分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作.質(zhì)粒提取小提質(zhì)粒小量快提質(zhì)粒鑒定：大提質(zhì)粒：.酶切制備型酶切小量酶切鑒定DNA片段5突出端的補(bǔ)平.瓊脂糖凝膠電泳.回收從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段小量膠回收DNA片段試劑盒操作見操作手冊(cè)無水乙醇沉淀回收.連接一股連接平端動(dòng)態(tài)連接.轉(zhuǎn)化質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化連接物轉(zhuǎn)化.制普通固體培養(yǎng)板.涂板.挑菌.血清中病毒核酸的提?。ǖ鞍酌窴法）哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株別離常用溶液、培養(yǎng)基配制.質(zhì)粒提取：小提質(zhì)粒：本實(shí)驗(yàn)室在常規(guī)條件下采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒(1)從平板上挑取單菌落或搖甘油菌(550uL),接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中加有相應(yīng)的抗生素，37c振蕩培養(yǎng)至OD2.0以上，但也無

2、需過濃。*通常DH5a菌株搖1214hr;JM10178hr;ER25661012hr*(2)取菌液于管可取未滅菌的新管中，12000rpm離心1530sec,棄上清。通常可取菌液再離心一次，棄去上清后在紙上扣干。不要忘記將用完的試管及管蓋放入指定處以備回收處理*(3)加入150uL溶液I,振蕩使菌體沉淀充分懸浮。務(wù)必懸浮完全*(4)加入150UL溶液II,立即輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解?？捎^察到原渾濁的菌懸液變清變粘*(5)加入180UL溶液出，立即上下顛倒充分混勻710次，不宜太劇烈?？捎^察到白色團(tuán)片狀沉淀出現(xiàn)。*(6)置冰浴10分鐘，也可置于-20C中5min。(7)12000rpm離心8

3、10分鐘。(8)在離心過程中可取未滅菌的新管，加入等體積(350400uL即可)酚-氯仿-異戊醇25:24:1董國(guó).；取出苗過色新管，加入2倍體積(780uL即可)的無水乙醇置于-20C黃川一。加酚-氯仿-異戊醇時(shí)要小心，應(yīng)吸位于下層的酚相，而不要帶入上層的Tris-cl保護(hù)液*(9)離心完將上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-異戊酉I中，充分混勻。小心不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中*(10)12000rpm離心45分鐘。(11)吸水相，加入已加好的無水乙醇中，顛倒混勻幾次。小心不要吸入酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些水相*(12)-20C放置515分鐘。(13)12000rpm離心10分鐘。(1

4、4)迅速棄上清，沉淀用適量70叱醇洗一次，于紙上扣干。小心不要將沉淀洗掉*(15)置于恒溫器上干燥(55C)至無色透明或無乙醇?xì)馕?，一般大約510min。(16)加入3040uL1XT逐沖液溶解沉淀，-20C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái).*1.2小量快提質(zhì)粒鑒定：目前較少采用(1)取培養(yǎng)的菌液1mL,12000rpm離心30s,收集菌體，在紙上扣干殘留培養(yǎng)液。(2)用50uL無菌水充分懸浮菌體。(3)每管加入50uL酚-氯仿-異戊醇25:24:1并充分混勻。(4)12000rpm離心10分鐘。(5)小心吸取5uL上清上樣電泳。(對(duì)于插入片段足夠大的重組子，其遷移率應(yīng)低于未插入片段的對(duì)照

5、質(zhì)粒。)*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*1.3大提質(zhì)粒：(1)從20C保存的甘油菌吸取50uL菌液，接種到34m出LB養(yǎng)基中，37c振蕩培養(yǎng)至O及0為。(2)取0.5mL菌液接種到200mLL盼養(yǎng)基中，37c振蕩培養(yǎng)至。聯(lián)。為以上，再加入氯霉素至170ug/mL,37c繼續(xù)振蕩培養(yǎng)1216hr。(3)將搖好的菌液4000rpm離心15min。(4)棄上清，敞開離心管口倒置，盡量讓上清全部流盡。(5)用預(yù)冷的40mLST沆分懸浮菌體沉淀。(6)4C,4000rpm離心10min。(7)棄上清，敞開離心管口倒置，讓上清全部流盡。(8)用預(yù)冷的4mLm夜I充分懸浮菌體沉淀。(9)加入新鮮配制的溶液n8m

