聚丙烯酰胺凝膠電泳(ppt)課件

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳(ppt)（優(yōu)選）聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下合成。 聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。 電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）分子篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的 大小形狀不同所致）3、原理（1）丙烯酰胺結(jié)構(gòu)式（2）亞甲雙丙烯酰胺PAGE 的 聚 合需要催化劑氧化還原系統(tǒng)作用，使Acr單體帶有游離基，從而與Bis進(jìn)行聚合。（1）化學(xué)聚合：AP-TEMED系統(tǒng)過(guò)硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium persulfate，AP）作為催化劑，四甲基乙二胺（TEME

2、D）為加速劑。AP在水溶液中能產(chǎn)生游離基SO42-，使丙烯酰胺單體的雙鍵打開(kāi)，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游離Acr和Bis作用就能聚合形成凝膠。TEMED的游離堿基能促進(jìn)AP的形成SO42- 。注意： TEMED量多少都會(huì)影響催化作用，須在堿性條件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，須去除分子氧，隔絕氧 升高溫度能提高聚合，降低溫度能延遲聚合（2）光聚合：核黃素-TEMED系統(tǒng)核黃素（riboflavin）在光照下（可見(jiàn)光或紫外光）分解，其黃素部分被還原成無(wú)色型，但在有氧條件下無(wú)色型又被氧化成帶有游離基的黃素，其也能使Acr和Bis聚合形成凝膠。注意：分離膠的合成一般采用化學(xué)聚合。因?yàn)槿粲霉饩酆?/p>

3、，凝膠的孔徑受光照強(qiáng)度與時(shí)間的影響，導(dǎo)致孔徑大小不同，從而影響蛋白質(zhì)的分離。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（native）變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）（根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量、形狀、電荷來(lái)分離蛋白質(zhì)）（根據(jù)亞基分子量分離蛋白質(zhì)）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 概述1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn進(jìn)一步完善。 他們發(fā)現(xiàn)樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑（SDS）以后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視?；驹?.蛋白質(zhì)分子的解聚 (1)SDS（十二烷基硫酸鈉，sodium dodecyl sulfate, SDS)陰離子去污劑變性劑助

4、溶性試劑斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵分子去折疊破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)(2)強(qiáng)還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。實(shí)驗(yàn)原理-SDS和還原劑的作用：（1）分子被解聚成組成它們的多肽鏈（2）氨基酸側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束；蛋白質(zhì)-SDS膠束所帶的負(fù)電荷達(dá)到超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)-SDS膠束的特點(diǎn)：（1）形狀像一個(gè)長(zhǎng)橢圓棒（2）短軸對(duì)不同的蛋白質(zhì)亞基-SDS膠束基本上是相同的（3）長(zhǎng)軸的長(zhǎng)度則與亞基分子量的大小成正比。 膠束在SDS系統(tǒng)中的電泳遷移率主要取決于

5、橢圓棒的長(zhǎng)軸長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。 2.凝膠濃度的選擇 由于SDS電泳分離并不取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，只取決于分子解聚后SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物的大小，因此凝膠濃度的選擇會(huì)直接影響分辨率。 不同分子量范圍的蛋白質(zhì)應(yīng)選用不同的凝膠濃度。 蛋白質(zhì)的分子量在15-200 kD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，因此SDS不僅可以分離鑒定蛋白質(zhì)，還可以根據(jù)遷移率的大小測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量。PAGE的濃度與孔徑的關(guān)系PAGE孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的濃度決定?？梢愿鶕?jù)要分離物質(zhì)分子的大小，選擇合適的單體濃度。Acr/Bis：2040 完全透明且有彈性； 10 很脆，易碎

6、，不透明； 100 糊狀不成形，易破碎。凝膠總濃度T 100ml凝膠溶液中含有Acr和Bis的總克數(shù)。 T=（a+b）/m100%T越大，凝膠孔徑越小，適用于分離分子量較小的物質(zhì)。T越小，凝膠孔徑越大，適用于分離分子量較大的物質(zhì)。CBis占單體與交聯(lián)劑總量的百分比。 C=b/（a+b）100%當(dāng)T固定時(shí)，Bis濃度在5%時(shí)孔徑最小。3、分類按具體操作分 垂直板形電泳 圓盤(pán)電泳按凝膠系統(tǒng)的均勻性分 連續(xù)PAGE 不連續(xù)PAGE 電泳體系中所用的緩沖液成分、pH、凝膠濃度相同緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度呈不連續(xù)性不連續(xù)的凝膠電泳體系對(duì)樣品的分離效果好，分辨率高，是最常用的體系。電荷效應(yīng)

