2011CB965000-G三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新與定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)項(xiàng)目名稱：三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新與定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)首席科學(xué)家：戴建武 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部門：中國科學(xué)院二、預(yù)期目標(biāo)本項(xiàng)目的總體目標(biāo)：通過本項(xiàng)目的實(shí)施，建立干細(xì)胞三維培養(yǎng)和完善干細(xì)胞納米示蹤技術(shù)，解析干細(xì)胞自我更新與分化過程中遺傳與表觀遺傳的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為干細(xì)胞的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。取得一批具有重大影響的科研成果，提高我國在干細(xì)胞研究領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力。五年預(yù)期目標(biāo): 1綜合考慮多種因素，最大限度模擬體內(nèi)環(huán)境，制備出適合干

2、細(xì)胞生長分化的三維支架材料，建立三維培養(yǎng)多能干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的自我更新和定向分化的研究體系。2. 結(jié)合基因組、蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞自我更新和定向分化的分子和細(xì)胞機(jī)制，闡明在干細(xì)胞自我更新和定向分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號(hào)通路和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3通過模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞維持與定向分化研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定與神經(jīng)干細(xì)胞的維持、分化相關(guān)的一些新基因，闡明其作用機(jī)制。明確體外三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新能力與分化潛能，并對(duì)其導(dǎo)入體內(nèi)后的有效性、安全性進(jìn)行評(píng)估。分析三維培養(yǎng)干細(xì)胞與體內(nèi)干細(xì)胞維持與分化機(jī)制的異同，獲得干細(xì)胞調(diào)控的真實(shí)信息。4. 建

3、立干細(xì)胞納米示蹤與成像新技術(shù)，包括制備出高生物相容性、高量子產(chǎn)率的量子點(diǎn)，建立量子點(diǎn)標(biāo)記活細(xì)胞及亞細(xì)胞組分的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)三維培養(yǎng)干細(xì)胞以及活體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，建立三維培養(yǎng)干細(xì)胞和活體干細(xì)胞的三維、非損傷性的納米示蹤與成像技術(shù)。5培養(yǎng)研究生30名。博士后10名。6在本領(lǐng)域發(fā)表論文30篇，其中影響因子5以上的15篇。三、研究方案1）學(xué)術(shù)思路： 干細(xì)胞的自我更新和定向分化是干細(xì)胞研究中的基本問題。在體內(nèi)，干細(xì)胞的自我更新和分化是處于三維環(huán)境中，體外三維培養(yǎng)體系下細(xì)胞的行為學(xué)特性近似于體內(nèi)細(xì)胞的特性。本項(xiàng)目將建立模擬體內(nèi)環(huán)境的干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系，并利用干細(xì)胞納米標(biāo)記與成像技術(shù)，研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞自

4、我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在體內(nèi)研究中，以線蟲和小鼠為模式動(dòng)物，系統(tǒng)研究體內(nèi)干細(xì)胞的維持、分化調(diào)控機(jī)制。2）技術(shù)途徑： 根據(jù)研究?jī)?nèi)容，本項(xiàng)目技術(shù)途徑如圖所示：具體內(nèi)容如下：適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維膠原支架的構(gòu)建分離純化膠原蛋白，制備三維膠原支架材料，檢測(cè)其生物相容性，運(yùn)用不同生產(chǎn)工藝使其具有適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，建立適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維支架材料。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化 在膠原支架材料的基礎(chǔ)上，將微環(huán)境中調(diào)控干細(xì)胞自我更新和定向分化的其它細(xì)胞外基質(zhì)成份、信號(hào)分子或支持細(xì)胞等因素通過不同的方法整合到膠原支架材料上，對(duì)三維膠原支架材料進(jìn)行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細(xì)胞自

5、我更新和定向分化的環(huán)境。3）干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立干細(xì)胞選擇多潛能干細(xì)胞（ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞）和成體干細(xì)胞（神經(jīng)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞）。（1）用納米量子點(diǎn)-熒光標(biāo)記結(jié)合活細(xì)胞成像技術(shù)記錄和追蹤經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞在三維培養(yǎng)介質(zhì)中的粘附、生長、遷移和運(yùn)動(dòng)等動(dòng)態(tài)行為。在亞細(xì)胞水平用活體成像技術(shù)觀測(cè)參與調(diào)控細(xì)胞行為的細(xì)胞骨架(如actin或 tubulin的熒光融合蛋白)及其他因子的動(dòng)態(tài)變化。（2）將不同干細(xì)胞接種于適宜的三維膠原支架材料，與二維培養(yǎng)體系相比較，利用芯片技術(shù)對(duì)二者基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，分析在三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞的基因表達(dá)情況，利用western blot等技術(shù)對(duì)

