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文檔簡介

1、ICS 11.220CCS B 4135 福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 20262021口蹄疫病毒(O 型)抗體高敏熒光免疫分析操作規(guī)程Detection of foot and mouth disease virus (O type) antibody by hypersensitive fluorimetric immunoassay2021 - 11 - 23 發(fā)布2022 - 02 - 23 實施福建省市場監(jiān)督管理局發(fā) 布 DB35/T 20262021DB35/T 20262021I II 目次前言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語和定義14 縮 略語15 儀器與試劑16 口蹄

2、疫病毒(O 型)抗體高敏熒光檢測卡的制備27 檢測38 判定標(biāo)準(zhǔn)4附錄 A(規(guī)范性) 試劑的配制5附錄 B(資料性) 口蹄疫病毒(O 型)抗體高敏熒光檢測卡裝配示意圖6前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由福州海關(guān)提出并歸口。 本文件起草單位:福州海關(guān)技術(shù)中心、成都微瑞生物科技有限公司、廈門市翰均科檢測科技有限公司、上海德雨航生物科技有限公司、一品一碼檢測(福建)有限公司。 本文件主要起草人:鄭騰、張體銀、吳冠英、吳俊清、章鍵、謝向機、張志燈、唐寰

3、宇、林杰、王武軍、莊鍇、李宋鈺、邱金生。 DB35/T 20262021DB35/T 20262021 PAGE 5 PAGE 6 口蹄疫病毒(O 型)抗體高敏熒光免疫分析操作規(guī)程范圍本文件規(guī)定了鑭系高敏熒光免疫分析牛、羊、豬血清中的口蹄疫病毒(O型)抗體的操作規(guī)程。本文件適用于牛、羊、豬血清中口蹄疫病毒(O型)抗體水平的快速檢測。 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件, 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。 GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T 18

4、088 出入境動物檢疫采樣 GB 19489 實驗室 生物安全通用要求 NY/T 541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范 術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。 縮略語下列縮略語適用于本文件。 PVC:聚氯乙烯(polyvinylchloride) 儀器與試劑儀器高敏熒光分析儀。 5.1.2 移液器移液器(0.5 L10 L 和 10 L100 L)。 5.1.3 恒溫培養(yǎng)箱(20 25 和 37 1 )。 5.1.4 離心機(3 000 r/min 和 18 000 r/min)。 切條機。 劃膜噴金機。 試劑除另有規(guī)定外,所有試劑均為分析純,實驗用水應(yīng)符合 GB/T 6682 一

5、級水的要求。 高敏熒光納米微球。 N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽。 口蹄疫病毒(O 型)重組抗原。 1%聚乙烯醇。 牛血清白蛋白(BSA)。 雞卵黃抗體(IgY) 兔抗雞卵黃抗體/免疫球蛋白 G 抗體(IgY/IgG 抗體)。 碳二亞胺(EDC)。 硝酸纖維素膜。 2-N-嗎啡啉乙磺酸(MES)。 三羥甲基氨基甲烷(Tris)。 口蹄疫病毒(O 型)抗體高敏熒光檢測卡的制備檢測線和質(zhì)控線的包被把硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板上,采用劃膜噴金機在硝酸纖維素膜上噴涂已經(jīng)稀釋成0.5 mg/mL 的兔抗雞IgY/IgG抗體形成質(zhì)控線(C線),噴涂已經(jīng)稀釋成1.0 mg/mL的口蹄疫病毒(O型)重組抗原形成

6、檢測線(T線),噴量為均1 L/cm,然后在37 1 的溫度下烘制8 h。 硝酸纖維素膜的處理用封閉液(配制方法應(yīng)符合附錄A中的A.1)封閉硝酸纖維素膜30 min,用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(配制方法應(yīng)符合附錄A中的A.2)清洗硝酸纖維素膜30 min,室溫(20 25)干燥2 h后備用。 高敏熒光納米微球標(biāo)記雞 IgY將50 mg的高敏熒光納米微球加入到5 mL的2-N-嗎啡啉乙磺酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0)中,再加入10 mg碳二亞胺和10 mg N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽攪拌溶解,室溫(20 25 )反應(yīng)30 min后,在4 下,18 000 r/min離心10

7、min,取離心后沉淀物用50 mL硼酸緩沖液(pH 8.2,配制方法應(yīng)符合附錄A中的A.3)重懸,加入2 mg透析過的雞IgY,在室溫(20 25)下攪拌反應(yīng)24 h, 在4 下,18 000 r/min離心10 min,取離心沉淀物加入5 mL含0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行封閉,再加入5 mL樣品稀釋液(配制方法應(yīng)符合附錄A中的A.4)保存(2 8 )。 高敏熒光納米微球標(biāo)記口蹄疫病毒(O 型)重組抗原將50 mg的高敏熒光納米微球加入到5 mL的2-N-嗎啡啉乙磺酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.0)中,再加入10 mg碳二亞胺和10 mg N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽攪拌

8、溶解,室溫(20 25 )反應(yīng)30 min后在4 下,18 000 r/min離心10 min,取離心沉淀物用50 mL的0.05 mol/L硼酸緩沖液(pH8.2,配制方法應(yīng)符合附錄A中的A.3)重懸,加入2 mg透析過的口蹄疫病毒(O型)重組抗原,在室溫(20 25 )下攪拌反應(yīng)24 h,在4 下,18 000 r/min離心10 min,取離心沉淀物加入5 mL含0.5%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液封閉,再加入5 mL樣品稀釋液(配制方法應(yīng)符合附錄A中的A.4)保存(2 8 )。 標(biāo)記物墊的包被和處理將高敏熒光納米微球標(biāo)記的雞IgY抗體和口蹄疫病毒O型重組抗原,分別稀釋成0.1 g/mL

