基因工程原理習(xí)題參考答案(共20頁(yè))

1、PAGE PAGE 32基因工程(jyn gngchng)原理習(xí)題集參考答案一、名詞(mng c)解釋(jish)1、DNA分子克隆技術(shù)：克隆，指含有單一的DNA重組體的無(wú)性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無(wú)性繁殖系的過(guò)程。DNA分子克隆技術(shù)也稱基因克隆技術(shù)，是在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程。其基本步驟包括：制備目的基因?qū)⒛康幕蚺c載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩選、鑒定擴(kuò)增和表達(dá)。載體在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝，有了這些與

2、親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)，另一種是cDNA庫(kù)。2、分子雜交：兩條不同來(lái)源的DNA（或RNA）鏈或DNA與RNA之間存在互補(bǔ)順序時(shí)，在一定條件下可以發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)形成雙螺旋分子，這種分子稱為雜交分子。形成雜交分子的過(guò)程稱為分子雜交。3、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：從不同個(gè)體制備的DNA，使用同一種限制性內(nèi)切酶酶切，切得的片段長(zhǎng)度各不相同。酶切片段的長(zhǎng)度可以作為物理圖譜或者連接圖譜中的標(biāo)記子。通常是在酶切位點(diǎn)處發(fā)生突變而引發(fā)的。4、報(bào)告基因：一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因,也就是說(shuō),是一個(gè)表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒

3、定的基因、5、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）：一種體外擴(kuò)增DNA的方法。PCR使用一種耐熱的多聚酶，以及兩個(gè)單鏈引物。以過(guò)高溫變性將模板DNA分離成兩條鏈。低溫退火使得引物和一條模板單鏈結(jié)合，然后是中溫延伸，反應(yīng)液的游離核苷酸緊接著引物從5/端到3/端合成一條互補(bǔ)的新鏈。而新合成的DNA又可以繼續(xù)進(jìn)行上述循環(huán)，因此DNA的數(shù)目不斷倍增。6、核酸的凝膠電泳：將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的摩擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中

4、的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極向正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠進(jìn)行染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ngDNA所形成的條帶。7、細(xì)菌轉(zhuǎn)化：所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致遺傳特性發(fā)生改變的過(guò)程。這種提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫做供體菌株，而接受轉(zhuǎn)化DNA的菌株則叫做受體菌株。大腸桿菌是使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)菌株。8、反義核酸：指與靶DNA或RNA堿基互補(bǔ)，并能與之結(jié)合的一段DNA或RNA。9、RNA interference：是一種進(jìn)化上保守的抵御轉(zhuǎn)基因或外

5、來(lái)病毒侵犯的防御機(jī)制。將與靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA 存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA 導(dǎo)入細(xì)胞后,能特異性地降解該mRNA ,從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失,這一過(guò)程屬于(shy)轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制范疇。10、Spi：噬菌體體重組(zhn z)克隆的一種篩選方法，其篩選方法是Spi+：不能感染(gnrn)E.coli(p2)； Spi-：(red- gam-)能感染E.coli(p2),形成小噬斑/host recA+/chi。包裝時(shí)若gam- ,需recA產(chǎn)物的作用才可形成噬斑(但為小噬斑)，所以對(duì)宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重組：載體改為red-/gam+可在recA-受體中增

6、殖。11、DNA文庫(kù)：將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。這些存在于所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫(kù)，它包含了該生物的所有基因。12、cDNA：cDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA。13、cDNA文庫(kù)：以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫(kù)。14、DNA探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列DNA，用以檢測(cè)未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應(yīng)用。15、轉(zhuǎn)導(dǎo)（作用）：借助于病毒載體，遺傳信息從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。16、染色體步移：通過(guò)相互重疊的基因組克隆之間進(jìn)行一連

7、串雜交從而實(shí)現(xiàn)染色體上基因的定位。17、斑點(diǎn)雜交：將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定后與探針進(jìn)行雜交。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析，一張膜上可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品。18、-complementation：質(zhì)粒載體重組克隆的篩選方法，LacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。LacZM15 ：放在F質(zhì)粒上，隨宿主傳代；LacZ ：放在載體上，作為篩選標(biāo)記。19、菌落原位雜交：將細(xì)胞從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂解以釋放出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測(cè)菌落雜交信號(hào)，并與平板上的菌落

8、對(duì)位。20、核酸原位雜交：標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交的方法。21、限制性內(nèi)切酶：識(shí)別DNA的特異序列，并在識(shí)別點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸內(nèi)切酶。22、酶切位點(diǎn)：DNA上一段堿基的特定序列，限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別出這個(gè)序列并在此將DNA酶切成兩段。23、DNA連接酶：催化(cu hu)DNA中相鄰的5/磷酸(ln sun)基與3/羥基(qingj)間形成磷酸二酯鍵，使DNA切囗封合，連接DNA片段。24、持家基因：是指對(duì)所有類型組織細(xì)胞在任何時(shí)候都需要其表達(dá)的基因，通常都是維持細(xì)胞基本生存所必須的基因，其表達(dá)常保持在固定的水平。又稱為組成性表達(dá)基因。25、奢侈基因：只在某特定