6、關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。綜合利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)兩種培養(yǎng)體系下細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行比較。4）干細(xì)胞自我更新調(diào)控機(jī)制研究（1）將干細(xì)胞接種于適宜的三維膠原支架材料，進(jìn)行自我更新和定向分化研究。分離提取細(xì)胞RNA用Q-PCR檢測(cè)干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，分離提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。用針對(duì)integrin等細(xì)胞表面標(biāo)記以及細(xì)胞骨架蛋白的特異性抗體，通過免疫熒光染色比較二維和三維環(huán)境中干細(xì)胞及其定向分化細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、粘附特性及運(yùn)動(dòng)特性。 （2）三維培養(yǎng)干細(xì)胞的發(fā)育潛能研究，在建立胚胎干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上

7、，探索三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能，體外研究中重點(diǎn)探索三維胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)、心肌等細(xì)胞分化的能力及其調(diào)控機(jī)制，體內(nèi)利用嵌合以及四倍體補(bǔ)償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細(xì)胞多能性。（3）以生物化學(xué)方法檢測(cè)三維培養(yǎng)環(huán)境中干細(xì)胞的自我更新和分化受外界信號(hào)調(diào)控的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動(dòng)態(tài)變化，并與通過細(xì)胞生物學(xué)手段檢測(cè)信號(hào)通路中各組分激活狀態(tài)的亞細(xì)胞分布相結(jié)合，檢測(cè)其下游靶基因的表達(dá)水平，以分析細(xì)胞中各種信號(hào)通路的整合情況，解析干細(xì)胞對(duì)于不同培養(yǎng)條件作出反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。其中自我更新研究將以ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞為主，探討其以O(shè)ct4和Nanog為中心的干細(xì)胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。5）干細(xì)胞定向分

8、化調(diào)控機(jī)制研究（1）選擇成體干細(xì)胞包括神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測(cè)比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等。將干細(xì)胞接種于適宜的三維膠原支架材料，進(jìn)行定向分化研究。通過細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光染色檢測(cè)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的細(xì)胞類型（針對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞類型將分別用神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及寡樹突細(xì)胞標(biāo)志蛋白的特異抗體（神經(jīng)元TuJ1及MAP2，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP，寡樹突細(xì)胞OSP）作免疫熒光染色, 針對(duì)人胚胎干細(xì)胞分化產(chǎn)生的心肌細(xì)胞類型將分別用-肌漿球蛋白重鏈（-MHC）、肌鈣蛋白C、心房

9、利鈉肽（ANP）等標(biāo)志蛋白的特異抗體作免疫熒光染色,骨骼肌標(biāo)志蛋白MHC和Caveolin-3）。例如肌原代成肌細(xì)胞或肌源性細(xì)胞系C2C12細(xì)胞在增殖階段的培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件為含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，一般56天細(xì)胞可以分化成肌管。針對(duì)成肌干細(xì)胞分化產(chǎn)生的骨骼肌細(xì)胞將分別用骨骼肌標(biāo)志蛋白MHC和Caveolin-3作免疫熒光染色。分離提取細(xì)胞RNA用Q-PCR檢測(cè)干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，分離提取細(xì)胞總蛋白檢測(cè)干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞在分化過程中亞細(xì)胞

10、結(jié)構(gòu)水平的變化，用針對(duì)integrin等細(xì)胞表面標(biāo)記以及細(xì)胞骨架蛋白的特異性抗體，通過免疫熒光染色比較二維和三維環(huán)境中干細(xì)胞及其定向分化細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、粘附特性及運(yùn)動(dòng)特性。通過與課題組四合作，用納米量子點(diǎn)-熒光標(biāo)記結(jié)合活細(xì)胞成像技術(shù)記錄和追蹤經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞在三維培養(yǎng)介質(zhì)中的粘附、生長、遷移和運(yùn)動(dòng)等動(dòng)態(tài)行為。在亞細(xì)胞水平用活體成像技術(shù)觀測(cè)參與調(diào)控細(xì)胞行為的細(xì)胞骨架(如actin或tubulin的熒光融合蛋白)及其他因子的動(dòng)態(tài)變化。（2）運(yùn)用生化方法檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞分化過程中受外界信號(hào)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，并與通過細(xì)胞生物學(xué)手段檢測(cè)信號(hào)通路中各組分激活

