儀器分析講稿(第3章液相)ppt課件

1、第三章 高效液相色譜分析HPLC3.1高效液相色譜的特點一、定義：液相色譜法是指流動相為液體的色譜技術。高效液相色譜是20世紀70年代急劇開展起來的一項高效、快速的分別技術。液相色譜+氣相色譜實際+高壓泵、高效固定相+高靈敏檢測器。二、特點1.高壓: 可達150350105 Pa2.高速: 例，分別20種氨基酸，經(jīng)典色譜法要20多小時，用HPLC只需1小時.3.高效：3萬塔板/米GC2000塔板/米4.高靈敏度： 紫外檢測器10-9 g；熒光檢測器10-11g三、運用范圍 氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。對高沸點化合物、非揮發(fā)性物質(zhì)、熱不穩(wěn)定化合物、離子型化合物及高聚物的分別

2、、分析較為困難。致使其運用遭到一定程度的限制，據(jù)統(tǒng)計只需大約20%的有機物能用氣相色譜分析；而液相色譜那么不受樣品揮發(fā)度和熱穩(wěn)定性的限制，它非常適宜分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分別分析，大約占有機物的70 - 80%。 。 因此，高效液相色譜法，只需求試樣能制成溶液，而不需求氣化，不受試樣揮發(fā)性的限制。3.2影響色譜峰擴展及色譜分別的要素 與GC 比較65/1；根本概念及實際根底與GC一致；主要區(qū)別：流動相不同.液相色譜中對色譜峰擴展及色譜分別影響的要素：一、柱內(nèi)展寬1.渦流分散項 ： He = 2dp :填充不均勻因子；dp填充粒度直徑 高效液相色譜法

3、的固定相是高效填料，其顆粒直徑比氣相色譜法更小；且裝柱多采用勻漿法裝柱，填充很均勻， 變得很小，所以He值比較小。2.縱向分散項65/-1： Hd = CdDm/u； 當試樣分子在色譜柱內(nèi)被流動相帶向前時，由于分子本身運動所引起的縱向分散同樣引致色譜峰的擴展。由于分子在液體中的分散系數(shù)Dm比在氣體中小4-5個數(shù)量級，在LC中可忽略,GC中重要。 3、傳質(zhì)阻力項 組分分子在固定相與流動相之間傳質(zhì)緩慢引起部分不平衡，從而引起峰擴展。1固定相傳質(zhì)阻力項主要發(fā)生在液液分配色譜中 當流動相中的試樣分子分散進入到涂漬在載體外表的固定液內(nèi)進展質(zhì)量交換時，由于滲入固定液膜的深度不同，其前往到流動相中的時間也不

4、同，因此引起峰擴展。采取措施：1液-液分配色譜：薄的固定相層；吸附、排阻、離子交換色譜：小的顆粒填料。2采用分散系數(shù)大的液相固定相。3減小流動相的流速，改善傳質(zhì)。2流動相傳質(zhì)阻力項(二種方式:在流動的流動相中的傳質(zhì)和滯留的流動相中的傳質(zhì)) i.流動的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hm 當流動相流經(jīng)色譜柱內(nèi)的填充物時，接近填充物顆粒外表的流速較慢，而流路通道中心的流速那么較快，挪動速度不一樣從而引起峰形變寬。 ii.滯留的流動相中的傳質(zhì)阻力項Hsm 由于固定相的多孔性能使流動相滯留在其微孔內(nèi)，微孔內(nèi)的流動相稱為滯留區(qū)流動相靜止形狀，不流動。當流動相中的試樣分子與固定相進展質(zhì)量交換時，必需先從流動相分散進入

5、到滯留區(qū)。假設固定相中微孔既小又深，那么滯留就越嚴重，傳質(zhì)就越慢，對峰擴展影響也越大。 由于柱內(nèi)色譜峰擴展所引起的塔板高度的變化可歸納為： H=A+B/u+Cu 由于B/u這一項可以忽略不計，影響柱效的主要要素是傳質(zhì)阻力項，高效液相色譜的方程可寫成： H=A+Cu 提高柱效的方法：1減小固定相的顆直徑，可明顯提高柱效；2降低流動相粘度或提高柱溫，可增大Dm；3在一定范圍內(nèi)減小流速，有利于于減小H；4提高裝柱技術，提高柱內(nèi)填充料的均勻性而減小A項。1. 固定相與裝柱方法的選擇： 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相 dp10m,5m目前運用最廣泛 首選化學鍵合相，勻漿法裝柱2. 流動相及其流速的選擇

