環(huán)氧化酶2VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義

1、環(huán)氧化酶-2VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義【摘要】 目的:觀察環(huán)氧化酶-2（COX-2）、VEGF在NSCLC及非腫瘤性病變肺組織中的表達(dá)，探討其在NSCLC發(fā)生發(fā)展及腫瘤血管生成中的作用。方法:制作71例NSCLC和21例非腫瘤性病變肺組織共92例的組織芯片，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)COX-2、VEGF的表達(dá)。結(jié)果:COX-2、VEGF在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.47%、77.06%，均顯著高于非腫瘤性病變肺組織（14.29%，38.10%）。COX-2的表達(dá)與肺癌組織的病理類(lèi)型有關(guān);VEGF的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān)。NSCLC組織中COX-2與VEGF表達(dá)具

2、有相關(guān)性。結(jié)論:COX-2和VEGF在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用，可作為判斷NSCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后的重要生物學(xué)指標(biāo)。COX-2可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)參與NSCLC組織中血管生成。 【關(guān)鍵詞】 非小細(xì)胞肺癌;COX-2;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子;組織芯片 研究發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶-2（COX-2）在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并參與腫瘤血管形成，由COX-2催化合成的前列腺素可能作為血管生成劑促進(jìn)腫瘤的形成。在人前列腺癌組織中發(fā)現(xiàn)COX-2與VEGF表達(dá)基本一致，而其增高幅度與腫瘤惡性程度相關(guān) 1 。本研究旨在探討COX-2與VEGF在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)、意義及相關(guān)性。 1 材料與方

3、法 1.1 材料 1.1.1 研究對(duì)象:收集選擇青島市立醫(yī)院胸外科2004年1月2005年10月間手術(shù)切除非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本73例（術(shù)前均未行放、化療）及肺良性疾病21例作為組織對(duì)照，所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實(shí)并取自病變的典型區(qū)域。其中NSCLC病理組織學(xué)診斷及分級(jí)采用WHO1999年肺癌組織學(xué)分類(lèi)、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 2 ，分期采用1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的肺癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn) 3 。所有標(biāo)本均及時(shí)經(jīng)10%中性福爾馬林固定，熔點(diǎn)為5658的石蠟包埋。 1.1.2 研究材料:鼠抗人VEGF單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，鼠抗人COX-2單克隆抗體、PV9000通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒、非免

4、疫小鼠IgG均購(gòu)自北京中杉公司。每批實(shí)驗(yàn)均分別取COX-2、VEGF陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，并分別用同種動(dòng)物非免疫血清代替一抗作陰性對(duì)照。 1.2 方法 1.2.1 組織芯片的制作:觀察每一組織標(biāo)本的HE切片以確定蠟塊穿刺位置;用Beecher Instru-ments生產(chǎn)的組織芯片儀，從蠟塊標(biāo)記部位逐個(gè)取出2mm組織芯，隨即推入受體蠟塊上已打好的孔內(nèi)，制作成組織芯片蠟塊;將制作好的組織芯片蠟塊面向下置于模具中，60烤箱中放置1h，使蠟塊重新熔為一體。隨后將蠟塊連同模具一同取出，靜置自然冷卻至室溫，然后置于-4冰箱中7min，將蠟塊與模具剝離;將制作好的組織芯片蠟塊3m4m連續(xù)切片，冷水漂片，挑選組

5、織芯完整的切片轉(zhuǎn)移至56水中展片，用預(yù)先制備好的APES載玻片撈片。 1.2.2 組織芯片免疫組化標(biāo)記:主要步驟為:組織芯片切片常規(guī)脫蠟至水;內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷;組織微波抗原修復(fù);滴加適當(dāng)稀釋的一抗（其中COX-2:1600稀釋，VEGF:1300稀釋），濕盒內(nèi)冰箱中4過(guò)夜;分別滴加試劑1、試劑2，均在濕盒內(nèi)37孵育20min;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。 1.3 結(jié)果判定 COX-2、VEGF免疫組化染色結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Kim 4 陽(yáng)性細(xì)胞半定量積分法:光鏡下分析， 在排除非特異性染色的前提下，A以切片中陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度分級(jí)，0級(jí):陰性;1級(jí):弱陽(yáng)性;2級(jí):中等強(qiáng)度陽(yáng)性;3級(jí)

6、:強(qiáng)陽(yáng)性。B以切片中陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分，染色的范圍標(biāo)記為0（0）、1（1%25%）、2（26%50%）、3（51%75%）、4（76%100%）;兩積分相加之和作為最后的染色積分，其積分2認(rèn)為陽(yáng)性，其余均為陰性。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS軟件包11.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P0.05確定差異有顯著意義。 2 結(jié)果 2.1 組織芯片的質(zhì)量本研究制成2個(gè)組織芯片蠟塊，蠟塊完整，肉眼可見(jiàn)組織芯排列整齊，外形為圓形或類(lèi)圓形，無(wú)缺損現(xiàn)象。芯片HE染色結(jié)果:點(diǎn)陣分布均勻，組織芯完整，只有2例組織芯缺失不全，1例組織芯出現(xiàn)移位，為統(tǒng)計(jì)方便取有效例數(shù)92例（其中NSCLC組71例、對(duì)照組21例），有效率為97

7、.87%，仍可代表原樣本信息，不影響統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。71例NSCLC病例中男性53例，女性18例;年齡38歲81歲，平均年齡62.3歲;鱗狀細(xì)胞癌38例（高分化1例，中分化22例，低分化15例），腺癌31例（高分化12例，中分化13例，低分化6例），巨細(xì)胞癌2例;發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例;期36例，期23例，期10例，期2例。 2.2. COX-2、VEGF在兩組組織中的表達(dá)及其與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系COX-2蛋白陽(yáng)性染色主要定位于胞漿，為清晰棕黃色彌漫性分布，強(qiáng)陽(yáng)性組可見(jiàn)明顯的顆粒狀著色。COX-2在NSCLC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率及與患者臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1、表2。 表1 NSCLC、

