生物芯片-WarmSpringNight

1、生物芯片技術及其發(fā)展1生物芯片的定義生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細胞或組織的微點陣(microarray）。生物芯片包括DNA芯片、抗原芯片、抗體芯片、細胞芯片、組織芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g。2特點高度并行性：提高實驗進程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應液體積，提高樣品濃度和反應速率。自動化：降低成本，保證質量。3生物芯片分類尚未統(tǒng)一。廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片、組織

2、芯片4研究歷史1991 Affymatrix公司Stephen Fodor:光刻與光化學技術、 多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNA Chip概念 Stanford大學Brown實驗室：預先合成，機械手陣列1995 Schena等：基因表達譜1996 Chee et al：DNA測序1996 Cronin et al：突變檢測1996 Sapolsley & Lipshutz：基因圖克隆1996 Shalon et al：復雜DNA樣本分析1996 Shoemaker et al：缺省突變定量表型分析5分類（根據(jù)應用）基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖

3、譜)表達譜芯片腫瘤相關基因(正常與腫瘤組織表達差異)藥物篩選(培養(yǎng)細胞藥物刺激前后表達差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時期基因表達差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達差異)6分類（根據(jù)工藝和載體）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特異性較差，寡聚核苷酸合成長度有限，且隨長度增加，合成錯誤率增高。成本較高，設計和制造較煩瑣費時。DNA微矩陣法：成本低，易操作，點樣密度通常能滿足需要。芯片的載體需表面緊質、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩陣芯片常用玻片為載體。7分類（根據(jù)DNA成分）寡聚核苷酸或DNA片段：約2025個核苷酸堿基，常用于基因類型的分析，如突變、正常變異（

4、多態(tài)性）。全部或部分cDNA：約5005000個核苷酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的相關基因表達分析。8基因芯片的種類Science Chip：生物分析和診斷。Nutri Chip：食物分析、轉基因、污染檢測。Leuko Chip：血液分析、病毒分析、HLA分析。Aqua Chip：水質分析。Secure Chip：含DNA的物質鑒定。Chromo Chip：基因分析和染色體序列。Prokaryo Chip：原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等。9生物芯片技術主要環(huán)節(jié)芯片制備：微點陣樣本制備：DNA提純、擴增、標記雜交：樣本與互補模板形成雙鏈檢測：共聚焦掃描，雙色激光數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索，RNA印

5、跡等。結果 10生物芯片分析1、測定過程應包括五個基本步驟：需解決的生物學問題樣本制備生物化學反應檢測數(shù)據(jù)分析112、生物學系統(tǒng)控制必須精確地與檢測目的相匹配。3、生物學樣本必須精確地與生物學種類相匹配。4、所有基因分析必須平行處理。5、基因分析技術必須適合微型化和自動化。6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學樣本的次序。7、檢測系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。8、檢測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復。129、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應受到單 個實驗所固有特性的限制。10、絕對比例關系只存在于組合實驗的平 行數(shù)據(jù)組內。11、平行格式包括內在和外部的整個系統(tǒng) 誤差的分析因素。12、在每個系統(tǒng)模塊中采集

6、到該系統(tǒng)所有 變量的四維數(shù)據(jù)時，才能稱為完成生 物系統(tǒng)平行基因分析。13生物芯片技術的12條原則只是一個基本框架。其術語的詳細定義和有關理論可參見14芯片制備原位合成法（in situ synthesis):又可分為原位光控合成法和原位標準試劑合成法。適用于寡核苷酸，使用光引導化學原位合成技術。是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。合成后交聯(lián)（post-synthetic attachment):利用手工或自動點樣裝置將預先制備好的寡核苷酸或cDNA樣品點在經特殊處理過的玻片或其他材料上。主要用于診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度芯片的制備。15兩種制備方法比較原位合成：測序、查明點

7、突變高密度、根據(jù)已知的DNA編制程序制作復雜、價格昂貴、不能測定未知DNA序列合成后交聯(lián)：比較分析制備方式直接和簡單，點樣的樣品可事先純化，交聯(lián)方式多樣，可設計和制備符合自己需要的芯片。中、低密度，樣品浪費較多且制備前需儲存大量樣品。16雜交是芯片技術中除方陣構建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對規(guī)則形成雙鏈反應。選擇雜交條件時，必須滿足檢測時的靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補模板雜交。合適長度的DNA有利于與探針雜交。溫度、非特異性本底等均會影響雜交結果。最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。17樣本制備制備高質量樣本是困難的但又是極其重要的。制備細胞

8、、組織或整個器官樣本應特別小心。溫度、激素和營養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分等輕微改變都會使基因表達的結果發(fā)生明顯變化。用于基因類型分析的樣本是DNA，用于表達研究的樣本是cDNA。樣本制備后應進行標記，通常為酶標記、熒光標記和核素標記。18結果分析 芯片與標記的靶DNA或RNA雜交后，或與標記的靶抗原或抗體結合后，可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù)：共聚焦掃描儀：應用最廣，重復性好但靈敏度較低。質譜法：快速、精確，可準確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針合成較復雜?；瘜W發(fā)光、光導纖維、二極管方陣檢測、直接電荷變化檢測等。19芯片掃讀裝置根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD

9、型。根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光型。應用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應用廣泛。20圖象分析復雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成。分析軟件的功能：鑒定每個點陣、最大限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏色圖象、可標記或排除假陽性、識別和分析對照實驗是否成功、可將信號標準化等。圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù)據(jù)庫的能力。21質量控制實驗對照： 體外轉錄從cDNA合成mRNA，參入標本中作為對照。此mRNA不與點陣的核酸雜交。 將不同濃度的不同基因參入標本中，可作為標本間標準化的參照。 用兩種不同吸收光譜的熒光素同時分析兩個標本，如果兩

