC或HPLC法，用適宜的分子篩層析，多聚體應(yīng)10%。 5DNA含量測定 用DNA分子雜交法。每一劑量殘余鼠骨髓DNA含量不高于100pg。 6水分 產(chǎn)品如為凍干制品，應(yīng)

7、進行殘余水分測定，其含量應(yīng)3%。 （二）生物學(xué)檢定 1活性及效價測定 用適宜方法進行。 2鼠源病毒檢定 同上鼠源病毒檢查。 3無菌試驗 同上無菌試驗。 4支原體檢定 同上支原體檢定。 5安全試驗 用小白鼠和豚鼠進行試驗。 6熱原質(zhì)試驗 按照現(xiàn)行版中國藥典生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程進行。采用家兔法時，家兔注射劑量=（人用劑量/50）*20*家兔體重（kg）。也可用鱟試劑法，1mg/mL蛋白濃度不應(yīng)檢測出有凝集活性。 7異常毒性實驗 （三）非免疫球蛋白雜質(zhì)分析 包括來源于細(xì)胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝的相關(guān)雜質(zhì)，采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和方法進行分析檢測。 六、經(jīng)修飾的單克隆抗體 為了提高單克隆抗體在治療和體診斷中

8、的作用，常用單抗與毒素、藥物、放射性核素或其它物質(zhì)偶連形成免疫結(jié)合物，或在同一段多胎鏈包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重組蛋白來獲得。研究者除對前面提到的有關(guān)未偶連單克隆抗體（未修飾單克隆抗體）的要求外，還應(yīng)提供下列容： （一）免疫結(jié)合物的構(gòu)建 應(yīng)提供構(gòu)建免疫結(jié)合物所用試劑和過程的詳細(xì)資料，包括： 1描述與單克隆抗體連接的成分如：毒素、藥物、酶及細(xì)胞因子，包括：所有成分的來源、結(jié)構(gòu)、制法、純度及特征。 2制備免疫結(jié)合物所用化學(xué)試劑的描述，如連接劑和螯合劑。這些資料應(yīng)該包括試劑來源、制備方法，以及合成或純化時殘留雜質(zhì)的測定等容。還應(yīng)提供合成反應(yīng)途徑的圖解，以及與免疫結(jié)合物中所用化學(xué)試劑毒性

9、相關(guān)資料。 3在確定成品的標(biāo)準(zhǔn)時應(yīng)首先確定該原料與抗體的平均結(jié)合率及每個抗體被結(jié)合部分的數(shù)量，并揭示免疫球蛋白置換數(shù)量、效力和穩(wěn)定性間的關(guān)系。 4用重組DNA技術(shù)制備的制品（如來源于轉(zhuǎn)染細(xì)胞系或微生物培養(yǎng)基，嵌合的、易形的，互補決定區(qū)CDR接合的及單鏈Fv抗體，以及重組免疫結(jié)合物）應(yīng)提供構(gòu)建和置備過程的全部資料。重組免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性應(yīng)認(rèn)真研究。因聚合物形成構(gòu)形改變或變性而減弱了特異免疫反應(yīng)性（如通過重組Fvs形成雙抗）可能導(dǎo)致藥代動力學(xué)的改變和/或與非靶組織結(jié)合。 （二）免疫結(jié)合物的純度 1應(yīng)采取特殊措施保證抗體盡可能無外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因這些污染物質(zhì)在構(gòu)建免疫結(jié)合物過程中，

10、能與核素、毒素或藥物發(fā)生反應(yīng)。 2應(yīng)規(guī)定最終產(chǎn)品中游離抗體或游離組分的限量?；钚灾虚g體應(yīng)被滅活或去除。 （三）免疫結(jié)合物的免疫反應(yīng)性，效力及穩(wěn)定性 毒素或藥物偶聯(lián)至抗體上會改變其中任一成分的活性。 1應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ǎ辉u估偶聯(lián)前后的免疫反應(yīng)性。 2免疫結(jié)合物非免疫球蛋白成分的活性應(yīng)在適當(dāng)?shù)臅r候用效力試驗來進行評估（例如，毒素、細(xì)胞因子或酶等），用于造影的放射性免疫結(jié)合物除外。 3免疫結(jié)合物構(gòu)建后，應(yīng)確定免疫反應(yīng)性變化的百分率限值，并作為產(chǎn)品規(guī)格的組成部分。 4應(yīng)通過在合并的人血清中37無菌條件下孵育，來檢測免疫結(jié)合物在體外的穩(wěn)定性。假如所用抗凝劑不會影響免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性，血漿可以用來代替血清