9、的細(xì)胞類型中表達(dá)或者說(shuō)只在發(fā)育階段的某些時(shí)期表達(dá)的基因叫做奢侈基因。26、Tm值：是反映DNA的熱穩(wěn)定性的一個(gè)參數(shù)，稱為DNA的熔解溫度，系指一半的雙鏈DNA解離成為單鏈時(shí)的溫度。27、分子標(biāo)記：廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的并可檢測(cè)的DNA序列或蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個(gè)以上基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點(diǎn)的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。狹義的分子標(biāo)記是指能夠用來(lái)作為指紋鑒定或區(qū)分個(gè)體特點(diǎn)的DNA片段。28、基因工程：指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的重新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)

10、穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)的過(guò)程。29、載體：是攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNA，它們一般是通過(guò)改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。30、衛(wèi)星DNA：又稱短串聯(lián)重復(fù)，26個(gè)核苷酸組成的重復(fù)單位串聯(lián)重復(fù)（1060次），兩側(cè)為特異的單拷貝序列，人類基因組中每10kbDNA序列至少有一個(gè)STR序列。31、多克隆位點(diǎn)：DNA中含有兩個(gè)以上密集的、能被多種限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割的位點(diǎn)區(qū)。32、定位克隆：也稱為圖位克隆，是在獲取基因在染色體上的位置信息后，采用各種實(shí)驗(yàn)方法對(duì)基因進(jìn)行克隆和定位。定位克隆包括定位和克隆兩個(gè)過(guò)程，定位是通過(guò)連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標(biāo)記在染色體上的位置，克隆是從定位

11、的染色體區(qū)段內(nèi)分離克隆所要的基因，并進(jìn)一步研究其功能。 也可以回答為“通過(guò)遺傳標(biāo)記”先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區(qū)域內(nèi)選擇已知基因，進(jìn)行突變的篩選，并獲得cDNA及全基因的過(guò)程。33、基因芯片：基因芯片又稱為DNA微陣列，以基因序列為分析對(duì)象的微陣列，是通過(guò)縮微技術(shù)，根據(jù)分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)。34、RT-PCR：是以RNA為起始材料經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲取目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)

12、。主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，克隆cDNA及合成cDNA探針，改造cDNA序列等。35、錨定PCR：用于在體外擴(kuò)增未知序列的DNA片段的方法，一般的PCR必須預(yù)先知道欲擴(kuò)增DNA片段兩側(cè)的序列，但人們經(jīng)常需要(xyo)分析一端序列未知的基因片段，可利用錨定PCR。該法的基本原理是在基因未知序列端添加同聚物尾，人為賦予未知基因末端序列信息，再用人工合成的與多聚尾互補(bǔ)的引物作為錨定引物，在與基因另一側(cè)配對(duì)的特異引物參與下，擴(kuò)增帶有同聚物尾的序列。錨定引物PCR對(duì)分析未知序列基因有特殊用途。36、反向PCR：常規(guī)PCR可擴(kuò)增位于兩個(gè)引物之間的DNA片段，但不能擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA序列，反向PCR則可

13、擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA片段，對(duì)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。其原理為：先用一種在目標(biāo)DNA區(qū)段上沒(méi)有識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶從距離目標(biāo)DNA一定距離的兩側(cè)位置切割DNA分子，然后將這些片斷進(jìn)行分子內(nèi)連接(linji)形成環(huán)，根據(jù)已知的目標(biāo)DNA序列按照向外延伸的要求設(shè)計(jì)一對(duì)向外引物，保證被擴(kuò)增的是目標(biāo)DNA區(qū)段兩側(cè)的未知序列。37、多重PCR：在同一反應(yīng)中采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常。多重PCR具有靈敏、快速的特點(diǎn)，特別適用于檢測(cè)單拷貝基因缺失、重排、插入等異常改變(gibin)，其結(jié)果與s

14、outhern blotting一樣可靠。38、質(zhì)粒：是染色體外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸（DNA）分子?，F(xiàn)在習(xí)慣上用來(lái)專指細(xì)菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做載體。39、粘粒載體：也叫柯斯質(zhì)粒，是一類人工構(gòu)建的含有DNA的cos序列和復(fù)制子的特殊特殊類型的質(zhì)粒載體。40、穿梭質(zhì)粒載體：是人工構(gòu)建的一類具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號(hào)，因而可以在兩種不同寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。41、基因突變：基因突變是指由于DNA堿基對(duì)的置換、增添或缺失而引起的基因結(jié)構(gòu)的變化，亦稱點(diǎn)突變。42、逆轉(zhuǎn)錄酶：在

15、體內(nèi)、外均能轉(zhuǎn)錄病毒性RNA成為DNA，稱為依賴RNA多聚酶，即為逆轉(zhuǎn)錄酶。分布在病毒的類核內(nèi)。逆轉(zhuǎn)錄酶與三種功能有關(guān)： 使RNA一DNA雜合雙鏈形成；切除雜合雙鏈中的RNA鏈；進(jìn)而再生成DNA一DNA的雙鏈。43、扣除雜交：就是用一般細(xì)胞的mRNA與特殊細(xì)胞的cDNA雜交，先扣除一般共有的cDNA，再將剩下的特異的cDNA進(jìn)行克隆，用此方法已成功克隆出控制動(dòng)物胚胎發(fā)育和組織分化的基因。44、測(cè)序酶 為修飾的T7 DNA polymerase，99%3-5外切活性被除去（Version1.0）；完全除去(V 2.0)；用于測(cè)序反應(yīng)(測(cè)序酶)。45、YAC載體(zit) 酵母人工染色體載體；含酵