7、分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)：不連續(xù)性所致連續(xù)電泳不連續(xù)電泳PAGE電荷效應(yīng)分子篩效應(yīng)不連續(xù)SDS 1.原理凝膠的不連續(xù)性緩沖離子的不連續(xù)性 pH的不連續(xù)性電位梯度的不連續(xù)性分離膠pH8.9濃縮膠pH6.7 凝膠的不連續(xù)性： 濃縮膠：大孔徑。樣品在其中濃縮，并按遷移率遞減的順序逐漸在其與分離膠的界面上積聚成薄層。 分離膠：小孔徑。蛋白質(zhì)分子在大孔膠中受到的阻力小，移動(dòng)速度快，進(jìn)入小孔膠時(shí)遇到的阻力大，遷移速度減慢。由于凝膠的不連續(xù)性，在大孔膠和小孔膠界面處就會(huì)使樣品濃縮，取帶變窄。 緩沖離子的不連續(xù)性 pH的不連續(xù)性 電位梯度的不連續(xù)性制膠緩沖液：Tris-HCl 濃縮膠 pH6.7 分離膠pH8.9電

8、泳緩沖液：Tris-甘氨酸 在濃縮膠中，pH環(huán)境呈弱酸性，甘氨酸解離少，在電場(chǎng)作用下泳動(dòng)效率低，而Cl卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子介于二者之間泳動(dòng)。 由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)度成反比，這一區(qū)帶形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。 樣品進(jìn)入分離膠（pH8.9）后，由于膠中pH的增加，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨Cl-之后，樣品不再受離子界面的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程凝膠制備樣品處理與加樣電泳剝膠與固定染色與脫色安裝電泳槽實(shí)驗(yàn)步驟一、制膠 1.配膠 配膠應(yīng)根據(jù)所測(cè)蛋 白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量范 圍選擇適宜的分離膠 濃度。由于SDS 有連續(xù)體系和不連續(xù) 體系兩種，

9、兩者各有 不同緩沖體系，因而 有不同的配制方法。（以不連續(xù)體系為例）蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量的范圍分離膠的濃度10420%30%1104410415%20%4104110510%15%110551055%10%51052%5%試劑名稱配制20ml不同濃度分離膠所需各種試劑用量/ml配制10ml濃縮膠所需試劑用量5%7.5%10%15%3%分離膠貯液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分離膠緩沖液（pH8.8Tris-HCl）2.502.502.502.50-濃縮膠貯液（10%Acr-0.5%Bis）-3.0濃縮膠緩沖液（pH6.8Tris-HCl）-1.2510% S

10、DS 0.200.200.200.200.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸餾水 11.8710.208.545.204.60混勻后，置真空干燥器中，抽氣10min10%AP0.100.100.100.100.052.分離膠的制備 膠灌至距梳子齒下端1cm灌畢封上一層水加速 聚合當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時(shí)表明聚合好。3.濃縮膠的制備 用濾紙吸干水倒入 濃縮膠插入梳子靜置，聚合。二、樣品處理與加樣 1.樣品處理 2.加樣 小心拔出梳子 上下槽 注入電極緩沖液 用 微量進(jìn)樣器點(diǎn)樣三、電泳 接上電泳儀，上槽為負(fù)極，下槽為正極。打開(kāi) 開(kāi)關(guān)，保持恒壓進(jìn)行電泳。 樣品 溶解 沸水浴 冷卻加樣樣品遷移方向樣品溶解液 電泳過(guò)程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過(guò)濾中的一個(gè)帶孔膠粒。 不同分子量的蛋白質(zhì)在凝膠中運(yùn)動(dòng)示意圖混合樣品帶孔膠 按分子大小分離電泳方向 電泳 小分子大分子流程圖結(jié)果分析1.相對(duì)遷移率的計(jì)算 相對(duì)遷移率mR =蛋白質(zhì)樣品距加樣端遷移距離(cm)溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離(cm)標(biāo)準(zhǔn)蛋白在SDS-凝膠上的示意圖 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以每條Marker帶的相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，相應(yīng)分 子量的對(duì)數(shù)