10、種熒光強度一致，可排除標本間變異因素。 用單一堿基錯配的寡核苷酸做對照可排除交叉雜交。 22結果有效性的證實在表達矩陣上，有時難于區(qū)分極其相似的序列，如基因族成員，亞類或異類的存在。比較兩種不同DNA序列表達水平時，有些參數(shù)如核苷酸的成分、二級結構的存在和矩陣上DNA的長度都會影響雜交。證實矩陣分析的結果可用RT-PCR(區(qū)別基因族成員,比較不同DNA種系表達,證實基因變異或突變和精確測定DNA表達水平)、Northern Blot(證實某一基因的相對表達水平)、Western Blot(RNA表達是否達到細胞中的蛋白水平)、質譜儀(證實矩陣結果是否在蛋白水平)等。23生物芯片技術的應用基因表

11、達分析：腫瘤基因突變檢測：遺傳性疾病測序、基因圖繪制和多態(tài)性分析：測序微生物菌種鑒定：毒力基因、抗藥基因藥物研究：新藥篩選、指導合理用藥克隆選擇及文庫篩選24生物芯片技術的發(fā)展發(fā)展趨勢微型化：DNA矩陣越來越小。集成化：矩陣上的基因組越來越大。多樣化：測定范圍越來越廣。微量化：測定所需樣本越來越少。全自動化：樣品制備到結果顯示全部分析過程。定量化：如激光捕獲技術，顯微解剖技術等可精確測定一個細胞內的一個基因的表達。DNA矩陣數(shù)據(jù)信息庫的完善。25生物芯片技術的發(fā)展技術毛細管電泳芯片技術PCR芯片技術(PCR-Chip)縮微芯片實驗室(lab-on-a-chip)微珠芯片技術(beadArray

12、)抗體和蛋白質陣列技術(Antibody and protein-array technology)自我定制芯片技術（make your own chip)血氣分析芯片26毛細管電泳芯片技術Mathies最早報道毛細管電泳芯片測序結果，在10分鐘內完成了對433個堿基序列的測定。賓夕法尼亞大學Wilding等成功地利用毛細管電泳芯片分離了用于診斷杜鑫-貝克肌萎縮的多條DNA片段。瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大學合作利用玻璃毛細管電泳芯片完成了對寡核苷酸的分離。27縮微芯片實驗室在一張芯片上完成樣品(如血液、組織等)制備、化學反應、檢測和數(shù)據(jù)分析。1998年程京博士首次應用

13、LOC實現(xiàn)了從樣品制備到反應結果顯示的全部過程，成果地從混有大腸桿菌的血清中分離出了細菌。含有加熱器、微泵微閥、微流量控制器、電子化學和電子發(fā)光探測器的芯片已經問世。也已出現(xiàn)樣品制備、化學反應和分析檢測部分結合的芯片。LOC與衛(wèi)星傳輸和網絡生物信息學結合，將實現(xiàn)高通量、一體化和移動性的“未來型掌上實驗室”的構想。28抗體和蛋白質陣列技術蛋白質組學(protiomics)的興起，促進了抗體和蛋白質陣列技術的發(fā)展。Pareick Brown使用特異性抗體微矩陣，測定了細胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋白質。Leuking等采用蛋白質微陣列技術，測定了10pg的微量蛋白質，并證實假陽性極低。29乳腺癌基

14、因芯片30Stanford 乳腺癌微矩陣(Perou et al.1999)每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個實驗用列表示。顏色強度表示對照和實驗cDNA的比率。比率相同時為1。結果為紅色表示mRNA增加，綠色表示減少，灰白色表示缺乏。兩種基因的相似性用Pearson相關公式或Euclidian測距公式計算。31DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達Kavine Maillard et al(1999)cDNAs進行DNA表達矩陣，PCR產物包被在經賴氨酸處理的玻片上，用Cys3-和Cys5-標記的cDNA進行雜交，洗滌后用Scanarray3000掃描儀測定矩陣，表達數(shù)據(jù)儲存在ACeDB數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)數(shù)據(jù)

15、表達類型區(qū)分不同的基因。32微矩陣分析DNA和蛋白表達Holger Eickhoff et al.(1999)根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合800000人類EST序列，已重矩陣了38000克隆用于RNA表達分析，克隆經PCR擴增后共價結合于玻片上，每張玻片固定19200個基因片段，標記人組織RNAs與被選的38000人基因片段的矩陣進行雜交，比較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點識別和點定量。使用寡聚核苷酸鑒定新的cDNA克隆，和進入表達載體，使相應蛋白能直接表達，矩陣后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的關系。33生物芯片相關儀器點陣儀：制備芯片。點樣針分為實心和空心兩種，點樣方式有非接觸噴點和接觸點

16、樣兩種。雜交儀：全自動完成調節(jié)、加探針、漂洗和熱循環(huán)的雜交過程。掃描儀：激光共聚焦或CCD直接成像分析結果。34微矩陣儀器介紹Q BotQ PixQ ArrayQ PetQ Soft 20003536Q Bot超高解析基因篩選暨排列分析儀。基因菌落篩選(Colony Picking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片全自動液體分注系統(tǒng)(Liquid Handling):96針，注液量1200l，適合PCR產物。分析軟件：分析、質控、上網。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網、陽極處理鋁板3738Q Pix半敞開式基因篩選暨排列分析儀(經濟型)基因菌落篩選(Colony Picking)：3500/h基因排列打點(Gridding)：100000/h基因復制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片分析軟件：分析、質控、上網環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網、陽極處理鋁板3940Q Array第三代半敞開式基因微矩陣排列儀。基因微矩