16、母染色體復(fù)制(fzh)起點(diǎn)ori，自主復(fù)制(fzh)序列ARS；著絲粒（CEN）；兩個(gè)端粒（TEL）。用于克隆50kb以上甚至-Mb（200-500kb）。原生質(zhì)體電轉(zhuǎn)化，URA3-trp-ade2-1赭石突變酵母菌，紅色菌落插入失活。46、同尾酶 一類產(chǎn)生相同粘性末端的限制性內(nèi)切酶。47、cI篩選法 C基因發(fā)生突變時(shí)不能溶源化，C- ：在hflA（高頻溶源化）中形成噬斑。C+ 在hflA中形成溶源，產(chǎn)生混濁噬斑。48、Sanger測(cè)序 即酶法測(cè)序，用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過(guò)聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法。49、同裂酶：DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，產(chǎn)生相同粘

17、性末端，這類限制性內(nèi)切酶稱為同裂酶。50、復(fù)制起點(diǎn)：DNA復(fù)制的起始位點(diǎn)，DNA復(fù)制在起始位點(diǎn)處形成復(fù)制叉進(jìn)行雙向復(fù)制，通常DNA復(fù)制的起始DNA序列存在重復(fù)倒位序列。51、啟動(dòng)子：?jiǎn)?dòng)子是DNA分子可以與RNA聚合酶特異結(jié)合的部位，也就是使轉(zhuǎn)錄開(kāi)始的部位。在RNA合成開(kāi)始位點(diǎn)的上游大約10bp和35bp處有兩個(gè)共同的順序，稱為-10和-35序列。這兩個(gè)序列的共同順序如下,-35區(qū)“AATGTGTGGAAT”，-10區(qū)“TTGACATATATT”。大多數(shù)啟動(dòng)子均有共同順序(consensus sequence)，只有少數(shù)幾個(gè)核苷酸的差別。52、起始密碼子：AUG不僅是Met或者fMet(在原核

18、細(xì)胞)的密碼子，也是肽鏈合成的起始信號(hào)，故稱AUG為起始密碼子。53、起始因子： 在蛋白質(zhì)生物合成的起始階段與核糖體亞基結(jié)合，起始蛋白質(zhì)的合成。在E.coli中已分離出三種IF。IF1、IF2和IF3。其中，IF3具有形成三元復(fù)合物和解離因子活性，使70S核糖體顆粒解離為30S和50S亞基；IF2形成30S前起始復(fù)合物；IF1無(wú)特異功能，但具有加強(qiáng) IF2和IF3的活性作用。54、復(fù)制終點(diǎn)DNA復(fù)制的終止位點(diǎn)，DNA復(fù)制在起始位點(diǎn)處形成復(fù)制叉進(jìn)行雙向復(fù)制，在終止位點(diǎn)處終止DNA復(fù)制，通常DNA復(fù)制的終點(diǎn)DNA序列存在重復(fù)倒位序列。55、終止子：細(xì)菌DNA中有轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，稱為終止子。作用是在D

19、NA模板的特異位點(diǎn)處終止RNA的合成。在終止子處，RNA聚合酶停止其聚合作用，將新生RNA鏈釋出，并離開(kāi)模板DNA。56、終止密碼子：UAA、UAG和UGA為終止密碼子，不代表任何氨基酸，也稱為無(wú)意義密碼子。57、終止因子： 蛋白質(zhì)肽鏈合成的終止因子，在E.coli中已分離出三種釋放因子。RF1，RF2和RF3。其中，只有RF3與GTP(或GDP)能結(jié)合。它們均具有識(shí)別mRNA鏈上終止密碼子的作用，使肽鏈釋放，核糖體解聚。二、選擇(xunz)題參考答案1、B 2、B 3、C 4、C 5、B 6、C 7、B 8、C 9、B 10、C 11、C 12、C 13、D 14、B 15、C 16、D 1

20、7、B 18、C 19、B 20、D 21、D 三、填空題參考答案1、外顯子,內(nèi)含子,斷裂基因； 2、必須基因,非必須基因； 3、轉(zhuǎn)化,供體菌株,受體菌株； 4、變性(binxng)、退火、延伸；5、堿性(jin xn)磷酸酶，5磷酸；6、質(zhì)粒載體、 噬菌體載體、人工染色體載體。7、200-500kb， 10-215kb，平均100kb；8、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠，聚丙烯酰胺凝膠；9、切口平移法、隨機(jī)引物法；10 GAATTC， GGATCC，GATC ；11、RNA酶，RNA；12、小于10kb，9-23kb；13、 最快，最慢，居中。14、復(fù)制區(qū)，IG區(qū)。四、判斷題參考答案：1、錯(cuò)誤

21、2、錯(cuò)誤 3、錯(cuò)誤 4、錯(cuò)誤五、說(shuō)明題（下列各項(xiàng)在基因工程中的主要作用或功能）參考答案：1、電泳介質(zhì),用于分離大小相差1bp的DNA,或用于分離蛋白質(zhì)。2、用于制備單鏈DNA,因載體有單鏈絲狀噬菌體的IG區(qū),在幫助單鏈?zhǔn)删w的幫助下在宿主細(xì)胞中制備單鏈DNA。3、補(bǔ)齊DNA5端缺失的磷酸4、用于植物基因工程的轉(zhuǎn)化載體, 內(nèi)含T-DNA區(qū)。5、DNA合成底物。6、電泳介質(zhì),用于分離大DNA或RNA7、作為分子雜交用,用于篩選與探針同源的基因8、除去DNA5端的磷酸基,防止DNA重組時(shí)載體的自連9、安慰誘導(dǎo)物,結(jié)構(gòu)與別乳糖相似,用于誘導(dǎo)乳糖操縱元的表達(dá)10、生色劑，-半乳糖苷酶分解X-gal形成藍(lán)

