藥學(xué)專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃申請(qǐng)書(shū)文獻(xiàn)

1、2013年度國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng) 業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃申報(bào)書(shū)基于菜豆假單胞菌毒素的生物源除草劑開(kāi)發(fā) 及抗性基因資源挖掘指導(dǎo)教師:團(tuán)隊(duì)成員:2013年3月- - / 15武漢大學(xué)2013年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃申報(bào)書(shū)填表時(shí)間：2013年03月10日項(xiàng)目名稱基于菜豆假單胞菌毒素的生物源除率劑開(kāi)發(fā)及抗性基因資源挖掘項(xiàng)目創(chuàng)新特色概述?開(kāi)發(fā)環(huán)境友好型的生物除率劑，打破跨國(guó)公司草甘麟和草俊 瞬的壟斷地位?改造產(chǎn)生菌株的抗性基因，開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的除率劑 抗性基因，為開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因抗除率劑作物儲(chǔ)備基因資源?綜合利用基因工程、細(xì)胞工程等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行開(kāi)發(fā)研 究項(xiàng)目所屬一級(jí)學(xué)科理學(xué)、農(nóng)學(xué)（跨學(xué)科）申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)10000元起

2、止時(shí)間2013年3月至2015年5月姓名學(xué)號(hào)院（系）、專業(yè)聯(lián)系電話()卜 i 1*青 B 人1一Aia-hArg trixpliideAJbhrgH- Ort 。-HN h MMP INotoxin由合成路線可知，參與藥效基團(tuán)合成的基因有 ，因此可將與藥效基團(tuán)合成無(wú)關(guān)的基因敲除或?qū)⒑铣伤幮Щ鶊F(tuán)的基因組裝起來(lái)，構(gòu)建一個(gè)只合成藥效基團(tuán)的合成途徑，這樣就可以減少合成步驟，降低物質(zhì)和能量消耗，以期提高毒素的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)材料：宿主菌銅綠假單胞菌實(shí)驗(yàn)過(guò)程：限制性內(nèi)切酶技術(shù)與擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合克隆與藥效基團(tuán)合成相關(guān)的基因，按照基因簇中基因排列順序，用連接酶組裝成藥效基團(tuán)基因簇；選擇合適的載體和藥效基團(tuán)基因簇，進(jìn)行啟

3、動(dòng)子改造和密碼子優(yōu)化，將重構(gòu)基因簇導(dǎo)入異源宿主菌(銅綠假單胞菌 )；發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)藥效基團(tuán)的活性和合成單位，并與原始菌株相同環(huán)境下相同時(shí)間內(nèi)的相關(guān)數(shù)據(jù)比較，優(yōu)化異源表達(dá)系統(tǒng)。項(xiàng)目II.改良抗性基因，開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因植物本方案擬采用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法，對(duì)抗性基因進(jìn)行優(yōu)化改良，以提高其抗性。然后篩選合適的位點(diǎn)拆分，建立和轉(zhuǎn)化模式植物的方法，為開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因作物打下基礎(chǔ)。.實(shí)驗(yàn)材料：野生型煙草(L.),菜豆丁香假單胞菌 3121 ( .3121 ),大腸桿菌21 ( 21), 28a質(zhì)粒等。.實(shí)驗(yàn)步驟：抗性基因的優(yōu)化改良易錯(cuò)擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物，采用易錯(cuò)擴(kuò)增并誘導(dǎo)目的基因發(fā)生隨機(jī)性突變，得到具有不同位點(diǎn)的突變

4、基因構(gòu)建質(zhì)粒重組將突變基因裝載到大腸桿菌超量表達(dá)載體28a,得到重組質(zhì)粒。原核表達(dá)，篩選優(yōu)良突變基因?qū)⒅亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌 21中，挑取單菌落接種于含有高濃度的培養(yǎng)基中，經(jīng)抗性梯度培養(yǎng)后尋找存活下來(lái)的大腸桿菌，篩選抗性增強(qiáng)的抗性基因。真核表達(dá)，檢驗(yàn)活性對(duì)優(yōu)良抗性基因進(jìn)行修飾及加工，使其能在真核細(xì)胞中表達(dá)。將加工后的抗性基因?qū)肽繕?biāo)植株一野生型煙草中，檢驗(yàn)其活性。拆分改良型基因并導(dǎo)入目標(biāo)植株一野生型煙草（ L.）花粉易攜帶抗性基因漂移產(chǎn)生超級(jí)雜草。目前解決思路是：由于花粉中只含有染色體，而葉綠體不能隨植物花粉轉(zhuǎn)移，因此可將改良型基因拆分成兩個(gè)沒(méi)有活性的基因片斷，一斷整合在染色體 上，另一斷插入葉