6、L,上下顛倒幾次，液體會(huì)變得澄清，置于4c10min。(10)加入預(yù)冷的溶液出6mL,上下顛倒混勻后，4c中放置30min。(11)4C,12000rpm離心10min。(12)收集上清，加等體積的異丙醇，4c放置30min。(13)4C,10000rpm離心10min。(14)棄上清，用70%的乙醇洗沉淀一次，室溫吹干，溶于1mL1XTE中。(15)加50uLRNaseA,37c作用2小時(shí)。(16)加1mLM配制的13%的PEG8000液13%PEG80001.6MNaCl,充分混勻，4c放置30min。(17)4C,12000rpm離心15min。(18)吸去上清，用400uL1XTE溶解

7、沉淀。(19)力口1/4體積4MLiCl,室溫放置5min,12000rpm離心5min。(20)取上清，用酚、酚氯仿-異戊醇各抽提一次。(21)將水相轉(zhuǎn)入一新的Eppendof管中，加入1/10體積4MLiCl,2倍體積的無水乙醇,20C放置30min。(22)4C,12000rpm離心10min,去上清，70%的乙醇洗沉淀一次，室溫晾干。(23)加200uL1XTE溶解沉淀，測(cè)定質(zhì)粒DNA勺濃度后于20c保存?zhèn)溆谩?做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái).*2.酶切：制備型酶切：（1）在滅菌過的新0.5mLEppendorf管中加入以下成分混合：注意：酶切時(shí)酶要在最后才加，加酶時(shí)要用新的槍頭，動(dòng)作要迅速

8、，酶不要在空氣中暴露過久;要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲(chǔ)存管上裝酶的部位;用完后要蓋緊放回原處l罷川斷跑頊有回題時(shí)地愁.署理員.xxy二注意：酶切時(shí)用酶量不能過大，過大會(huì)影響酶切并且可能會(huì)有星號(hào)效應(yīng)。引起酶切效果不佳的原因一般多是質(zhì)粒沒有提好。除個(gè)別特殊位點(diǎn)或內(nèi)切酶外,酶切時(shí)間均不宜過長(zhǎng)。 TOC o 1-5 h z DN肉品30uL10X反應(yīng)緩沖液*6uLRnaseA34uLddH2O適量限制性內(nèi)切酶A1uL（限制性內(nèi)切酶B1uL）反應(yīng)總體積5070uL*為了保證酶切效率（至少在75%上），需選用合適的反應(yīng)緩沖液，不同公司的酶切反應(yīng)緩沖液基本上可以通用。但需注意有的要另外加BSA（10X

9、和100X的都有）。（2）37C反應(yīng)34小時(shí)（可依據(jù)所使用酶的需要，選用合適的酶切時(shí)間和溫度）。取12uL電泳鑒定。*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*小量酶切鑒定（1）在滅菌過的新0.5mLEppendorf管中加入以下成分混合：注意:酶切時(shí)酶要在最后才加,一一加酶時(shí)要用新的槍頭，動(dòng)作要迅速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲(chǔ)存管上裝酶的部位；用完后要蓋緊放回原處;一要用JSH或有回題時(shí):請(qǐng)我管理員.xxy.屋注意:酶切時(shí)用酶量不能過大，過大會(huì)影響酶切并且可能會(huì)有星一號(hào)效應(yīng)。引起酶切效果不佳的原因一般多是質(zhì)粒沒有提好。除個(gè)別特殊位點(diǎn)或內(nèi)切酶外，酶切時(shí)間均不宜過長(zhǎng).注意：做小量