22、色產(chǎn)物，用于互補(bǔ)或藍(lán)白斑篩選。六、問(wèn)答題參考答案：1、分子標(biāo)記是能夠用來(lái)作為指紋鑒定或區(qū)分個(gè)體特點(diǎn)的DNA片段。這種標(biāo)記在遺傳學(xué)研究和生物技術(shù)應(yīng)用方面具有非常重要的作用。分子標(biāo)記的基礎(chǔ)是個(gè)體間存在的自然遺傳變異，進(jìn)而造成許多遺傳序列的多態(tài)性，即這些序列在不同的個(gè)體表現(xiàn)不同。分子標(biāo)記就是通過(guò)查找和應(yīng)用這種變異對(duì)個(gè)體、性狀和基因在遺傳差異的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒別。 （1）限制性片段(pin dun)長(zhǎng)度多態(tài)性 這是發(fā)展最早的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理是檢測(cè)DNA在限制性內(nèi)切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以(ky)引起酶切位點(diǎn)發(fā)生變異的突變都可導(dǎo)致RFLP的產(chǎn)生。此技術(shù)包括以下基本步驟： DNA的

23、提取(tq)和純化；DNA的限制性內(nèi)切酶酶切；用凝膠電泳將DNA片段分開(kāi)；把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上；利用放射性標(biāo)記的探針與濾膜上的DNA片段進(jìn)行雜交以顯示特定的DNA片段，然后分析結(jié)果。（2）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA該技術(shù)用隨機(jī)引物非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段，然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分開(kāi)擴(kuò)增片段。其特點(diǎn)包括：不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也不需要預(yù)先知道序列信息；用一個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段，總的來(lái)說(shuō)RAPD在檢測(cè)多態(tài)性時(shí)是一種相當(dāng)快速的方法；技術(shù)簡(jiǎn)單，RAPD分析不涉及分子雜交、放射自顯影或其他技術(shù)；RAPD分析所需DNA樣品量少；RPD分析中存在的最大問(wèn)題是重復(fù)性不太高，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中條件的變化會(huì)引

24、起一些擴(kuò)增產(chǎn)物的改變。（3）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 其特點(diǎn)是把RFLP和PCR結(jié)合了起來(lái)。其基本步驟是：把DNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，然后選擇特定的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增（在所有的限制性片段兩端加上帶有特定序列的“接頭”），用接頭互補(bǔ)的但3/端有幾個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸的引物進(jìn)行特異PCR擴(kuò)增，只有那些與3/一端嚴(yán)格配對(duì)的片段才能得到擴(kuò)增，再在有高分辨率的測(cè)序膠上分開(kāi)這些擴(kuò)增產(chǎn)物，用放射性法、熒光法或銀染色法均可檢測(cè)之。（4）單核苷酸多態(tài)性技術(shù) 同一位點(diǎn)的不同等位基因之間常常只有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的差異，因此在分子水平上對(duì)單個(gè)核苷酸的差異進(jìn)行檢測(cè)是很有意義的。目前SNP作為一種新的分子標(biāo)記，已 有2000多

25、個(gè)標(biāo)記定位于人類染色體上，在植物上也在進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。2、類限制性核酸(h sun)內(nèi)切酶、類限制性核酸(h sun)內(nèi)切酶和類限制性核酸(h sun)內(nèi)切酶三類。類限制性核酶最適合基因工程，因?yàn)轭愊拗菩院嗣竷?nèi)切酶只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需MG2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識(shí)別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。類和類限制性核酸內(nèi)切酶由于切割序列是隨機(jī)的，與識(shí)別序列不統(tǒng)一，因此在基因工程中沒(méi)有什么價(jià)值。3、細(xì)菌通過(guò)對(duì)自身DNA上的識(shí)別序列進(jìn)行甲基化來(lái)保護(hù)自己的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。4、對(duì)于平末端DNA，右先連上工設(shè)計(jì)合成的EcoRI切割產(chǎn)生的脫氧寡核苷酸雙鏈接頭，然后再插入到EcoRI限制位點(diǎn)中去；也可

26、以將EcoRI的限制位點(diǎn)進(jìn)行改造，將粘性末端變成平末端后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。5、 6、重組DNA的主要步驟主要包括以下四個(gè)基本步驟： （1）目的基因的獲得； （2）目的基因與載體分子在體外進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組體； （3）將人工重組的DNA分子導(dǎo)入能進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞，從而得到復(fù)制； （4）重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇和篩選。7、重組DNA的主要步驟主要包括以下四個(gè)基本步驟： （1）目的基因的獲得； （2）目的基因與載體分子在體外進(jìn)行連接反應(yīng)，形成重組體； （3）將人工重組的DNA分子導(dǎo)入能進(jìn)行正常復(fù)制的寄主細(xì)胞，從而得到復(fù)制； （4）重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇和篩選。8、差異