8、非腫瘤性病變肺組織中COX-2、VEGF的表達(dá)略 表2 NSCLC中COX-2、VEGF的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 （略） VEGF蛋白陽(yáng)性染色主要定位于胞漿，呈棕黃色顆粒狀，以腫瘤組織周邊部位及壞死區(qū)域周?chē)[瘤細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)，腫瘤組織內(nèi)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及部分血管內(nèi)皮細(xì)胞也呈陽(yáng)性。VEGF在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率及與患者臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1、表2。 2.3. NSCLC組織中COX-2與VEGF的關(guān)系 （見(jiàn)表3） 表3 COX-2與VEGF在NSCLC組織中表達(dá)的相互關(guān)系略 在NSCLC組織中COX-2表達(dá)陽(yáng)性的55例組織中VEGF表達(dá)陽(yáng)性的有46例（占83.64%），而COX-2表

9、達(dá)陰性的16例組織中VEGF表達(dá)陽(yáng)性的僅有8例（占50.00%），經(jīng)四格表 2 檢驗(yàn)COX-2與VEGF表達(dá)密切相關(guān)（P0.05）。 3 討論 環(huán)氧化酶（COX）是前列腺素合成過(guò)程中的一個(gè)重要限速酶，其中COX-2亞型為可誘生型，在正常生理狀態(tài)下多數(shù)組織內(nèi)檢測(cè)不到，而在一定因素如生長(zhǎng)因子、炎癥介質(zhì)、促癌劑及一些癌基因產(chǎn)物等刺激下表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織芯片技術(shù)免疫組化染色檢測(cè)71例NSCLC組織、21例非腫瘤性病變組織中COX-2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)COX-2在NSCLC組織中陽(yáng)性表達(dá)率為77.46%，顯著高于非腫瘤性病變組織。并在組織切片中觀察到，NSCLC組織中分布的部分增生腺體也可見(jiàn)COX-

10、2高表達(dá)，而在正常肺組織內(nèi)的腺體少有表達(dá)，因此認(rèn)為COX-2與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道肺癌組織中COX-2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期關(guān)系的結(jié)果尚不一致，雖然本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)COX-2的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，但這并不足以否定其參與肺癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。Kozaki等 5 用高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)顯示，COX-2表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，其抑制物可減少肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)還觀察到轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞內(nèi)多種炎性介質(zhì)及促血管生成物質(zhì)增加，認(rèn)為肺癌細(xì)胞可能在轉(zhuǎn)移過(guò)程中利用COX-2參與炎癥過(guò)程，類(lèi)似炎癥細(xì)胞穿越血管壁，從而促進(jìn)肺癌血行轉(zhuǎn)移。我們的研究中發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，但

11、在肺腺癌組織中顯著高表達(dá)，表明COX-2的高表達(dá)可能在肺腺癌的早期即已發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移的作用，而未參與淋巴轉(zhuǎn)移途徑，這與肺腺癌血行轉(zhuǎn)移較早而淋巴轉(zhuǎn)移較晚的臨床特點(diǎn)相一致。 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前被認(rèn)為誘導(dǎo)血管形成最重要的生長(zhǎng)因子。VEGF由許多腫瘤細(xì)胞釋放，在原位腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，介導(dǎo)血管形成。本實(shí)驗(yàn)71例NSCLC中VEGF陽(yáng)性率為76.06%，顯著高于非腫瘤性病變組織，表明VEGF的表達(dá)與肺癌的發(fā)生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VEGF表達(dá)僅與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，在腫瘤直徑大于3cm及淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中VEG

12、F表達(dá)更顯著，陽(yáng)性率更高，表明VEGF與NSCLC的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。 多項(xiàng)研究表明腫瘤細(xì)胞中COX-2的過(guò)度表達(dá)與新生血管的形成有關(guān)，在多種惡性腫瘤中COX-2和VEGF表達(dá)存在相關(guān)關(guān)系，而其增高幅度與腫瘤惡性程度相關(guān) 1，6，7 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示COX-2與VEGF存在相關(guān)性，提示COX-2可能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)來(lái)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌新生血管的形成。我們分析其中的機(jī)制可能有兩方面，COX-2催化花生四烯酸的代謝產(chǎn)物PGE 2 、PGI 2 、TXA 2 等可直接促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的移位和生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管形成 8 。增加促血管生成因子，如VEGF的表達(dá)。COX-2催化產(chǎn)物前列腺素與相應(yīng)受體結(jié)

13、合，通過(guò)cAMP和cAMP依賴蛋白激酶（PKA）途徑誘導(dǎo)VEGF的表達(dá) 9 。Williams等 10 將Lewis肺癌細(xì)胞植入COX-2基因缺乏的小鼠體內(nèi)，觀察到血管生成和腫瘤生長(zhǎng)均受抑制，提示COX-2通過(guò)上調(diào)VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管生成。但Tamura等發(fā)現(xiàn)VEGF可以誘導(dǎo)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞COX-2和PGE 2 的表達(dá)，且這種作用 可以被選擇性COX-2抑制劑NS398抵消 11 。這些研究進(jìn)一步支持COX-2和VEGF之間存在密切關(guān)系，但是兩者之間究竟是何種正反饋機(jī)制有待于更深入的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Liu XH，Kirschenbaum A，Yao S，et al.Upregu

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