6、： 選粘度小、低流速的流動相甲醇， 約1ml/min 3. 柱溫的選擇： 選室溫25左右HPLC法中分別條件的選擇HPLC與GC的H-u曲線見圖3-1：1兩者曲線外形類似，都有一個H最小值；2HPLC的H最小值比GC的最小值小一個數(shù)量級以上，柱效更高；3 HPLC的最正確流速u比GC的最正確流速u也小一個數(shù)量級以上。二、柱外展寬：指色譜柱外各種要素引起的峰擴展. a.柱前展寬：主要由進樣所引起；進樣方式：將試樣注入色譜柱的頂端濾塞上或注入進樣器的液流中。由于進樣器的死體積以及進樣時的液流擾動引起色譜峰不對稱和展寬。處理：試樣注入柱頂端中心點或填料中心12mm處。 b.柱后展寬：主要由接納、檢測

7、器流通池體積所引起.處理：銜接納的體積、檢測器的死體積應盡能夠小. 3.3高效液相色譜的主要類型及其分別原理類型：液-液色譜；液-固色譜；離子交換色譜；離子對色譜；離子色譜；空間排阻色譜一.液-液分配色譜法及化合鍵合相色譜 1.特點：a.流動相和固定相都是液體 b.兩相應互不相溶，有明顯的分界面 2.分別機制：試樣組分溶于流動相后,在固定相和流動相之間的相對溶解度存在差別，溶質(zhì)在兩相間進展分配。 K = cs/cm = kVm/Vs 分別的順序決議于分配系數(shù)的大小，分配系數(shù)大的組分保管值大.而且流動相的種類對分配系數(shù)有較大的影響. 3.處理固定液流失問題方法：1)采用正或反相色譜 a.正相液-

8、液色譜法：流動相的極性小于固定液的極性流疏固親；適用于分別極性物質(zhì) b.反相液-液色譜法：流動相的極性大于固定液的極性流親固疏；適用于分別非極性物質(zhì)2)采用化學鍵合固定相 化學鍵合固定相：將固定相上的各種不同有機基團經(jīng)過化學反響共價鍵合到硅膠擔體外表的游離羥基上，構成化學鍵合固定相.目前反相鍵合相色譜法，已成為高效液相色譜中運用最廣泛的一個分支。二.液-固色譜法或液-固吸附色譜法1.特點：流動相為液體，固定相為吸附劑。2.分別機制：根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進展分別。吸附作用大即分配系數(shù)大的組分，吸附劑對它的吸附力強，保管值就大,出峰晚，后出來.3.作用：a.適用分別相對分子質(zhì)量中等油性試樣。

9、b.對具有不同官能團的化合物和異構體有較高的選擇性。 缺陷：由于非線性等溫吸附常引起峰的拖尾景象. 三、離子對色譜法 1.特點：離子對色譜法對各種強極性的有機酸或有機堿的分別，分別效能高，分析速度快，操作簡便. 2.分別機制：將一種或多種與溶質(zhì)電荷相反的離子稱為對離子或反離子加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結合構成疏水型離子對化合物，從而控制溶質(zhì)離子的保管行為。 X+水相+ Y水相 X+Y有機相試樣離子X進入柱內(nèi)以后，與對離子Y生成疏水性離子對XY，后者在疏水性固定相外表分配或吸附。3.離子對色譜法分類正相離子對色譜法(極性固定相，非常性流動相反相離子對色譜法非極性固定相，極性流動相v如含

10、有對離子Y的甲醇水或乙腈水溶液?？梢姳９苤惦SKXY和Y-水相的增大而增大。4.運用：處理了以往難分別混合物的分別問題.如酸、堿和離子、非離子的混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、兒茶酚胺、生物堿及藥物的分別了。還可借助離子對的生成給試樣引入紫外吸收或發(fā)熒光的基團，提高檢測的靈敏度。四.離子交換色譜法 1.分別機制70/2；離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有一樣電荷的溶質(zhì)離子進展可逆交換，根據(jù)這些離子對交換劑具有不同的親和力而將它們分別。 3.a.分配系數(shù)D愈大，表示溶質(zhì)的離子與離子交換劑的相互作用愈強。 b.親合力高的，在柱中保管值就愈大.4.運用：a.凡在溶劑中可以解離的物質(zhì)。 b