11、狀態(tài)的亞細(xì)胞分布相結(jié)合，并檢測(cè)其下游靶基因的表達(dá)水平，分析它們各自信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性，解析干細(xì)胞對(duì)于不同培養(yǎng)條件作出反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。其中神經(jīng)細(xì)胞的研究將以Erk及mTOR信號(hào)通路為主，肌細(xì)胞的研究將以PI3K/AKT/GSK3信號(hào)通路為主。此外，我們已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通過STAT3-p63- Jagged-Notch 級(jí)聯(lián)調(diào)控細(xì)胞維持細(xì)胞增殖和分化之間的平衡。功能低下或高度活化的mTOR信號(hào)通過影響Notch信號(hào)抑制細(xì)胞分化。因此計(jì)劃探討三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞定向分化的分子和細(xì)胞機(jī)制，闡明在干細(xì)胞定向分化中mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路是否起關(guān)鍵調(diào)控作用。研究方案如下：分離選

12、擇小鼠條件性 mTOR、 PTEN或Tsc1基因敲除 (mTOR活化) 的成體干細(xì)胞包括神經(jīng)和成肌干細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，然后將TAT-NLS-Cre融合蛋白質(zhì)加入細(xì)胞培養(yǎng)液，融合蛋白質(zhì)將會(huì)被細(xì)胞攝取、入核，敲除mTOR基因或Tsc1基因，從而下調(diào)或上調(diào)mTOR通路的活性，然后檢測(cè)比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等。還可讓這些小鼠與組織特異性 CRE 表達(dá)小鼠交配，在小鼠體內(nèi)敲除mTOR、 PTEN或Tsc1，以明確mTOR在干細(xì)胞的定向分化中的作用。小鼠條件性敲除胚胎干細(xì)胞 (loxp-mTOR-loxp

13、) 已從歐洲條件性基因敲除小鼠項(xiàng)目（European Conditional Mouse Mutagenesis program）得到，將培育loxp-mTOR-loxp轉(zhuǎn)基因小鼠，為條件性敲除mTOR小鼠做準(zhǔn)備。已有條件性Pten或Tsc1基因敲除小鼠和神經(jīng)、肌肉CRE表達(dá)小鼠。（3）鑒定人胚胎干細(xì)胞向心肌前體細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路表達(dá)KDR的細(xì)胞是心肌細(xì)胞的前提細(xì)胞。利用我們現(xiàn)有的心肌分化培養(yǎng)體系，將人胚胎干細(xì)胞在三維條件下分化成心肌細(xì)胞，并在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，利用流式細(xì)胞分離儀分離取得KDR表達(dá)的心肌前體細(xì)胞和非表達(dá)細(xì)胞，然后再利用microarray 或深度測(cè)

14、序技術(shù)獲取這二類細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，并通過二者之間和與為分化的胚胎干細(xì)胞表達(dá)譜對(duì)比，找到在這一分化過程中上調(diào)和下調(diào)的前500個(gè)基因，并通過UCSC mm8得到這些基因的啟動(dòng)子序列，最后利用CREAD package 的Motifclass來發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)在這些啟動(dòng)子中的具有代表性的（按出現(xiàn)頻率劃分）轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)。通過這些轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)來找到調(diào)節(jié)這一細(xì)胞分化過程的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。最后，利用可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)在胚胎干細(xì)胞中驗(yàn)證這些轉(zhuǎn)錄因子在心肌分化中的功能。6）三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和定向分化的表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究（1）系統(tǒng)定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下未分化干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化細(xì)胞之間的

15、總蛋白質(zhì)組和重要的蛋白質(zhì)修飾（包括磷酸化、乙?；头核鼗┑牟町悾瑥亩页鲈谌S培養(yǎng)條件下控制干細(xì)胞自我更新與定向分化的特異性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究方案包括下圖所示七個(gè)步驟：從三維和二維培養(yǎng)條件下未分化的干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞制備蛋白質(zhì)樣品。這樣一共有四個(gè)樣品，分別標(biāo)記為三維未分化， 三維分化，二維分化，二維未分化。從每個(gè)樣品中分出等量的蛋白樣品進(jìn)行胰蛋白酶（Trypsin) 酶解，產(chǎn)生多肽混合物。利用商業(yè)化的iTraq試劑，分別標(biāo)記以上四個(gè)不同的樣品。iTraq試劑有四個(gè)不同的標(biāo)記物。這四個(gè)標(biāo)記物在MS/MS圖譜上所顯示的峰其質(zhì)量/電荷比分別為113，114，115，116。如果某一個(gè)多肽在四個(gè)