27、克隆：利用來(lái)源不同DNA之間的表現(xiàn)度差異來(lái)分離差異表達(dá)基因的功能克隆方法。在任何組織中都表達(dá)的基因是管家基因，在大多數(shù)cDNA文庫(kù)中都出現(xiàn)。用一個(gè)來(lái)源的cDNA去除第二個(gè)來(lái)源中共同的RNA，留下獨(dú)特的RNA用于文庫(kù)構(gòu)建。9、基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其他載體分子中，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的重新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有(mi yu)這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)的過(guò)程。 基因工程是基因分子(fnz)水平上的遺傳工程，是一門能定向改造生物遺傳性狀的育種新技術(shù)。基因工程能使帶有各種遺傳信息的DNA片段越過(guò)不同生物間特異的細(xì)胞界限而組入到完全不同的生物體內(nèi)。定向地控制、修飾和改變

28、生物體的遺傳和變異，從而創(chuàng)造出自然界沒(méi)有或具有新的遺傳性狀的生物新品種。10、(1)具有多克隆位點(diǎn)； （2）能自我復(fù)制； （3）具有篩選(shixun)標(biāo)記；（4）在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。11、 (1)具有多克隆位點(diǎn)； （2）能自我復(fù)制； （3）具有篩選標(biāo)記；（4）在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。12、（1）cDDNA是指以mRNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成的互補(bǔ)DNA。以細(xì)胞的全部mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA組成的重組克隆群體稱為cDNA文庫(kù)。 基因組文庫(kù)指的是將某種生物的基因組DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞,進(jìn)行克隆得到的所有重組體內(nèi)的基因組DNA片段的集合,它包含了該生物的

29、所有基因。 （2）基因組文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的差別：基因組文庫(kù)中包含了甩有的基因，而cDNA文庫(kù)只包含表達(dá)的基因，缺乏內(nèi)元和調(diào)節(jié)序列，因此在研究基因結(jié)構(gòu)時(shí)沒(méi)有多大用處。cDNA文庫(kù)代表了mRNA的來(lái)源，其中一些特定的轉(zhuǎn)錄本豐富而另一些很少，所以存在豐度的差別；而基因組文庫(kù)在理論上均等地代表了所有基因序列。從不同細(xì)胞類型制備的cDNA文庫(kù)包含一些共同序列和獨(dú)特序列，可用于分離差別表達(dá)的基因；基因組文庫(kù)中不能。基因組文庫(kù)由于含有不表達(dá)序列，因此比cDNA文庫(kù)大。mRNA在不同的組織之間存在豐度的差異，因此cDNA文庫(kù)的在構(gòu)建時(shí)對(duì)于mRNA含量較少的就比較困難，而基因組文庫(kù)不存在這樣的問(wèn)題。13、（1

30、）抗生素抗性基因插入失活法； （2）一半乳糖苷酶基因失活插入法； （3）放射性標(biāo)記核酸探針雜交法。14、構(gòu)建cDNA文庫(kù)的主要步驟：mRNA分離； cDNA第一鏈合成； cDNA第二鏈合成 載體(zit)與cDNA的連接；噬菌體的包裝(bozhung)及轉(zhuǎn)染； cDNA文庫(kù)(wnk)的擴(kuò)增和保存。15、聚合酶鏈反應(yīng)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的的方法，因此也稱為基因的體外擴(kuò)增法。是20世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)。其應(yīng)用主要是以下幾個(gè)方面： （1）科學(xué)研究： 基因克隆；DNA測(cè)序；分析突變；基因重組

31、與融合；檢測(cè)基因的修飾；鑒定與調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的DNA序列；轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的繪圖；合成基因的構(gòu)建；構(gòu)建克隆或表達(dá)載體；檢測(cè)某基因的內(nèi)切酶多態(tài)性等。 （2）臨床診斷：細(xì)菌、病毒、螺旋體、支原體、衣原體、立克次氏體、分枝桿菌等病原體的鑒定；人類遺傳病的鑒定；診斷遺傳疾患；臨測(cè)臨床標(biāo)本中病原體的核酸序列；對(duì)法醫(yī)學(xué)標(biāo)本做遺傳學(xué)鑒定；分析激活癌基因中的突變情況；生成克隆化雙鏈DNA中的特異序列作為探針。16、（1）相同點(diǎn)：反應(yīng)的底物都是dNTP（dATP、dCTP、dTTP、dGTP）；都需要DNA聚合酶的催化，而且鏈的延伸都只能是5/3/方向；都需要模板，都按半保留復(fù)制機(jī)理進(jìn)行；都需要引物；都需要MG2

32、+催化。（2）不同點(diǎn)：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制，而PCR中，DNA是連續(xù)復(fù)制；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，不需要將雙鏈完全解開(kāi)形成單鏈，按半不連續(xù)方式進(jìn)行DNA的復(fù)制，而PCR反應(yīng)中，DNA雙鏈必須完全解鏈，復(fù)制過(guò)程都是連續(xù)進(jìn)行的；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，DNA的解鏈通過(guò)解鏈酶催化，而PCR反應(yīng)中是通過(guò)高溫使雙鏈解離；細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，引物是通過(guò)RNA聚合酶和成的RNA鏈，而PCR反應(yīng)中所需的引物是人工合成的寡聚核苷酸； 細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制時(shí)，溫度保持一致，而PCR反應(yīng)中，溫度在解鏈溫度、退火、延伸3個(gè)溫度之間變化。17、PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有六種，即引物、耐熱DNA聚