10、酸切鑒定時(shí)要盡量選用.較為一廉價(jià)一的酶.DN肉品5uL10X反應(yīng)緩沖液*RNaseA0.5uLddH2O1限制性內(nèi)切酶A0.1uL（限制性內(nèi)切酶B0.1uL)反應(yīng)體積1520uL*請(qǐng)根據(jù)保證酶切效率（至少在75刈上）的需要選用合適的反應(yīng)緩沖液，不同公司的酶切反應(yīng)緩沖液基本上可以通用。但需注意有的要另外加BSA（10X和100X的都有）。（2）37C反應(yīng)23小時(shí)（可依據(jù)所使用酶的需要，選用合適的酶切時(shí)間和溫度取12uL電泳鑒定。*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*DN射段5突出端的補(bǔ)平：（1）在滅菌過的新0.5mLEppendorf管中加入以下成分混合：注意：酶要在最后才加，加酶時(shí)要用新的槍頭，動(dòng)作要迅

11、速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲(chǔ)存管上裝酶的部位；用完后要蓋緊放回原處；要用新酶或有問題時(shí)請(qǐng)找管理員xxy。欲處理的DNA羊品2ug10 xKlenowbuffer34uL10mMdNTP2uLddH2O適目.里DN麋合酶I（Klenow大片段）510U反應(yīng)體積30八-40uL（2）37C反應(yīng)1小時(shí)后，低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收。做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*3.瓊脂糖凝膠電泳：（1）制備凝膠：根據(jù)需要，在指定的三角瓶中配制50/100mL特定濃度的瓊脂糖凝膠。首先在電子天平上稱取一定量的瓊脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，加入100mL1XTAE再加入34uL澳化乙錠（EB）,

12、混勻，在微波爐中煮化（大約45min）,混勻后倒入插好樣品梳的凝膠槽中，凝固后備用。*澳化乙錠（EB有潛在的致癌性，操作時(shí)要戴手套，并且注意不要污染其它操作區(qū)*在微波爐中煮化時(shí)要小心不要讓凝膠暴沸*倒膠時(shí)不要倒太厚，一般可插入梳子5mme右即可*倒回收膠要使用專用的樣品梳和凝膠槽（2）待膠凝固后，小心拔去梳子，拔出時(shí)注意不要破壞膠孔。（3）用刀片切下所需的膠塊，放入加有足夠電泳緩沖液（1XTAE）的電泳槽中，緩沖液面高于凝膠外表35mnSP可。*注意電泳時(shí)使用的是 1XTAES沖液，而母液是50X的，配制時(shí)要留神*在放入凝膠要上樣前，最好 檢查一下樣品孔是否有破損泄漏，尤其 是上回收樣品之前

13、*（4）可在一干凈手套上點(diǎn)滴適量 （13uL）的3X澳酚蘭上樣緩沖液（卷綠魚），用槍移取適 量的樣品（110uL）與滴加好的澳酚蘭上樣緩沖液混合（可觀察到混合液變?yōu)?1魚）,再將混合液小心加入膠上的樣品孔中。*上樣要迅速準(zhǔn)確，上樣量不要過大以致漫出樣品孔*假設(shè)樣品要求無污染，可使用新的滅菌槍頭上樣*假設(shè)樣品無嚴(yán)格要求（如用來做小量酶切鑒定的樣品），可用一個(gè)槍頭多次上樣，但每次上樣前在電泳緩沖液中洗幾下* 接通電極進(jìn)行電泳，電壓一般可在140V200V。*注意要接對(duì)正負(fù)極，核酸是由負(fù)極向正極方向跑的*打開及關(guān)閉電泳儀時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注意，不要用沾染有EB的手套接觸電泳儀 *當(dāng)澳酚蘭遷移至足夠距離時(shí) （至