16、樣品中都存在，那么這個(gè)多肽就會(huì)被這四個(gè)標(biāo)記物分別標(biāo)記上。將這四個(gè)標(biāo)記過的樣品等量混合并進(jìn)行LC-MS/MS分析，根據(jù)這四個(gè)標(biāo)記物在MS/MS圖譜上特異峰的信號(hào)強(qiáng)度，我們就可以對(duì)這個(gè)多肽在四個(gè)樣品中的相對(duì)含量進(jìn)行定量。 對(duì)于總蛋白質(zhì)組的分析，我們從每個(gè)標(biāo)記的樣品中取等量的樣品加以混合。讓后利用多維的液相層析和質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)（LC-MS/MS), 同時(shí)對(duì)四個(gè)樣品中的蛋白進(jìn)行鑒定和定量。對(duì)于磷酸蛋白質(zhì)組的分析，我們從第三步標(biāo)記好的四個(gè)樣品中分別拿出等量樣品并合并，然后先后用固定化金屬離子親和層析法(IMAC)和二氧化鈦(TiO2)親和層析法富集不同的磷酸肽亞群 (Bodenmiller et al.

17、, 2007)，并將收集到的磷酸肽合并到一起。同樣，對(duì)與乙?；头核鼗覀儗⒎謩e利用已發(fā)表的免疫沉降法和親和層析法對(duì)被修飾的多肽進(jìn)行富集。利用多維LC-MS/MS進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)的鑒定和定量。我們將利用最先進(jìn)的帶有ETD功能的LTQ-Orbitrap-Velos質(zhì)譜儀來分析這些樣品。這個(gè)質(zhì)譜儀是目前世界上進(jìn)行大規(guī)模蛋白質(zhì)組研究的最好的儀器，具有高靈敏度，高分辨率，以及高精確度的特點(diǎn)。同時(shí)，附加的ETD（Electron Transfer Dissociation）功能是專門用來分析蛋白質(zhì)修飾的。我們可以利用ETD方法和傳統(tǒng)的CID(Collision Induced Dissociatio

18、n)方法來進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)的分析，以求獲得更高的位點(diǎn)鑒定覆蓋率。利用生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)的方法對(duì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)修飾數(shù)據(jù)進(jìn)行信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò)的分析，找出與干細(xì)胞自我更新或定向分化相關(guān)的調(diào)控通路或網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，我們將會(huì)找出一些與干細(xì)胞更新與定向分化特異相關(guān)的蛋白和修飾位點(diǎn)，進(jìn)行進(jìn)一步的功能研究。（2）利用microRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。確定microRNA在三維干細(xì)胞自我更新和定向分化過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體途徑如下：非編碼RNA序列的篩選和生物信息學(xué)分析獲得二維和三維培養(yǎng)狀態(tài)下的干細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，利用microRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。通過生物信息學(xué)分析，對(duì)非編碼RNA進(jìn)行功能分

19、類、確認(rèn)可能的新類別非編碼RNA；分析非編碼RNA的基因組定位、尋找可能的非編碼RNA特異的上游調(diào)控元件。報(bào)告基因系統(tǒng)確定非編碼RNA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通過生物信息學(xué)方法分析非編碼RNA基因的上游調(diào)控元件，進(jìn)一步分析其中可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)，針對(duì)不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建缺失或點(diǎn)突變的報(bào)告基因（Luciferase）重組質(zhì)粒，確定影響非編碼RNA基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及結(jié)合序列。非編碼RNA對(duì)干細(xì)胞自我更新、分化的影響 分別構(gòu)建正義和反義非編碼RNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞或肌肉干細(xì)胞，觀察超表達(dá)或Knockdown特定非編碼RNA對(duì)其生物學(xué)功能的影響。進(jìn)一步采用Nor

20、thern和Western方法檢測(cè)細(xì)胞增殖分化相關(guān)的標(biāo)志基因（proliferation or differentiation marker）的表達(dá)情況，分析非編碼RNA的功能。7）模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞維持分化與功能研究將從基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞與組織以及活體動(dòng)物水平研究體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與分化。具體途徑如下：（1）基因水平的研究：全基因組RNAi篩選和化學(xué)誘變，基因定位、克隆找到細(xì)胞分化調(diào)控因子。（2）蛋白質(zhì)水平的研究：利用雙向電泳、質(zhì)譜、顯微注射、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。（3）細(xì)胞與組織水平的研究：利用建立的各種細(xì)胞和組織培養(yǎng)模型和流式細(xì)胞分離、激光共聚焦