33、合酶、dNTPs（包括dATP，dCTP，dGTP，dTTP，是PCR反應(yīng)中靶DNA序列擴(kuò)增的原料）、模板DNA和緩沖液（通常含有MGCl2、Tris一HCl、KCl等）、MG2+（DNA聚合酶的激活劑）。18、很多載體都攜帶(xidi)一段細(xì)菌的lacZ基因，它編碼一半乳糖苷酶N一端(ydun)的146個(gè)氨基酸，稱為一肽，載體(zit)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞為lacZ15基因型，它表達(dá)一半乳糖苷酶的C一端肽鏈。當(dāng)載體與宿主細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩個(gè)片段時(shí)，宿主細(xì)胞才有一半乳糖苷酶活性，使特異的底物X一gal變?yōu)樗{(lán)色化合物，這就是所謂的一互補(bǔ)，而重組子由于基因插入使一肽基因失活，不能形成一互補(bǔ)，在含X一gal的

34、平板上，含陽(yáng)性重組子的細(xì)菌為無(wú)色菌落或噬菌斑。19、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)。20、原理：基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法一致，都是應(yīng)用已知核酸序列作為靶基因與互補(bǔ)的探針核苷酸序列雜交，通過(guò)隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析。具體講即是將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子或放射性同位素作為探針；然后按堿基配對(duì)原理將兩者進(jìn)行雜交；再通過(guò)熒光或同位素檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的信號(hào)做出比較和檢測(cè)，從而得出所需要的信息。 生物學(xué)研究的意義： （1）用于繪制基因缺失

35、圖譜和進(jìn)行基因表達(dá)分析； （2）用于基因突變研究； （3）用于病毒病原體的檢測(cè)和基因分型；（4）用于細(xì)菌檢測(cè)；（5）用于同細(xì)胞周期發(fā)育階段的cDNA作探針系統(tǒng)性地研究細(xì)胞中任意時(shí)期特異表達(dá)的基因；（6）能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL(zhǎng)發(fā)育階段的重要性；（7）基因芯片還可用于進(jìn)行基因診斷，可建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖；（8）用病人的可疑cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。21、管家基因是指所有類型組織細(xì)胞在任何時(shí)候都需要表達(dá)的基因。由于管家基因是生命活動(dòng)必需的基因，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，差異小，所以在基因芯片技術(shù)中根據(jù)各芯片的管家基因可以得出標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校

36、正；管家基因在所有的細(xì)胞中都有表達(dá)，因此有關(guān)管家基因的概念有助于分析差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，進(jìn)而進(jìn)行差異表達(dá)基因的克隆。通過(guò)管家基因，能比較不同樣本中某種mRNA的水平。在進(jìn)行基因分離時(shí)，可通過(guò)不同組織間基因的比較，扣除相同部分（管家基因）后得到差異表達(dá)基因，從而得到不同組織間基因表達(dá)。22、（1）用于鑒定啟動(dòng)子； （2）可以用以了解細(xì)胞中基因的表達(dá)情況，便于分析基因的調(diào)節(jié)； （3）在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因是否(sh fu)成功23、基本(jbn)步驟：組織與細(xì)胞的固定組織(zzh)和細(xì)胞雜交前的預(yù)處理探針的選擇及標(biāo)記雜交雜交結(jié)果的檢測(cè)。24、（1）RFLP標(biāo)記 DNA某一位點(diǎn)上的變異有

37、可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，包括原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長(zhǎng)度隨之發(fā)生變化。這種變化引起的多態(tài)現(xiàn)象即為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）。對(duì)RFLP的檢測(cè)主要是用southern雜交的方法進(jìn)行，即利用限制酶酶解及凝膠電泳分離不同生物體的DNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNA探針與之雜交，通過(guò)發(fā)射自影或非同位素顯色技術(shù)來(lái)揭示DNA的多態(tài)性。 （2）RAPD標(biāo)記 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA，用隨機(jī)短引物（人工合成的六核苷酸）進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的DNA區(qū)段是事先未知的，具有隨機(jī)性和任意性，因此隨機(jī)引物PCR標(biāo)記技術(shù)可用于對(duì)任何未知基因研究。 （3）ISSR

38、標(biāo)記 簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性。利用基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設(shè)計(jì)引物，無(wú)需預(yù)先克隆和測(cè)序。 （4）SSR標(biāo)記 簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性，又稱微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)目不等而出現(xiàn)的多態(tài)現(xiàn)象。 （5）STS標(biāo)記 序列標(biāo)定位置。染色體上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因組中只有一份拷貝的DNA短片斷，一般長(zhǎng)200500bp。STS標(biāo)記是根據(jù)單拷貝的DNA片斷兩端的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長(zhǎng)度為幾百bP的特異序列。（6）AFLP標(biāo)記擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性。通過(guò)對(duì)基因組DNA酶切片段的選擇性擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)DNA酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性

39、。AFLP揭示的DNA多態(tài)性是酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異。（7）CAPS標(biāo)記 是特異引物PCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNA標(biāo)記，當(dāng)SCAR或STS的特異擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時(shí)，一種補(bǔ)救辦法就是用限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后再通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯胺凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性，這種多態(tài)性稱為CAPS標(biāo)記。它揭示的是特異PCR產(chǎn)物DNA序列內(nèi)限制性酶切位點(diǎn)變異的信息，也表現(xiàn)為限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。（8）SNP標(biāo)記(bioj) 單核苷酸多態(tài)性。不同個(gè)體基因組DNA序列同一位置上的單個(gè)核苷酸的差別(chbi)。其比較的不是DNA的片段長(zhǎng)度，而是相同序列長(zhǎng)度里的單個(gè)堿基的差別。2