5、綠體 中。這樣花粉中只攜帶沒(méi)有活性的部分基因片斷，而避免了抗性基因的漂移產(chǎn)生超級(jí)雜草的安全性問(wèn)題?？剐曰虿鸱治稽c(diǎn)的確定1根據(jù)的堿基序列，利用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析網(wǎng)站對(duì)其抗性蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，找到結(jié)構(gòu)域的交接位點(diǎn)。繼續(xù)利用 接點(diǎn)掃描系統(tǒng)（7 ）精確尋找改良型基因能夠進(jìn)行拆分的位點(diǎn)。利用7轉(zhuǎn)座在靶的隨機(jī)位點(diǎn)上插入15（即編碼5個(gè)氨基酸短肽）的外源片段，通過(guò)鑒定目的蛋白能否忍受少量外源氨基酸多肽 的插入來(lái)尋找可能的拆分位點(diǎn)?？剐曰虻牟鸱峙c介導(dǎo)載體的構(gòu)建采用方法，從上述的可拆分位點(diǎn)處將改良型基因拆分成N端與C端兩個(gè)片段，稱為和然后分別arglGNlntein-C與 內(nèi)含肽片段對(duì)應(yīng)基因的 N端和C

6、端融合。 見(jiàn)下圖詳解：核酸 argK-J| Intein-N)C 二argK N基因表達(dá)、蛋白融合 lntein r r/IargK-N蛋白質(zhì)工（argK-C7內(nèi)含肽自鶉切 Intein*目標(biāo)蛋白.CargKN農(nóng)桿菌介導(dǎo)融合基因轉(zhuǎn)入煙草愈傷組織2在野生型煙草（L.）中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將融合基因N端插入核基因組，融合基因 C端插入葉綠體基因組。在細(xì)胞核內(nèi)和葉綠體內(nèi)表達(dá)的前體蛋白中的內(nèi)含肽可以互相識(shí)別進(jìn)行蛋白剪接，形成了一個(gè)完整的有功能的目的蛋白產(chǎn)物 ，即抗除草劑蛋白，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)除草劑表現(xiàn)出抗性。通過(guò)用含有的 培養(yǎng)液培養(yǎng)煙草愈傷組織，篩選產(chǎn)有抗性蛋白而存活下來(lái)的植株，進(jìn)而大規(guī)模種植。反式剪接防止

7、基因漂流。編碼抗除草劑的基因改良型基因被拆分，轉(zhuǎn)入核中和葉綠體中。核基因片段融合了編碼反式剪接蛋白內(nèi)含肽剪接區(qū)域的端（）和編碼葉綠體定位的（），整合進(jìn)葉綠體中的基因片段則融合了編碼反式剪接蛋白內(nèi)含肽剪接區(qū)域的端（）。轉(zhuǎn)錄和翻譯后，（）-（）導(dǎo)入葉綠體中，在那里通過(guò)反式剪接或介導(dǎo)的蛋白互補(bǔ)（）形成有活性的抗性蛋白。3參考文獻(xiàn)M C , F J , A E , al . A 7 一.2000,28 : 1067 1077.2頓寶慶、陸偉、張維、平淑珍、王旭靜、陳明、徐玉泉、金丹、王勁、趙仲麟、梁愛(ài)敏、侯松娜、.、林敏，熒光假單胞菌 G2.合酶的拆分和 介導(dǎo)的活性恢復(fù).科學(xué)通報(bào).2006, 51 （

8、12）: 1479-1481.3靳茜、王志興、王旭靜、賈士榮，限控基因飄流的生物學(xué)措施研究進(jìn)展，中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)2012,14 （5） :64-70.三、預(yù)期成果.對(duì)的合成機(jī)制有更深的理解，探索出一種可以高效生產(chǎn)的途徑。2.篩選得到對(duì)抗性提高的基因,建立拆分表達(dá)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的系統(tǒng)。.爭(zhēng)取整理發(fā)表1-2篇有關(guān)合成調(diào)節(jié)的科研論文，通過(guò)論文的發(fā)表，我們可以直接參與學(xué)習(xí)論文的 撰寫(xiě)、修改和的發(fā)表全部過(guò)程，增強(qiáng)我們的知識(shí)產(chǎn)權(quán)意識(shí)。.通過(guò)此次創(chuàng)新實(shí)踐，提高隊(duì)員的專業(yè)知識(shí)水平和創(chuàng)新意識(shí)，激發(fā)隊(duì)員學(xué)習(xí)專業(yè)知識(shí)的興趣；培養(yǎng)實(shí)事求是、艱苦奮斗、的科學(xué)研究精神；提高隊(duì)員的綜合素質(zhì)，促進(jìn)學(xué)生由知識(shí)型向能力型人才的轉(zhuǎn)變。四、詳細(xì)預(yù)算預(yù)算項(xiàng)目名稱簡(jiǎn)要說(shuō)明費(fèi)用材料購(gòu)置標(biāo)品、分子生物學(xué)試劑等4000測(cè)試化驗(yàn)毒素活性、含