11、。經(jīng)過規(guī)定間隔時間分析樣品中完整免疫結(jié)合物及分解產(chǎn)物的濃度。應(yīng)詳細(xì)說明評估產(chǎn)品的穩(wěn)定性的條件及所用陰、陽對照。 （四）與放射性核素偶聯(lián)單克隆抗體的特殊問題 放免結(jié)合物應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化的、嚴(yán)格控制并經(jīng)過驗證的方法制備。應(yīng)建立檢測游離同位素、結(jié)合單克隆抗體、標(biāo)記的非免疫球蛋白物質(zhì)的放射性百分率的方法。 1放射性標(biāo)記單克隆抗體的初始研究用新藥申報包含連續(xù)3次放射標(biāo)記試生產(chǎn)的分析結(jié)果，應(yīng)證明所制備的產(chǎn)品未改變免疫特異性、無菌、無熱原質(zhì)。放射性標(biāo)記試生產(chǎn)應(yīng)由在研究中對單克隆抗體進行放射性標(biāo)記及使用試劑的同一組人員進行。 2制備免疫結(jié)合物時應(yīng)使用放射性藥品及同位素并應(yīng)提供其無菌及無熱原質(zhì)的分析證書及橫向參比的信

12、涵。 3在標(biāo)記試生產(chǎn)過程中，應(yīng)測定最終產(chǎn)品中共價結(jié)合的和游離的同位素的濃度，以及標(biāo)記試劑及其分解產(chǎn)物的殘留水平。 4應(yīng)描述給每一個病人應(yīng)用前后進行的質(zhì)控試驗。 5適當(dāng)?shù)臅r候，應(yīng)檢測免疫結(jié)合物形成膠體的情況，并對其進行限定。 6有關(guān)單抗制備中放射性標(biāo)記物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)參考國家關(guān)于放射性藥品規(guī)定。 七、產(chǎn)品穩(wěn)定性 產(chǎn)品穩(wěn)定性應(yīng)滿足臨床方案制定的要求。加速穩(wěn)定性試驗資料可作為產(chǎn)品審批及標(biāo)定用，但不能代替實際的穩(wěn)定性資料。 （一）應(yīng)制定穩(wěn)定性檢定規(guī)劃，包括在規(guī)定效期全過程中，每間隔一定時間進行制品的物理化學(xué)完整性試驗（如斷裂或聚合），效力試驗，無菌試驗，以及水分、pH和防腐劑的穩(wěn)定性測定。 （二）確保制品

13、生物活性的穩(wěn)定性試驗（例如定量體外效率試驗）應(yīng)包括廠參比品。如可能在試驗的全過程中只使用一批試驗抗原（如：純化的抗原、細(xì)胞或組織）。應(yīng)用定量效力試驗使對生物活性進行有意義的比較成為可能。 （三）加速穩(wěn)定性試驗，既將制品儲存在溫度高于常規(guī)儲存溫度后的穩(wěn)定性試驗，可能有助于鑒定及建立穩(wěn)定性指示試驗。表示穩(wěn)定性的特定參數(shù)應(yīng)通過對每一批制品用趨向分析方法進行監(jiān)測。 八、臨床前研究 由于生產(chǎn)條件或配方的改變可引起制品生物活性的明顯變化。因此，建議在臨床前研究中所使用的單抗應(yīng)與臨床試驗中擬使用的單抗的生產(chǎn)工藝一致。 （一）交叉反應(yīng)性試驗 當(dāng)相同或相關(guān)抗原決定簇在人的非預(yù)定的細(xì)胞或靶組織表達時，可觀察到抗體

14、與它們結(jié)合。非靶組織結(jié)合可能具有嚴(yán)重后果，特別是使用藥理活性抗體或細(xì)胞毒性免疫結(jié)合物時。因此，一般在期臨床試驗前應(yīng)經(jīng)過用人組織或細(xì)胞進行交叉反應(yīng)性或非靶組織結(jié)合的實驗室檢測。對于雙特異性抗體，除檢測雙特異性產(chǎn)品外，還應(yīng)對每株親本抗體進行逐個評估。 1檢測交叉反應(yīng)性的體外試驗 目前，用人細(xì)胞或組織進行免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測，應(yīng)使用有效的并被確認(rèn)的新技術(shù)（參照124）。 2測定交叉反應(yīng)性的體試驗 當(dāng)有適當(dāng)模型時，單克隆抗體與非靶人組織的交叉反應(yīng)性應(yīng)在動物中進行一次綜合的體試驗。試驗結(jié)果，特別是對具有溶細(xì)胞性的免疫結(jié)合物或具有ADCC活性的抗體，通常要求進行更廣泛的臨床前試驗，包括用一種

15、以上動物超劑量及重復(fù)劑量進行動物試驗。設(shè)計臨床試驗時應(yīng)考慮對非靶組織的定位。 （二）臨床前藥理學(xué)和毒性試驗 1設(shè)計單克隆抗體臨床前安全試驗是為了預(yù)測在人體中可能的毒性評估在人體中潛在不良反應(yīng)副作用的可能性和嚴(yán)重程度，并可能確定安全初始劑量和逐步提高劑量。有關(guān)單克隆抗體的臨床前試驗，包括免疫原性、穩(wěn)定性、組織交叉反應(yīng)性和效應(yīng)功能。 2動物毒理學(xué)研究 當(dāng)設(shè)計單克隆抗體的毒理學(xué)試驗時，應(yīng)考慮如下： （1）若被試樣品為未偶聯(lián)抗體，且無合適的動物模型或無攜帶相關(guān)抗原的動物，且與人組織交叉反應(yīng)性試驗明顯陰性，則毒理學(xué)試驗不是必須的。 （2）動物體相關(guān)抗原的性質(zhì)與人體相關(guān)抗原的生物學(xué)分布、功能及結(jié)構(gòu)應(yīng)具有可

