DB35_T 1995-2021禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR診斷技術(shù)

1、ICS11.220CCSB 4135 福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 19952021禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量 PCR 診斷技術(shù)Fluorescence quantitative PCR diagnosis of fowl hydropercardium-hepatitis syndrome2021 - 08 - 17 發(fā)布2021 - 11 - 17 實(shí)施福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā) 布 DB35/T 19952021目次 HYPERLINK l _bookmark0 前言II1 范圍12 規(guī)范性引用文件13 術(shù)語(yǔ)和定義14 疫病概述15 設(shè)備、材料和試劑26 樣品的采集、保存和處理27 樣品中

2、病毒 DNA 提取38 熒光定量 PCR 操作步驟39 結(jié)果判定310 測(cè)序4附錄 A（規(guī)范性） 試劑的配制及引物序列5附錄 B（資料性） 擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列和熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線圖6I 前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。 本文件由福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。 本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、福州海關(guān)技術(shù)中心。 本文件主要起草人：施少華、陳珍、陳翠騰、葉洪、張?bào)w銀、鄭騰、黃瑜、朱春華、傅光華、程龍飛、萬(wàn)春

3、和、彭春香、劉榮昌、陳紅梅、傅秋玲。 II 禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR 診斷技術(shù)范圍本文件規(guī)定了禽心包積液-肝炎綜合征熒光定量PCR診斷技術(shù)的設(shè)備、材料和試劑，樣品的采集、處理和保存，樣品中病毒DNA的提取，熒光定量PCR操作步驟及結(jié)果判定的技術(shù)要求。 本文件適用于禽心包積液-肝炎綜合征的分子生物學(xué)診斷及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。 規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1禽心包積液-肝炎綜合征 fowl hydropercardium-hepatitis syndrome；HHS由禽腺病毒4型引起禽類的以心包積液、肝炎為特點(diǎn)的一種綜合征。 3.2禽腺

4、病毒 4 型 fowl adenovirus serotype 4；FAdV-4引起禽心包積液-肝炎綜合征的病原。 3.3循環(huán)閾值 cycle threshold；Ct 值熒光定量PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 疫病概述禽心包積液-肝炎綜合征（HHS），最早于1987年發(fā)生于巴基斯坦安卡拉地區(qū)。目前，該病呈現(xiàn)世界范圍分布，多個(gè)國(guó)家、地區(qū)相繼報(bào)道該病的發(fā)生，各地分離到的毒株略有差異，但大多為FAdV-4，且具有很強(qiáng)的致病性。2010年以來(lái)，我國(guó)多地發(fā)生了HHS，并從發(fā)病雞群中分離到FAdV-4。該病主要臨床特征為心包充盈，心包內(nèi)積有淡黃色液體或膠凍樣物；肝臟呈

5、現(xiàn)不同程度腫脹，質(zhì)地較脆、易碎，有出血斑或出血點(diǎn)；腎臟腫大、質(zhì)地較脆，有的呈現(xiàn)“花斑腎”。該病主要發(fā)生于35周齡肉雞，1020周齡蛋雞偶有發(fā)生，有報(bào)道鴨、鵝、鴿及野鳥也可發(fā)生該病。發(fā)病雞在4 d后開始死亡，死亡期可持續(xù)7 d 10 d，發(fā)病率和病死率分別為10%30%和20%75%。該病一年四季均可發(fā)生，以水平傳播為主，也可垂直傳播，感染雞排毒期可長(zhǎng)達(dá)9周，發(fā)病日齡越早，死淘率越高。 1 DB35/T 19952021設(shè)備、材料和試劑設(shè)備臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（轉(zhuǎn)速應(yīng)12 000 r/min）。 水浴鍋或金屬浴。 5.1.3 微量可調(diào)移液器（量程分別為 100 L1 000 L、20 L200 L

6、、2 L20 L、0.5 L 10 L）。 熒光定量 PCR 儀。 旋渦混合儀 材料和試劑棉拭子稀釋液：配比按照附錄 A 的 A.1。 組織稀釋液：配比按照附錄 A 的 A.2。 10% SDS 溶液：配比按照附錄 A 的 A.3。 3 mol/L 醋酸鈉緩沖液（pH5.2）：配比按照附錄 A 的 A.4。 75%乙醇：配比按照附錄 A 的 A.5。 熒光定量 PCR 檢測(cè)用引物和探針的序列、使用方法：配比按照附錄 A 的 A.6。 蛋白酶 K、Tris 飽和苯酚、酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）、無(wú)水乙醇：直接購(gòu)買成品使用。 Probe qPCR 試劑盒：應(yīng)與熒光定量 PCR 儀相配套的探

7、針 qPCR 試劑盒。 PCR 反應(yīng)管：與熒光定量 PCR 儀相配套的 PCR 反應(yīng)管。 陽(yáng)性對(duì)照：含 FAdV-4 目的基因片段的質(zhì)粒 DNA（拷貝數(shù)2.13104/L）。 陰性對(duì)照：Nuclease-free Water。 樣品的采集、保存和處理樣品的采集棉拭子樣品的采樣將棉拭子插入咽喉或泄殖腔旋轉(zhuǎn)35次，取出放入盛有1.0 mL棉拭子稀釋液的1.5 mL無(wú)菌離心管中。 組織樣品的采集無(wú)菌采集病禽有明顯病變的肝臟、脾臟等組織。 樣品保存樣品采集后應(yīng)保存在2 8 條件下，24 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。超過24 h的應(yīng)保存在-20 條件下， 且時(shí)間不應(yīng)超過7 d。如需長(zhǎng)期保存，須保存在-70 -80