40、5、重組的類型(lixng)主要有以下幾種： （1）同源重組：重組對(duì)之間需要有同源性。調(diào)節(jié)這一過(guò)程的蛋白（如大腸桿菌中的RecA）不是序列專一性的，而是同源依賴的，經(jīng)常涉及長(zhǎng)的同源區(qū)域。Holliday模型可以用來(lái)解釋同源重組的分子機(jī)制。 （2）位點(diǎn)特異性重組：在能識(shí)別特定的核苷酸序列的重組酶作用下，DNA分子間的重組。噬菌體DNA的整合和切離是典型的位點(diǎn)特異性重組。調(diào)節(jié)這一過(guò)程的蛋白（位點(diǎn)特異性重組酶）在供體和受體分子中識(shí)別短的，特異DNA序列，這些蛋白之間的相互作用幫助重組。 （3）轉(zhuǎn)座重組：由于在轉(zhuǎn)座酶的作用下轉(zhuǎn)座因子插入染色體或切離染色體而產(chǎn)生的遺傳重組，重組對(duì)之間不需要同源性。如玉米

41、中的Ac一Ds雙因子系統(tǒng)，果蠅中的P因子等。 （4）異常重組：發(fā)生在彼此同源性很小或沒(méi)有同源性的DNA序列之間。按其機(jī)制主要分為兩類：末端連接是指斷裂的DNA末端彼此相連；鏈滑動(dòng)是指DNA復(fù)制時(shí)，由一個(gè)模板跳躍到另一個(gè)模板所引起的重組。 （5）不正常重組：重組對(duì)之間不需要同源性或少量同源性，是異常細(xì)胞作用的結(jié)果。包括復(fù)制中不正常的（但在錯(cuò)誤的地方發(fā)生）同源重組。 （6）人工重組：體外用純化的酶和底物進(jìn)行的DNA連接引起的重組。26、PCR是一種模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程,在有DNA模板、DNA聚合酶（常用TaqDNA聚合酶）、引物和4種dNTP的情況下，通過(guò)高溫變性一低溫退火一中溫延伸這樣反復(fù)循環(huán)

42、的過(guò)程，在體外擴(kuò)增特異性DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 特殊的PCR方法有：錨式PCR，可以用來(lái)快速分離cDNA末端（RACE）；反向PCR，可擴(kuò)增引物外側(cè)的DNA片段，對(duì)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究；多重PCR，在同一反應(yīng)中采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同的DNA片段，如果基因某一區(qū)段缺失，則相應(yīng)的電泳圖譜上此區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度減少或消失，從而發(fā)現(xiàn)基因異常；反轉(zhuǎn)錄PCR，先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。其他還有PCR，熒光PCR等。27、根據(jù)核酸(h sun)分子探針的來(lái)源及其性質(zhì)，探針的種類可分為四類： （1）基因組DNA探針(tn

43、zhn) 克隆化的各種基因片段是最常用的核酸(h sun)探針，因真核基因組存在高度重復(fù)序列，探針應(yīng)盡可能選用基因的編碼序列（外顯子），避免使用內(nèi)含子及其他非編碼序列，否則探針可能因高度重復(fù)序列的存在引起非特異性雜交而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。 （2）cDNA探針 與mRNA互補(bǔ)的DNA鏈稱cDNA，cDNA中不存在內(nèi)含子及其他高度重復(fù)序列，故特異性高，是一種較理想的核酸探針。 （3）RNA探針 RNA探針有以下優(yōu)點(diǎn)： RNA：RNA、RNA：DNA雜交體較DNA：DNA雜交體的穩(wěn)定性高；RNA單鏈不存在雙鏈DNA探針的互補(bǔ)雙鏈的復(fù)性，雜交效率高；RNA無(wú)高度重復(fù)序列，非特異雜交少；雜交后可以用RNas

44、e消化未雜交的RNA探針，可降低雜交本底。（4）寡核苷酸探針 人工合成的寡核苷酸片段作探針的優(yōu)點(diǎn)：可以根據(jù)需要合成相應(yīng)的序列，避免基因組DNA探針中高度重復(fù)序列所帶來(lái)的影響；多數(shù)長(zhǎng)為1530bp即使有一個(gè)堿基不配對(duì)也會(huì)影響雜交鏈的Tm值，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，可檢測(cè)出基因點(diǎn)突變；探針復(fù)雜性降低，雜交反應(yīng)時(shí)間較短。28、（1）非放射性標(biāo)記物主要有四類： 半抗原：如生物素、地高辛，可利用這些半抗原的抗體進(jìn)行檢測(cè)。配體：生物素是抗生物素蛋白卵白素和鏈霉菌類抗生物素蛋白的配體可用親和法檢測(cè)。熒光素：如羅丹明（一種熒光染料）等可被紫外線激發(fā)出熒光，用于檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光材料：有些標(biāo)記物與另一類物質(zhì)反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)

45、發(fā)光現(xiàn)象，能直接對(duì)x光片曝光。（2）優(yōu)點(diǎn)：安全、對(duì)環(huán)境(hunjng)和人體無(wú)害、其標(biāo)記物可反復(fù)使用，不存在半衰期問(wèn)題，其標(biāo)記的DNA探針保存在50%的甘油中，在一200C可保存(bocn)半年之久。（3）合成非放射性核酸(h sun)探針的方法主要有：異羥基毛地黃苷配基標(biāo)記DNA探針（地高辛配基系統(tǒng)）。DNA探針的生物素標(biāo)記。直接與核酸發(fā)生活性反應(yīng)、連接到核酸探針上的非放射性標(biāo)記物，如：光敏生物素；辣根不定期氧化物酶；堿性磷酸酶等，均可通過(guò)化學(xué)方法直接交聯(lián)到核酸探針上，雜交后再用相應(yīng)的方法，如抗原一抗體反應(yīng)、酶促反應(yīng)顯色等檢測(cè)。熒光素標(biāo)記核酸探針：根據(jù)探針標(biāo)記的性質(zhì)不同，雜交體可直接用熒光顯