11、.已勝利地分別氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等.五、離子色譜法 1.構成： 固定相:離子交換樹脂 流動相:電解質(zhì)溶液 檢測器:電導檢測器 主配件：抑制柱抑制流動相中強電解質(zhì)背景離子的干擾。 2. 流程圖：fig3-2雙柱型原理：離子交換原理(以分別陰離子為例。1)分別柱：離子交換(陰離子交換劑ROH + Na+Br-(待測) RBr- + Na+OH-交換RBr- + Na+OH (洗脫劑) ROH-+ Na+ Br-洗脫2)抑制柱:消除本底電導影響陽離子交換劑RH + Na+OH-(流動相) RNa+ + H2O RH + Na+Br-(流動相) RNa+ + H+Br-洗脫液(NaOH)轉(zhuǎn)化為低電導

12、的水，消除本底電導影響；待測離子(Br-)轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的酸(HBr)，提高檢測靈敏度。a.雙柱型：化學抑制型離子色譜法高電導洗脫液：陽離子用無機酸如HCl,陰離子用NaOH)； b.單柱型：非抑制型，用低電導的洗脫液(陰離子用苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽等稀溶液，陽離子用稀硝酸、乙二胺硝酸鹽稀溶液，不用抑制柱； 3.運用： 離子色譜法是目前獨一快速、靈敏和準確的多組分分析的方法因此得到廣泛注重和迅速開展。從無機和有機陰離子到金屬陽離子，從有機陽離子到糖類、氨基酸等均可用該法分析.六、空間排阻色譜法 1.固定相：凝膠 2.機制73/-9：類似于分子篩作用，分別只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流膂力學體

13、積和分子大小有關.排阻法是建立在分子大小的根底上的。組分中太大的分子不能進入膠孔而遭到排阻，先出峰；組分中太小的分子可以進入一切膠體微孔中，最后出峰。洗脫次序?qū)⑷Q于相對分子質(zhì)量的大小，相對分子質(zhì)量大的先洗脫，相對分子質(zhì)量小的后洗脫。分子的外形也對保管有重要的作用。3.分別表示圖，fig3-3 a.排斥極限A點74/2;3: b.全浸透極限B點74/2;6: 相對分子質(zhì)量介于上述 兩個極限之間的化合物， 將按相對分子質(zhì)量降低的 次序被洗脫而可以分別. 4.特點75/2;3:1試樣色譜峰全部在溶劑的保管時間前出峰。2用于分別相對分子質(zhì)量大的化合物約為2000以上；3只能分別相對分子質(zhì)量差別在10

14、%以上的分子。3.4 液相色譜法固定相 色譜柱是色譜法的心臟，固定相及裝柱技術是關鍵.一、液-液色譜法、鍵合相色譜法及離子對色譜法固定相1.全多孔型擔體：直徑小于10m,由nm級的硅膠微粒堆聚而成為5m直徑的全多孔型擔體。顆粒小，柱效高。2.表層多孔型擔體：直徑為3040m的實心核(玻璃微珠)，表層上附有一層厚度約為12 m的多孔硅膠，填柱容易，重現(xiàn)性好，但試樣容量低。目前510m直徑是運用最廣泛的高效填料。3.化學鍵合固定相P76及P69 定義：用化學反響的方法經(jīng)過化學鍵把有機分子結合到擔體外表. 化學鍵合固定相根據(jù)在硅膠外表的化學反響不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型Si-O-C)；硅氧硅

15、碳鍵型Si-O-Si-C);硅碳鍵型Si-C)；硅氮鍵型Si-N)。硅烷化反響：化學鍵合固定相的特點：1外表沒有液坑，比普通液體固定相傳質(zhì)快得多；2無固定液流失，添加了色譜柱的穩(wěn)定性和壽命；3可以鍵合不同的官能團，能靈敏地改動選擇性，運用于多種色譜類型及樣品的分析；4有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的搜集。分別機制77/2：既不是全部吸附過程，亦不是典型的液-液分配過程，而是雙重機制兼而有之，只是按鍵合量的多少而各有偏重.二、液-固吸附色譜法固定相 目前較常用5-10m的硅膠微粒全多孔型.三、離子交換色譜法固定相 1.薄膜型離子交換樹脂，以薄殼玻珠為擔體，外表涂1%離子交換樹脂.