14、少1cm）,關(guān)閉電源，取出膠塊放到紫外燈下觀察。在紫外燈下觀察時(shí)要注意 保護(hù)眼睛，不要用裸眼直接觀察 *一般質(zhì)粒樣品電泳時(shí)，電泳遷移率從跨快倒慢依次是：RNA 澳酚蘭、cccDNA LcDNA OcDNA那些始終跑不出孔的樣品多是染色體觀察結(jié)束后，要 及時(shí)處理 凝膠及手套，嚴(yán)禁隨處拋棄*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*4.回收：*別離不同大小的DN射段請(qǐng)選用合適濃度的瓊脂糖凝膠*瓊脂糖凝膠（）線性DNA勺有效別離范圍（kb）0.523010763(6)24.1從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收 DN射段將已經(jīng)電泳確定的可回收的酶切產(chǎn)物在食道這度一的回收用瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。最好換用新的電泳緩沖液,即1XTA

15、E*(2)當(dāng)澳酚藍(lán)跑到一定距離后(至少2cm以上)在長(zhǎng)波紫外燈下觀察，用道選過的刀片在目的片段前切下一與目的片段同長(zhǎng)，寬度適當(dāng)(一般1cm右)的膠塊。不要忘記在膠下墊一個(gè)新的塑料手套防止污染*小心不要將回收膠切裂，同時(shí)注意與目的帶相鄰的切面要盡量平整*(3)將切好的回收膠塊放在原回收膠槽內(nèi)，在切去膠塊處加入低熔點(diǎn)瓊脂糖膠，待其凝固后將其小心放回電泳槽繼續(xù)進(jìn)行電泳。*小心低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠塊與原回收膠塊的交界面易斷裂(4)待目的帶完全進(jìn)入低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，在長(zhǎng)波紫外燈下用潰選過的刀片切下含有所需DN型的凝膠條，置于新的滅菌過的管中，力口300uLTE。(5)65C水浴10min或更長(zhǎng)使膠塊完金融

16、化一。(6)立即加入等體積(300-350uL)Tris-Cl飽和酚，搖晃混勻。12000rpm離心5min。(8)小心將水相移置另一Eppendof管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，搖晃混勻。*小心不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些上層水相(9)12000rpm離心5min。小心將水相移置另一Eppendof管中，加入加體積(780uL即可)預(yù)冷的無水乙醇。*小心不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些上層水相置液氮3分鐘，取出后可于-20C放幾分鐘。小心厘止堂壬爆裂。(12)12000rpm離心10min。(13)(14)迅速棄上清，一般在管底會(huì)有針尖大小的沉淀物，小心用無

17、水乙醇后清洗后置于恒溫器上干燥(55C)510min至無乙醇?xì)馕叮偌尤?0uLddH2O溶解。取2uL電泳定量后20c儲(chǔ)存?zhèn)溆?。做完?shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*4.2小量膠回收DNAt段試劑盒操作見操作手冊(cè)(1)將已電泳確定的可回收的酶切產(chǎn)物或其它產(chǎn)物在合適濃.度.的回收用瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。要換用新的電泳緩沖液，即1XTAE*(2)當(dāng)澳酚藍(lán)跑到一定距離后(至少2cm上)在長(zhǎng)波紫外燈下觀察，用清洗過Eppendof管。回收膠下要墊二個(gè)一新的塑料壬套防止污染*(3)每100mgg膠加入300uL/450uLS1液，55OC溫育10min,每2min顛倒一次。務(wù)必完全溶解*(4)加入1/3體積(10

18、0uL/150uL)異丙醇，混勻，55OC,溫育1min。(5)將混合液移入吸附柱，高速(10000rpm)離心1min,棄去收集管液。(6)往吸附柱中加入450ulW1,靜置1min,高速離心15sec,棄去收集管液。(7)重復(fù)步驟6一次，但無需靜置。(8)棄去收集管液后再高速離心1min。Eppendof管，在吸附膜中央滴入3040ulT1液或ddHO,室溫靜置1min,當(dāng)用ddHO解時(shí)可在370G置5min。(9)高速離心1min,棄去吸附柱。(10)取2uL電泳定量后20c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?做完篆驗(yàn)適及時(shí)收撿實(shí)驗(yàn)臺(tái)*目的片段所需量(ng尸載體量(ng) x目的片段長(zhǎng)度x 3/載體長(zhǎng)度(2)2