8、條件下。 樣品的處理棉拭子樣品的處理取出棉拭子樣品，于旋渦混合儀上振蕩15 s，4 、5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。 2 DB35/T 19952021組織樣品的處理取組織樣品，按質(zhì)量體積比（1:5）加入組織稀釋液進(jìn)行勻漿，轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)菌離心管中，反復(fù)凍融23次后，4 、5 000 r/min離心10 min，取上清液備用。 樣品中病毒 DNA 提取常規(guī)方法提取 DNA取 540 L 上清液，先加 60 L 10% SDS 溶液后，再加蛋白酶 K 至終濃度 50 g/mL，于旋渦混合儀上混勻 15 s，置 56 孵育 2 h。 加入等體積 Tris 飽和苯酚，于旋

9、渦混合儀上混勻 15 s 后，置 4 、12 000 r/min 離心 15 min。 離心后吸取上清液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 無(wú)菌離心管（注意不要吸出中間層），加入等體積酚:氯仿: 異戊醇（25:24:1），顛倒混勻 15 s，靜置 5 min 后，置 4 、12 000 r/min 離心 15 min，吸取上清液轉(zhuǎn)至其他無(wú)菌離心管中。 7.1.4 重復(fù) 7.1.3 步驟 1 次。 加入相當(dāng)于上清液 1/10 體積的 3 mol/L 的醋酸鈉緩沖液（pH5.2）、2 倍體積的無(wú)水乙醇，顛倒混勻 15 s，-20 沉淀 2 h。 于 4 下 12 000 r/min 離心 15 min 后傾去上

10、清液，加入 800 L 75%乙醇溶解沉淀物，置 4 下 12 000 r/min 離心 5 min 后吸盡殘余液體；再以 75%乙醇溶解沉淀物 1 次，置 4 下 12 000 r/min 離心 5 min，吸盡殘余液體；置 4 下 12 000 r/min 離心 5 s 后吸盡殘余液體，室溫靜置 5 min。 加入 50 L 滅菌雙蒸水溶解沉淀物，冰浴備用。提取的 DNA 應(yīng)于 2 h 內(nèi)進(jìn)行熒光定量 PCR 或保存于-20 條件下。 商品化試劑盒提取 DNA病毒DNA的提取，也可采用商品化DNA提取試劑盒提取。 熒光定量 PCR 操作步驟在PCR反應(yīng)管中分別加入以下試劑：Probe qP

11、CR mix 10 L，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4 L， 探針引物FAdV-4-P 0.8 L，模板DNA 2.0 L，加Nuclease-free Water至總體積20 L，混勻，離心5 s。將PCR反應(yīng)管放入定量PCR儀，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 預(yù)變性2 min；95 變性10 s，60 退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；最后保存于4 。同時(shí)，設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各至少一個(gè)。 結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照有典型的擴(kuò)增曲線，且Ct值27；陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，且無(wú)Ct值；兩者均符合，方可判定檢測(cè)結(jié)果有效，見附錄B的B.1。 待檢樣品Ct值32時(shí)，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判為FAdV-4核酸檢測(cè)

12、陽(yáng)性，見附錄B的B.1。待檢樣品Ct值35時(shí)，或無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，判為FAdV-4核酸檢測(cè)陰性，見附錄B的B.1。 待檢樣品32Ct值35時(shí)判為可疑，應(yīng)重做；重做時(shí)待檢樣品Ct值32判為FAdV-4核酸檢測(cè)陽(yáng)性， 待檢樣品Ct值32判為FAdV-4核酸檢測(cè)陰性。 3 DB35/T 19952021測(cè)序必要時(shí)可對(duì)定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，參考序列參見附錄B的B.2。 4 DB35/T 19952021附 錄 A（規(guī)范性）試劑的配制及引物序列棉拭子稀釋液0.01 mol/L PBS緩沖液中添加青霉素（10 000 IU/mL）、鏈霉素（10 mg/mL）、慶大霉素（250 pg/mL） 和制霉菌素（

13、5 000 IU/mL），調(diào)節(jié)pH至7.27.4。 組織稀釋液0.01 mol/L PBS緩沖液中添加青霉素（2 000 IU/mL）、鏈霉素（2 mg/mL）、慶大霉素（50 pg/mL） 和制霉菌素（1 000 IU/mL），調(diào)節(jié)pH至7.27.4。 10% SDS 溶液稱量10 g十二烷基硫酸鈉，加入90 mL滅菌雙蒸水，小心攪拌，緩慢加熱至水溫在25 以上使之完全溶解。 3 mol/L 的醋酸鈉緩沖溶液取800 mL水加入408 g三水醋酸鈉，溶解后用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.2，加水定容到1 000 mL。 75%乙醇量取750 mL的無(wú)水乙醇加入250 mL的滅菌雙蒸水。 熒光定量 P

14、CR 檢測(cè)用引物序列熒光定量PCR檢測(cè)用引物序列為： 正向引物 FAdV-4-F：5-CCCGATCTCAGTCAAATT-3； 反向引物 FAdV-4-R：5-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3； 探針引物 FAdV-4-P：5-FAM-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3。 熒光定量PCR擴(kuò)增片段為196 bp，引物和探針用雙蒸水溶解至10 mol/L，保存于-20 備用。 5 DB35/T 19952021附 錄 B（資料性）熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線圖和擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線圖以建立的熒光定量PCR診斷技術(shù)對(duì)2份陽(yáng)性樣品和2份陰性樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果見圖B.1。 標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明： I-陽(yáng)性對(duì)照； N-陰性對(duì)照； 2-陽(yáng)性樣品； 3-陽(yáng)性樣品； 4-陰性樣品； 5-陰性樣品。 圖B.1 熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線圖擴(kuò)增產(chǎn)物參考基因序列選擇FAdV-4 GDMZ 株（ GenBank 的登錄號(hào)： MG8