9、 和3 g/mL,采用點膜噴金機器噴涂在標(biāo)記物墊上,噴量為2.5 L/cm,然后在37 1 的溫度下烘8 h。 試紙條組裝PVC底板上從左到右依次粘貼樣品墊、標(biāo)記物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊,樣品墊的右端搭在標(biāo)記墊的左端上,標(biāo)記墊的右端搭在硝酸纖維素膜的左端上,吸水墊的左端搭在硝酸纖維素膜的右端上。將組裝好的PVC板切成5 mm寬試紙條(裝配圖見附錄B)。 試劑卡組裝將切割好的5 mm寬試紙條放于檢測卡的下蓋內(nèi),平攤后將檢測卡的上蓋扣緊,即可完成口蹄疫病毒(O型)抗體高敏熒光檢測試劑卡(簡稱試劑卡)的裝配。 檢測樣品采集與處理樣品的采集應(yīng)按照GB/T 18088或NY/T 541中的規(guī)定采集動物

10、血液3 mL5 mL。 樣品的處理靜置后的血液樣品在3 000 r/min下離心3 min,分離出的血清量應(yīng)不少于500 L。 樣品的保存待檢血清在2 8 下可保存48 h,在-20 條件下可以長期保存。 準(zhǔn)備所有操作均應(yīng)滿足 GB 19489 中的相關(guān)要求。 待檢血清和口蹄疫病毒(O 型)抗體高敏熒光檢測試劑卡試驗前應(yīng)平衡至室溫(20 25 )。 建立工作目錄,選擇檢測項目標(biāo)準(zhǔn)曲線。寫明檢測項目和檢測批號信息等信息。 相應(yīng)的稀釋管和檢測試劑卡按待檢血清順序編號標(biāo)識并有序排列。 樣品稀釋用樣品稀釋液將待檢血清按1:50稀釋。 加樣將平衡至室溫的口蹄疫病毒(O型)抗體高敏熒光檢測試劑卡置于潔凈平

11、坦的臺面上,在加樣孔內(nèi)滴加80 L已1:50稀釋的待檢血清,避光靜置15 min。 上機檢測加樣15 min后,將待測的口蹄疫病毒(O型)抗體高敏熒光檢測試劑卡插入高敏熒光分析儀檢測, 即時顯示并保存檢測結(jié)果。應(yīng)在5 min內(nèi)完成檢測。 結(jié)果計算以 B 代表高敏熒光分析儀檢測口蹄疫病毒(O 型)抗體標(biāo)準(zhǔn)品(或質(zhì)控品)溶液的 T/C 熒光比值。 以 B0 表高敏熒光分析儀檢測稀釋液的 T/C 熒光比值。 以一組口蹄疫病毒(O 型)抗體標(biāo)準(zhǔn)品的 B 與 B0 相減(BB0)熒光比值的對數(shù)為縱坐標(biāo),以口蹄疫病毒(O 型)抗體標(biāo)準(zhǔn)品的效價(或含量)的對數(shù)為橫坐標(biāo),線性回歸獲得“標(biāo)準(zhǔn)品效價(或含量)T/

12、C 熒光比值”相關(guān)的“標(biāo)準(zhǔn)曲線”。 高敏熒光分析儀通過檢測試劑卡樣本免疫反應(yīng)的“T”、“C”線的熒光強度,依據(jù)“標(biāo)準(zhǔn)曲線” 換算樣本中口蹄疫病毒(O 型)抗體效價(或含量)。 判定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)抗體效價1:16時,表示口蹄疫病毒(O型)抗體為陽性;當(dāng)抗體效價在1:8(含)至1:16間時, 結(jié)果為可疑,需要重新進(jìn)行一次試驗,如果仍然為可疑,建議判定為陰性;當(dāng)抗體效價1:8時,表示結(jié)果為陰性。 附 錄 A(規(guī)范性) 試劑的配制封閉液磷酸二氫鉀(KH2PO4,分析純),0.2 g;磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O,分析純),2.9 g;氯化鈉( NaCl,分析純), 8.0 g;氯化鉀( KCl, 分析

13、純), 0.2 g;牛白蛋白, 5.0 g;聚乙烯醇, 10.0 g。加水至1 000 mL,溶解后,調(diào)節(jié)pH值至7.5,保存于4 備用。 10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L PBS,pH7.5)磷酸二氫鉀(KH2PO4,分析純),0.2 g;磷酸氫二鈉(Na2HPO412H2O,分析純),2.9 g;氯化鈉(NaCl,分析純),8.0 g;氯化鉀(KCl,分析純),0.2 g。加水至1 000 mL,溶解后,調(diào)節(jié)pH值至7.4,保存于4 備用。 0.05 mol/L 硼酸緩沖液(pH8.2)0.2 mol/L硼酸溶液硼酸12.37 g加蒸餾水至1 000 mL,溶解混勻。0.05 mol/L硼砂(Na2B4O7)硼砂19.07 g加蒸餾水至1 000 mL,溶解混勻。溶液混合取A.3.1溶液87.50 mL和A.3.2溶液162.50 mL,兩種溶液混合均勻后加入750 mL水。 樣品稀釋液的配制硼酸,2.16 g;硼砂,1

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