16、比性。但是，對于所用的動物模型，不必要求對單克隆抗體的抗原密度或親和力絕對相等。例如，結(jié)合力差異可通過增加劑量或服藥頻率來彌補。應(yīng)鑒定動物和人之間存在的抗原數(shù)，單克隆抗體的抗原親和力或?qū)慰寺】贵w結(jié)合的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)等方面存在的差異。這可以更精確的推斷人用的安全初始劑量,并評估安全圍。 （3）對單克隆抗體通常不要求進行常規(guī)誘變性的評估。 （4）擬給育齡婦女反復(fù)或長期使用的產(chǎn)品，應(yīng)該用適當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ瓦M行反復(fù)的深入的研究包括致畸試驗。 3藥效學(xué)和動物藥代動力學(xué) （1）當(dāng)有動物模型時，則應(yīng)盡可能證明藥理學(xué)效應(yīng)與劑量的依賴性，以及有效劑量的圍，可以更好地預(yù)測治療指數(shù)；當(dāng)無適合動物模型時，則應(yīng)盡可能以人外

17、周血、組織器官等進行體外藥效學(xué)研究。當(dāng)有動物模型時，藥代動力學(xué)的有關(guān)資料（生物學(xué)分布，半衰期等）可以從動物模型中得到；當(dāng)無適合動物模型時，動物藥代動力學(xué)可以考慮不做，加強臨床試驗時藥代動力學(xué)方面的監(jiān)控。 （2）下列方面可以指導(dǎo)藥代動力學(xué)幾藥效學(xué)試驗動物種類的選擇：最好選擇與人有交叉反應(yīng)或相同靶抗原的動物模型來進行試驗。對于僅抗人而未在動物模型中表達的人抗原或外源抗原（細(xì)菌，病毒等）的未偶聯(lián)單克隆抗體，可以不必用缺乏靶抗原的動物做試驗。當(dāng)有抗原結(jié)合資料表明靈長類為最相關(guān)種屬時，則對未偶聯(lián)的單克隆抗體的試驗采用非人靈長類動物是適宜的。應(yīng)對使用正常嚙齒類動物和鼠異源移植模型精確預(yù)測單克隆抗體在人體的

18、藥代動力學(xué)行為的可能性進行嚴(yán)格評估。異源移植模型對評估單克隆抗體與人體腫瘤結(jié)合的能力更有意義。 （3）鼠源抗體對于小鼠為非免疫原性物質(zhì)，但在人體具免疫原性，這就使得在鼠所得的重復(fù)劑量結(jié)果難以推至擬在人體使用的重復(fù)劑量。使用完全人源的、嵌合的或人源化的單克隆抗體將出現(xiàn)相應(yīng)的問題，在這種情況下用嚙齒類動物進行重復(fù)劑量的研究意義不大。 4用免疫結(jié)合物進行的臨床體研究 （1）應(yīng)在體試驗免疫結(jié)合物的穩(wěn)定性應(yīng)測定免疫結(jié)合物中每個組分在動物體藥代動力學(xué)和組織分布，并且與未偶聯(lián)抗體的分布相比較。不同組分的靶組織和他們能引起的潛在的毒性應(yīng)被證實。 （2）由于免疫結(jié)合物可能被降解或作用位點的活性不是單克隆抗體與靶

19、抗原結(jié)合的結(jié)果，應(yīng)對含有放射性核素、毒素或藥物的免疫結(jié)合物進行動物毒性實驗，盡管該種動物不存在靶抗原。根據(jù)免疫結(jié)合物組分的性質(zhì)和其偶聯(lián)的穩(wěn)定性，對組分分別進行試驗是有道理的。應(yīng)充分描述每個組分的毒性情況、副反應(yīng)的發(fā)生和嚴(yán)重程度。所得結(jié)果應(yīng)與結(jié)合物穩(wěn)定性試驗密切相關(guān)。如可能，應(yīng)用具有相關(guān)靶抗原或疾病模型動物體進行免疫結(jié)合物試驗，如果不存在靶抗原陽性動物就在嚙齒類動物體進行。游離毒素或核素的毒性試驗可在不同類動物中進行。 （3）對于放射性核素的免疫結(jié)合物：動物生物分布的資料可被用于對初始人用劑量的評估。如可能，表達靶抗原的動物模型更有可能發(fā)現(xiàn)抗原減少或帶有在生物分布和/或毒性方面表現(xiàn)意外抗原的組織。異源移植模型可以組織定位和抗原非特異放射性免疫結(jié)合物分布問題，但對確定一般組織交叉反應(yīng)圍沒有幫助。應(yīng)研究適宜的動物數(shù)量以用一個可接受的變異系數(shù)（通常小于20%）對放射性劑量進行評估。對于使用放射性總量的新代和測定從早到晚清除期時間點的適當(dāng)數(shù)值應(yīng)有完整計算。放射性