46、微鏡觀察，或用酶組織化學(xué)法、免疫組織法檢測(cè)。29、濾膜雜交主要有： （1）southern blotting：特指DNA印跡雜交； （2）northern blotting：特指RNA印跡雜交； （3）dot blotting（斑點(diǎn)印跡）/slot blotting（狹線（縫）印跡）。例如：southern blotting（印跡法）基本流程：組織或細(xì)胞基因組DNA限制性內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移至濾膜預(yù)雜交加入探針雜交洗膜放射自顯影。30、足跡法研究RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別及結(jié)合末端標(biāo)記的DNA+RNA聚合酶用用DNA酶水解電泳放射自顯影，對(duì)照：DNA用DNA酶水解電泳放射自顯影，結(jié)

47、果：?jiǎn)?dòng)子部位受RNA聚合酶保護(hù)，不被降解；啟動(dòng)子功能的研究一啟動(dòng)子突變。使啟動(dòng)子的堿基序列發(fā)生變化或采用修飾堿基的方法，可以改變啟動(dòng)子的強(qiáng)弱。使啟動(dòng)子的功能減弱或消失下降突變，使啟動(dòng)子的功能增強(qiáng)上升突變。31、真核生物mRNA的3/端有一段poly（A）結(jié)構(gòu)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，A與T能形成堿基互補(bǔ)。32、在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能識(shí)別與切割序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。引起星星活性的因素：高濃度甘油（5%）；酶過(guò)量（100U/g）；低離子強(qiáng)度（25mM）；高Ph(8.0)；有機(jī)溶劑（二甲基亞砜（PMSD）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、 二甲基甲酰胺）；用其它二價(jià)陽(yáng)離子代替

48、Mg2+ （Mn2+ 、Cu2+、Co2+、 Zn2+）。33、Ipp：大腸桿菌強(qiáng)啟動(dòng)子（脂蛋白基因）lac：乳糖操縱元的啟動(dòng)子及操縱子 S：大腸桿菌分泌蛋白基因序列 MCS：多克隆位點(diǎn) Ipp：大腸桿菌(d chn n jn)強(qiáng)終止(zhngzh)子 lacI：乳糖(r tn)操縱元的調(diào)控基因 ori：質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn) ampr：抗氨芐青霉素(AmpR)的基因此載體的用途：作為大腸桿菌中的一個(gè)可調(diào)控的表達(dá)載體，可大量表達(dá)克隆的外源基因，并將蛋白分泌到細(xì)胞外。工作原理：將外源基因正確插入到克隆載體后，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。34、pBR322 ori：來(lái)源于pBR3

49、22載體的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)，此載體在宿主菌中能自主復(fù)制。 lacIq：來(lái)自于乳糖操縱元的調(diào)控突變基因，可產(chǎn)生大量調(diào)控蛋白。 Plac：來(lái)自于乳糖操縱元的啟動(dòng)子 lacO：來(lái)自于乳糖操縱元的操縱子g10 RBS：來(lái)自于g10基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列。6His：6個(gè)組氨酸的短肽序列，這些帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)能夠緊緊地同A蛋白柱結(jié)合，但很容易被EDTA溶液洗脫。從而可以一步完成大量蛋白質(zhì)的純化。MCS：多克隆位點(diǎn)，可以插入外源基因。rrnB：來(lái)自5SrRNA基因的終止子序列。此載體的用途：作為大腸桿菌中的一個(gè)可調(diào)控的表達(dá)載體，可大量表達(dá)克隆的外源基因，此蛋白帶有6個(gè)組氨酸的短肽序列，這些帶有組氨酸標(biāo)簽

50、的蛋白質(zhì)能夠緊緊地同A蛋白柱結(jié)合，但很容易被EDTA溶液洗脫。從而可以一步完成大量蛋白質(zhì)的純化。工作原理：將外源基因正確插入到克隆載體后，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，通過(guò)加入IPTG誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。35、（1）根據(jù)已知氨基酸序列和密碼子使用頻率及簡(jiǎn)并性，分別對(duì)氨基酸N端、C端和中間都取一定長(zhǎng)度的序列推出其mRNA。（2）再根據(jù)mRNA合成cDNA，并加上放射性標(biāo)記作為探針(猜測(cè)體探針)。（3）提取該物種的總DNA，用適合的酶切消化，選擇一種合適的載體與酶切消化DNA的片段連接，轉(zhuǎn)化宿主，篩選，構(gòu)建該物種的基因組文庫(kù)。（4）用3種探針?lè)謩e與文庫(kù)進(jìn)行原位雜交，篩選陽(yáng)性克隆，再用3種探針?lè)謩e與不同探針從文

51、庫(kù)中篩選的陽(yáng)性克隆雜交，陽(yáng)性克隆可能為該基因克隆。（5）將此陽(yáng)性克隆作序列分析對(duì)比，直到克隆到基因?yàn)橹?。七、分析題：參考答案：1、（1）PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn)，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新(chngxn)設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