16、 2.離子交換鍵合固定相：用化學反響將離子交換基團鍵合在惰性擔體外表。 a.鍵合薄殼型：擔體，薄殼玻珠； b.鍵合微粒擔體型：擔體，微粒硅膠.四、排阻色譜法固定相 a.軟質(zhì)凝膠：葡萄糖凝膠；瓊脂糖凝膠；(水流動相,常壓) b.半硬質(zhì)凝膠：交聯(lián)聚苯乙烯凝膠；(有機溶劑，較高壓) c.硬質(zhì)凝膠：多孔硅膠；多孔玻珠；(高速)3.5 液相色譜法流動相1.重要性：GC載氣僅三四種，要提高柱效選擇性，主要是改動固定相的性質(zhì)； LC那么不同，當固定相選定時，流動相的種類，配比能顯著地影響分別效果，因此流動相的選擇很重要。2.選擇流動相應留意的要素79/2：5點， 選擇流動相的留意要素：1流動相的純度：普通是

17、采用分析純試劑，必要時需進一步純化，以除去干擾的雜質(zhì)。2應防止運用會引起柱效損失或保管值特性變化的溶劑。固定相不能吸附溶劑或與流動相互溶。3對試樣要有適宜的溶解度，否那么會在柱頭易產(chǎn)生沉淀。4溶劑的粘度小些為好，否那么會降低試樣組分的分散系數(shù)，呵斥傳質(zhì)速率緩慢，柱效下降。5應柱檢測器相匹配溶劑不能被相應的檢測器檢測出來3.溶劑的選擇79/-3： a. 根據(jù)：溶劑的極性是重要根據(jù)。 b.溶劑極性順序，水最大，煤油最小。 c.采用多元組合溶劑系統(tǒng)作為流動相底液和洗脫液底劑決議根本的色譜分別情況；洗脫劑那么調(diào)理試樣組分的滯留并對幾個具有選擇性的分別作用 d.根據(jù)不同的方法選擇適宜的底液和洗脫液 選用

18、溶劑的根據(jù)：溶劑的極性。正相色譜：底劑弱極性洗脫劑極性較強反相色譜：水主體有機溶劑調(diào)理劑。離子交換色譜：組分保管值經(jīng)過流動相的離子強度鹽的濃度和pH來控制。添加鹽的濃度，保管值降低；陽離子交換柱流動相pH添加，保管值添加，陰離子交換柱相反。排阻色譜：所用的溶劑必需與凝膠本身非常類似，這樣才干潤濕凝膠并防止吸附作用。3-6 高效液相色譜儀 high performance liquid chromatograph液相色譜儀2液相色譜儀3液相色譜儀43.6 高效液相色譜儀一、概述80/1：高效液相色譜儀普通都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提安裝、進樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。 二、

19、構造表示圖，fig3-4.三、部件引見 1.高壓泵壓力150 350105 Pa要求：a.流量要穩(wěn)定；80/-1b.壓力平穩(wěn)無脈動；81/2.c.對流速要有一定的可調(diào)范圍.81/4.動畫 類型： a .往復式柱塞泵是目前廣泛運用的恒流泵. 機理特點81/-2;6: 1)不受整個色譜體系中其他部分阻力稍有變化的影響，延續(xù)供應恒定體積的流動相； 2可方便地經(jīng)過改動柱塞沖程的大小或往復的頻率來調(diào)理流量； 3由于死體積小約0.1mL，改換溶劑方便，很適用于梯度洗提. 缺乏： 1輸出有脈激動搖，會干擾檢測器正常任務；2由于產(chǎn)生基線噪聲而影響檢測的靈敏度.b.氣動放大泵恒壓泵 原理： p1SA = p2S