19、5 C (SmaI)或37 c (EcoRV/HincII)作用34小時(shí)，將內(nèi)切酶及連接酶滅活后轉(zhuǎn)化。*做完實(shí)覽請(qǐng)及.M收拾實(shí)覽臺(tái).*6.轉(zhuǎn)化6.1質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化：(1)根據(jù)需要，從超低溫冰箱中 迅速取出一管感受態(tài)細(xì)胞，用手捂化后，置于冰浴中10min 以上，并請(qǐng)注明取出的日期時(shí)間。不要取出后立即使用或使用已放置 6hr以上的感 受態(tài)細(xì)胞。(2)Eppendorf管，先吸取20uL感受態(tài)細(xì)胞，再加入質(zhì)粒 (假設(shè)質(zhì)粒濃度大，只要槍頭蘸 一下即可，假設(shè)低可取 12uL用于轉(zhuǎn)化)與之混合，混勻后冰浴15min。*小心不要污染 *(3)42 C熱休克90120sec,取出迅速置冰浴中 2min。(4)加

20、入200uL LB培養(yǎng)基無抗性，37 C振蕩培養(yǎng)15-30min。(5)取相應(yīng)抗性的平板置于 37 c預(yù)熱。(6)振蕩培養(yǎng)1530min后取100uL菌液涂板。(7)37 C培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(菌株不同，培養(yǎng)溫度和時(shí)間均有不同)。通常 DH5a 菌株培養(yǎng) 12 14hr;JM101 7 8hr;ER2566 10 12hr； BL21 9-11hrGI724 30 C培養(yǎng) 2024hr(IMC 平板)4.3無水乙醇沉淀回收：(1)將已確定的可回收產(chǎn)物溶于加有300uL1XT沖液的滅菌過的新管。(2)加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，搖晃混勻。(3)12000rpm離心5min。(4)小心將水相移置另一滅

21、菌過的新管中，加入3倍體積(780uL即可)預(yù)冷的無水乙醇。*小心不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些上層水相*(5)置液氮3分鐘，取出后可于-20C放幾分鐘。小心防止管子爆裂。(6)12000rpm離心10min。(7)迅速棄上清，一般在管底會(huì)有針尖大小的沉淀物，小心用無水乙醇后清洗后置于恒溫器上干燥(55C)510min至無乙醇?xì)馕叮偌尤?0uLddH20M解。(8)取2uL電泳定量后20c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái).*5.連接：一般連接：(1)在滅菌過的新0.5mLEppendof管中加入以下成分混合:J目的基因*10XT4LigaseBuffer1T4DNM接酶1u

22、LddH2O1015uL平端動(dòng)態(tài)連接(1)在滅菌過的新0.5mLEppendof管中加入以下成分混合線性化載體(平端酶SmaI/EcoRV/HincII處理200ng目的片段適量做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái).*6.2連接物轉(zhuǎn)化：(1)根據(jù)需要，從超低溫冰箱中 迅速取出一管感受態(tài)細(xì)胞，用手捂化后，置于冰浴中15min 以上，并請(qǐng)注明取出的日期時(shí)間。不要立即使用或使用已放置 6hr以上的感受態(tài)細(xì) 胞。(2)在超凈工作臺(tái)內(nèi)取一轉(zhuǎn)化用1.5ml Eppendorf管，吸取40uL感受態(tài)細(xì)胞和5uL連接物混合，混勻后冰浴30min。 TOC o 1-5 h z 10XT4LigaseBuffer2uL相應(yīng)平

23、端酶(SmaI/EcoRV/HincII)58UT4DNAt接酶10UddH2O適量反應(yīng)總體積20uL*小心不要污染*(3)42C熱休克90120sec,取出迅速置冰浴中2min。(4)加入360uLLB培養(yǎng)基無抗性，37c振蕩培養(yǎng)4060min。假設(shè)連接物需用藍(lán)白斑來鑒定，則在菌液涂板前30min,需預(yù)先在平板上均勻涂布上適當(dāng)濃度的X-gal與IPTG,并在37c中正放30min。*(5)取相應(yīng)抗性的平板置于37c預(yù)熱。(6)振蕩培養(yǎng)4060min后涂布平板。(7)37C培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(菌株不同，培養(yǎng)溫度和時(shí)間均有不同)。通常DH5a菌株培養(yǎng)1214hr;JM10178hr;ER2566101

24、2hr；BL219-11hrGI72430C培養(yǎng)2024hr(IMC平板)做完實(shí)驗(yàn)靖及時(shí)收檢第覽育.*7.制普通固體培養(yǎng)平板：(1)固體瓊脂培養(yǎng)基的配制：本實(shí)驗(yàn)室常用的是LB固體瓊脂平板，濃度為1.5%,即在100mLLB液體培養(yǎng)基中加入的瓊脂，滅菌后可使用。(2)使用時(shí)取一瓶滅過菌的固體瓊脂培養(yǎng)基，放在電爐上小心煮化。在電爐上煮化時(shí)一定要小心看守，防止其暴沸*有時(shí)會(huì)有部分固體瓊脂沉積在瓶底，在煮化時(shí)要小心不要煮焦*(3)將固培冷卻至4560C,在超凈工作臺(tái)內(nèi)按比例加入需要的抗生素，混勻。 TOC o 1-5 h z 固培煮化后，可在流水下冷卻，但須小心玻璃會(huì)卒冷爆裂*當(dāng)冷卻至手摸不燙時(shí)即可，

25、冷卻過頭易于凝固*(4)在超凈工作臺(tái)內(nèi)按比例加入需要的抗生素，混勻后，將培養(yǎng)基倒入已滅菌過的平皿內(nèi)，厚度適當(dāng)。培養(yǎng)基不要倒太厚，一般35mmp可，也不要過薄，涂板時(shí)易涂破*(5)平皿可正放在超凈工作臺(tái)內(nèi)，待其冷卻凝固后使用或放入冰箱4c儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｔ诜湃氡?c前，要在平板上標(biāo)記清楚所加的抗生素*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)8.涂板：(1)假設(shè)所要使用的平板儲(chǔ)存于冰箱4C,則使用前須預(yù)先取出放在室溫或37C中預(yù)熱段時(shí)間。*取用平板時(shí)一定要注意抗性*平板預(yù)熱時(shí)最好倒置*(2)在超凈工作臺(tái)內(nèi)用槍將所要涂布的菌液移入平板。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一般只要涂100uL左右的菌液，連接物涂200400uL*(3)將涂布器先在

26、酒精燈的外焰上灼燒，再浸入乙醇中，取出后再通過燈焰，燃盡其上的乙醇，待其冷卻后方可使用。如平板的蓋子內(nèi)面上覆有水珠，可用于冷卻涂布器*涂板時(shí)不要心急，一定要等涂布器充分冷卻后方可使用*(4)用涂布器將平板上的菌液涂布均勻，平板倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，除GI724(30C)外，其它菌株均在37c中培養(yǎng)。做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái).*9.挑菌：(1)待平板上的菌落長(zhǎng)至足夠大即到達(dá)可挑的水平。(2)在超凈工作臺(tái)中，在滅菌過的試管內(nèi)倒入34mLM菌過的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基根據(jù)需要 TOC o 1-5 h z 預(yù)先加入抗生素(由菌落所攜帶的質(zhì)粒上的抗性基因決定)?？股匾幢壤尤肱囵B(yǎng)基，并要加了抗生素的培養(yǎng)基上