20、B 其任務原理:這是一種恒壓泵。 特點82/-6: 1能供應無脈沖的穩(wěn)定流量的輸出. 2液缸體積大，改換流動相不方便； 3不便于梯度洗提. 4適宜勻漿法填裝色譜柱。2.梯度洗提梯度洗脫、梯度淋洗安裝82/ a.作用：與GC 中的程序升溫一樣.P22、23 b.定義83/1：所謂梯度洗提，就是載液中含有兩種以上不同極性的溶劑，在分別過程中按一定的程序延續(xù)改動載液中溶劑的配比和極性，經(jīng)過載液中極性的變化來改動被分別組分的分別要素，以提高分別效果。運用梯度洗提還可以使分別時間縮短，分辨才干添加，還可提高最小檢丈量和定量分析的精度。 外梯度低壓梯度：先混合后輸入色譜柱； 內(nèi)梯度高壓梯度：先泵入梯度混合

21、室再入色譜柱；3.進樣安裝 a.重要性83/1：進樣方式及試樣體積對柱效有很大影響.要獲得良好的分別效果和重現(xiàn)性，需求將試樣“濃縮地瞬間注入色譜柱入擔體的中心成一個點。 b.進樣方式 1注射器進樣安裝： 由于不能接受高壓，所以需用停流進樣方法，但該方式無法獲得準確的保管時間，峰形的重現(xiàn)性亦較差.2高壓定量進樣閥經(jīng)過進樣閥通常是六通閥直接向壓力系統(tǒng)內(nèi)進樣而不用停頓流動相的一種安裝fig3-7 a.進樣預備：1和6，2和3連通，試樣由5、4注入定量管；b.進樣：閥芯順時針旋轉(zhuǎn)600，這時1和2，3和4，5和6連通，試樣送入柱中.特點：進樣準確，重現(xiàn)性好，適于定量分析.4.色譜柱 a.參數(shù)：id，

22、4.6或3.9 mm； L=15-30cm； 填料顆粒度，5-10 m； n=5000-10000 b.開展趨勢 1減小填料粒度，3-5 m； 2減小柱內(nèi)徑， 1mm； c.裝填方式 1干法，填料粒度大于20 m； 2濕法勻漿法，粒度小于20 m；(生成勻漿，高壓裝柱5.檢測器 要求84/-1：具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、呼應快、現(xiàn)性范圍寬、適用范圍廣、對流動相和溫度動搖不敏感、死體積小等特點.a.紫外光度檢測器85/11原理，被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度關系遵守比爾定律2光路圖，圖3-8；3特點85/3；a.具有很高靈敏度； b. 對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗

23、提. 缺陷：不適用于對紫外光不吸收的試樣.4開展85-1；光電二極管211/1024個陣列檢測器. 紫外檢測器的重要進展； 光電二極管陣列檢測器：211/1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處置，三維立體譜圖，如下圖。光電二極管陣列檢測器b.熒光檢測器86/ 1原理：許多物質(zhì)，特別是具有對稱共軛構造的有機芳環(huán)分子受紫外光激發(fā)后，能輻射出比紫外光波長較長的熒光，某些不發(fā)射熒光的物質(zhì)亦可經(jīng)過化學衍生轉(zhuǎn)變成能發(fā)出熒光的物質(zhì)而得到檢測。 2光路圖：圖3-11； 3特點：熒光檢測器比紫外光度檢測器的靈敏度要高2個數(shù)量級。但線性范圍僅103，利用可調(diào)諧的激光作光源激光誘導熒光可使檢測靈敏度和準

24、確度都得到提高。熒光檢測器fluorescence detector 高靈敏度、高選擇性運用：對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有呼應 c.差示折光檢測器通用型87/1原理：借延續(xù)測定流通池中溶液折射率的方法來測定試樣濃度的檢測器。溶有試樣的流動相和純流動相之間折射率之差，表示試樣在流動相中的濃度。2類型：偏轉(zhuǎn)式；反射式3定量方法：偏轉(zhuǎn)式是利用丈量折射角偏轉(zhuǎn)值的大小來測定試樣的濃度。4特點88/-1：幾乎每種物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此都可用差示折光檢測器來檢測，好像GC中熱導池一樣，它是一種通用型的濃度檢測器。5缺乏89/1：a.對溫度變化敏感；