27、做清楚標(biāo)記，沒有用完的培養(yǎng)基要封好放入冰箱4C,不要放在外面*請(qǐng)盡量使用冰箱內(nèi)已加好抗生素的培養(yǎng)基*(3)用鐐子夾取滅菌過的牙簽挑取平板上的單菌落，在試管內(nèi)的培養(yǎng)基中蘸洗幾下，旋緊管蓋后再將牙簽丟棄于超凈臺(tái)外的收集桶內(nèi)，并請(qǐng)您扔準(zhǔn)。挑菌時(shí)不提倡將牙簽直接投入培養(yǎng)基中*挑菌時(shí)一定要挑清晰正常的單菌落*挑過菌的牙簽一定不能留在超凈工作臺(tái)中*(4)挑菌后請(qǐng)將裝滅菌牙簽的小燒杯封好，并及時(shí)將工作臺(tái)清理干凈。(5)接種過菌落的試管放在搖床中在合適溫度下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，搖速一般170230r/min。試管要在搖床放好，有適當(dāng)?shù)膬A斜角度(45。左右)*要注意不同的菌株和搖菌目的，可能需要不同的溫度和搖速。*做完實(shí)

28、驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)：(1)將血清裝入新的滅菌過的1.5mLEppendorf管，每管200uL。*使用血清，尤其是未滅活的血清時(shí)要注意安全，不要污染環(huán)境*一旦發(fā)生血清污染環(huán)境，請(qǐng)立即用84消毒液處理*(2)在每管中加入STE156uL10%SDS40uL100XPro-K4uL然后在56c中水浴2-3小時(shí)，每幾分鐘(一般510min)輕輕搖晃混勻一次。 TOC o 1-5 h z 管子一定要仔細(xì)蓋嚴(yán)，防止泄漏及外面的水進(jìn)入*(3)加入400uL的酚-氯仿-異戊醇，搖勻后靜置幾分鐘(510min),不宜劇烈。(4)12000rpm離心10min。(5)小

29、心將上清取出，加入兩倍體積以上(780uL即可)的無水乙醇和終濃度為0.2M的NaAc(40uL),置于液氮中3min。小心不要吸入中間的蛋白和下層的酚相*(6)取出后可先置于-20C中放2分鐘以防止管子爆裂。12000rpm離心10min。(8)迅速棄去無水乙醇，再用無水乙醇洗一下(也可不洗)，最好用滅菌槍頭吸干管內(nèi)液體*(9)在恒溫器(55C)干燥5min左右至無乙醇?xì)馕?，再加?0uLddH2O溶解。-20C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)不要頻繁的反復(fù)凍融*操作過程中要嚴(yán)防污染*做定頭擅道絲匣也邕遑挽食*哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株別離：(1)把轉(zhuǎn)染72hr后的細(xì)胞從六孔板中的用Verson液消化洗下，經(jīng)稀釋

30、后轉(zhuǎn)入50mL螺口玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至基本貼壁時(shí)再加入含作用濃度為400ug/mLG418的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以23天為間隔換液，如此培養(yǎng)一星期后可觀察到有大量細(xì)胞死亡，相應(yīng)降低G418壓力繼續(xù)培養(yǎng)23星期后，可觀察到有細(xì)胞克隆形成。(2)將已形成細(xì)胞克隆的培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察克隆的位置，并用記號(hào)筆將其標(biāo)出。(3)用鐐子夾取滅菌過的小濾紙片，在Verson中蘸濕后將其覆蓋在細(xì)胞克隆上，520s后取出在加有完全培養(yǎng)基(600uL/孔)的24孔板中刷洗數(shù)次，將附著上的細(xì)胞洗下。(4)將轉(zhuǎn)移有細(xì)胞克隆的24孔板置于5%C所養(yǎng)*f中37c進(jìn)行培養(yǎng)。(5)待24孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)并到達(dá)80

31、%A上滿底后，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。(6)將經(jīng)檢測(cè)可表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入50mL螺口培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候進(jìn)行傳代換液，擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。常用溶液、培養(yǎng)基配制I*美苴LB口喬9.每1000mL加分析純NaCl10g,蛋白月東10g,酵母粉5g,用ddHO配制，再用10MNaOHpH至(1000mL一般力口450ul),高壓蒸汽滅菌15min冷卻后使用。固體培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入瓊脂至,高壓滅菌后使用。溶液I：葡萄糖50mmol/L,EDTA10mmol/L,Tris-HCl25mmol/L,。溶液II：,SDS1%,用ddH2O現(xiàn)配現(xiàn)用。溶液出:取5mo