25、b.不能梯度洗提.d.電導檢測器89/ 1特點：是離子色譜法中運用最廣泛的檢測器. 缺乏：電導檢測器的呼應受溫度的影響較大，因此要求嚴厲控制溫度.2原理：利用物質(zhì)電離后產(chǎn)生的電導變化來測定電離物質(zhì)含量.參P723類型： a.兩電極電導檢測器用于低電導背景的抑制型離子色譜. b.五電極式電導檢測器90/用于單柱型離子色譜，它有效地消除了極化和電解效應的影響，在高背景電導下仍能獲得極低的噪聲程度，適用于單柱型離子色譜系統(tǒng)。5蒸發(fā)光散射檢測器蒸發(fā)光散射檢測器是一種通用型的檢測器，可檢測揮發(fā)性低于流動相的任何樣品，而不需求樣品含有發(fā)色基團。蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基

26、線穩(wěn)定，適宜與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。蒸發(fā)光散射檢測器已被廣泛運用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測。任務原理霧化：液體流動相在載氣壓力的作用下在霧化室內(nèi)轉(zhuǎn)變成細小的液滴，從而使溶劑更易于蒸發(fā)。液滴的大小和均勻性是保證檢測器的靈敏度和反復性的重要要素。蒸發(fā)：載氣把液滴從霧化室運送到漂移管進展蒸發(fā)。在漂移管中，溶劑被除去，留下微?；蚣?nèi)苜|(zhì)的小滴。檢測：光源采用650nm激光，溶質(zhì)顆粒從漂移管出來后進入光檢測池，并穿過激光光束。被溶質(zhì)顆粒散射的光經(jīng)過光電倍增管進展搜集。電信號的強弱取決于散射室中溶質(zhì)顆粒大小與數(shù)量。Step 1. Eluent is nebulized and

27、 small droplets are selected to minimize background noise.Step 2. Small droplets are evaporated at low temperatures to avoid loss of compounds. Step 3. The solute particles are focussed, using gas-supported focusing (GSF) for enhanced signal-to-noise ratios and less maintenance, and detect the light

28、 scattering Step 1: Nebulization Column effluent passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of dropletsStep 2: Mobile Phase Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remainStep 3: Detection Sa

29、mple particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and scatter light Photodiode detects the scattered light 3.7高效液相色譜分別類型的選擇90/1.應思索的要素： a.試樣的性質(zhì):分子質(zhì)量,化學構造極性,溶解度參數(shù)； b.色譜分別類型的特點及運用范圍； c.實驗室條件：儀器、色譜柱等.2.運用范圍 a.以分子量劃分 1低分子量，揮發(fā)性高的試樣用GC； 2分子量2002000的試樣規(guī)范LC； 3分子量大于2000空間排阻色譜法

30、； b.以試樣在溶劑中溶解情況劃分3.匯總table33 色譜分別方法的選擇:表3-33.8高效液相色譜法運用實例 HPLC更適宜于分別、分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、生理活性以及相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)； 因此已運用于核酸、肽類、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產(chǎn)物、生物大分子、外表活性劑、抗氧劑、殺蟲劑、除莠劑等分析中； 在化工、環(huán)保、臨床藥物等領域廣泛運用； 目前在生命科學中又顯示出其突出位置. 詳細仔細察看、分析P9197各圖.3.9 液相制備色譜97/ 1. 作用：制備色譜是以色譜技術來分別、制備較大量純組分的有效方法。 2.實現(xiàn)液相制備色譜主要問題： a.色譜柱的柱容量 b.液相制備

31、色譜方法 c.液相制備色譜儀3.10毛細管電泳 1.定義：在外加電場的影響下，帶電的膠體粒子或離子在分散介質(zhì)中作定向挪動的景象稱為電泳。 2.分類： a.毛細管區(qū)帶電泳； b.毛細管凝膠電泳； c.膠束電動力學毛細管色譜； d.毛細管等電聚焦； e.毛細管等速電泳； f.毛細管電滲色譜.本章作業(yè)：思索3,5，6,8題.本章學習終了.第三章思索題解答1.從分別原理、儀器構造及運用范圍上簡要比較氣相色譜及液相色譜的異同點。解：二者都是根據(jù)樣品組分與流動相和固定相互相作用力的差別進展分別的。從儀器構造上看，液相色譜需求添加高壓泵以提高流動相的流動速度，抑制阻力。同時液相色譜所采用的固定相種類要比氣相

32、色譜豐富的多，分別方式也比較多樣。氣相色譜的檢測器主要采用熱導檢測器、氫焰檢測器和火焰光度檢測器等。而液相色譜那么多運用紫外檢測器、熒光檢測器及電化學檢測器等。但是二者均可與MS等聯(lián)用。二者均具分別才干高、靈敏度高、分析速度快，操作方便等優(yōu)點，但沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)難以用氣相色譜進展分析。而只需試樣可以制成溶液，既可用于HPLC分析，而不受沸點高、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大的限制。2.液相色譜中影響色譜峰展寬的要素有哪些? 與氣相色譜相比較, 有哪些主要不同之處?解:液相色譜中引起色譜峰擴展的主要要素為渦流分散、流動的流動相傳質(zhì)、滯留的流動相傳質(zhì)以及柱外效應。在氣相色譜中徑向分散往往

33、比較顯著，而液相色譜中徑向分散的影響較弱，往往可以忽略。另外，在液相色譜中還存在比較顯著的滯留流動相傳質(zhì)及柱外效應。3. 在液相色譜中, 提高柱效的途徑有哪些?其中最有效的途徑是什么?解:液相色譜中提高柱效的途徑主要有:1.提高柱內(nèi)填料裝填的均勻性;2.改良固定相 減小粒度; 選擇薄殼形擔體; 選用低粘度的流動相; 適當提高柱溫其中,減小粒度是最有效的途徑.4. 液相色譜有幾種類型?它們的保管機理是什么? 在這些類型的運用中,最適宜分別的物質(zhì)是什么?解:液相色譜有以下幾種類型:液-液分配色譜; 液-固吸附色譜; 化學鍵合色譜;離子交換色譜; 離子對色譜; 空間排阻色譜等.液-固吸附色譜是經(jīng)過組

34、分在兩相間的多次吸附與解吸平衡實現(xiàn)分別的.最適宜分別的物質(zhì)為中等相對分子質(zhì)量的油溶性試樣，凡是可以用薄層色譜分別的物質(zhì)均可用此法分別。其中;液-液分配色譜的保管機理是經(jīng)過組分在固定相和流動相間的多次分配進展分別的?？梢苑謩e各種無機、有機化合物?；瘜W鍵合色譜中由于鍵合基團不能全部覆蓋具有吸附才干的載體,所以同時遵照吸附和分配的機理,最適宜分別的物質(zhì)為與液-液色譜一樣。離子交換色譜和離子色譜是經(jīng)過組分與固定相間親合力差別而實現(xiàn)分別的.各種離子及在溶液中可以離解的物質(zhì)均可實現(xiàn)分別，包括無機化合物、有機物及生物分子，如氨基酸、核酸及蛋白質(zhì)等。在離子對色譜色譜中,樣品組分進入色譜柱后,組分的離子與對離子

35、相互作用生成中性化合物,從而被固定相分配或吸附進而實現(xiàn)分別的.各種有機酸堿特別是核酸、核苷、生物堿等的分別是離子對色譜的特點?？臻g排阻色譜是利用凝膠固定相的孔徑與被分別組分分子間的相對大小關系,而分別、分析的方法。最適宜分別的物質(zhì)是：另外尚有手性色譜、膠束色譜、環(huán)糊精色譜及親合色譜等機理。5. 在液-液分配色譜中，為什么可分為正相色譜及反相色譜？解：采用正相及反相色譜是為了降低固定液在流動相中的溶解度從而防止固定液的流失。6.何謂化學鍵合固定相?它有什么突出的優(yōu)點?解:利用化學反響將固定液的官能團鍵合在載體外表構成的固定相稱為化學鍵合固定相.優(yōu)點:固定相外表沒有液坑,比普通液體固定相傳質(zhì)快的多. 無固定相流失,添加了色譜柱的穩(wěn)定性及壽命.可以鍵合不同的官能團,能靈敏地改動選擇性,可運用與多種色譜類型及樣品的分析.有利于梯度洗提,也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的搜集.7. 何謂化學抑制型離子色譜及非抑制型離子色譜?試述它們的根本原理.解:在離子色譜中檢測器為電導檢測器,以電解質(zhì)溶液作為流動相,為了消除強電解質(zhì)背景對電導檢測器的干擾,通常除了分析柱外,還添加一根抑制柱,這種雙柱型離子色譜法稱為化學抑制型離子色譜法.但是假設選用低電導的流動相如10- 5 10-4M的苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽，那么由于背景電導較低，不干擾樣品的檢測，這時