21、成像、顯微注射、RNA干擾和過表達(dá)等技術(shù)，深入研究基因/蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（4）活體動(dòng)物研究：利用轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型、干細(xì)胞移植等技術(shù)研究體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新與定向分化。8）干細(xì)胞的納米示蹤與成像技術(shù)研究將以高量子效率、高生物相容性量子點(diǎn)的制備為基礎(chǔ)，通過對(duì)量子點(diǎn)的特異性修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，利用熒光成像技術(shù)和核磁共振成像手段，對(duì)三維培養(yǎng)的干細(xì)胞和活體干細(xì)胞進(jìn)行三維示蹤成像。具體研究途徑如下：（1）納米粒子的制備研究：a. 高量子效率、高生物相容性量子點(diǎn)：對(duì)目前實(shí)驗(yàn)室已有的量子點(diǎn)合成技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使量子點(diǎn)在光穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性、熒光量子產(chǎn)率、熒光半峰全寬等各個(gè)參數(shù)上

22、滿足后續(xù)應(yīng)用的需要。選取恰當(dāng)?shù)呐潴w，對(duì)量子點(diǎn)表面進(jìn)行功能化修飾，提高其生物相容性。b. 采用高溫分解鐵前驅(qū)體的方法合成磁性納米粒子，通過優(yōu)化前驅(qū)體濃度、回流時(shí)間、加熱速率等反應(yīng)條件，借助晶種生長法來控制粒徑的大小。選用合適的鐵前驅(qū)體和過渡金屬前驅(qū)體進(jìn)行熱解，控制磁性納米粒子的化學(xué)組成。通過表面配體置換對(duì)納米粒子表面進(jìn)行改性和修飾。（2）量子點(diǎn)的特異性修飾：結(jié)合其它子課題的研究需求，利用特異性的識(shí)別分子對(duì)量子點(diǎn)、磁性顆粒通過共價(jià)或非共價(jià)的方式進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞及其亞結(jié)構(gòu)組分的特異性標(biāo)記。（3）活體干細(xì)胞的標(biāo)記：將近紅外量子點(diǎn)或磁性納米粒子標(biāo)記的干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記，然后導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用熒光信

23、號(hào)或核磁信號(hào)對(duì)干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的行為進(jìn)行示蹤。（4）納米示蹤與成像：a. 通過量子點(diǎn)和生物分子標(biāo)記對(duì)象的雙色熒光共定位成像，可以在單分子水平研究近紅外量子點(diǎn)對(duì)干細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記技術(shù)。b. 采用共聚焦掃描技術(shù)實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞三維成像與示蹤。根據(jù)紅外量子點(diǎn)的激發(fā)與發(fā)射波長的特點(diǎn)，選用合適波長的激光光源構(gòu)建共聚焦熒光顯微系統(tǒng)，可以有效降低本底信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)較高成像精度的三維紅外熒光成像，滿足對(duì)不同生長環(huán)境下干細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)比研究。c. 近紅外光具有較大的組織穿透深度，利用近紅外量子點(diǎn)構(gòu)建活體熒光成像系統(tǒng)，可以在小動(dòng)物尺度對(duì)干細(xì)胞的維持和分化進(jìn)行示蹤成像。d. 直接將磁性納米粒子標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞注射

24、到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁神經(jīng)干細(xì)胞的niche區(qū)，將小鼠于不同時(shí)間點(diǎn)置入11.7T磁共振微成像儀中，分別采用自旋回波和梯度回波兩種對(duì)鐵敏感性不同的磁共振影像方法，設(shè)計(jì)優(yōu)化脈沖系列，對(duì)小鼠腦部進(jìn)行掃描，針對(duì)移植部位進(jìn)行圖像采集，研究外源性神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、遷移、分化等。以磁共振影像技術(shù)作為核心技術(shù)，對(duì)比研究三維培養(yǎng)與二維培養(yǎng)干細(xì)胞在體內(nèi)維持分化與功能的差異，支撐課題1、2、3的相關(guān)研究。3) 創(chuàng)新點(diǎn)與特色： （1）三維培養(yǎng)體系中細(xì)胞的行為學(xué)特性更近似于體內(nèi)細(xì)胞的環(huán)境。本項(xiàng)目模擬體內(nèi)干細(xì)胞自我更新和定向分化的三維環(huán)境，建立干細(xì)胞的三維培養(yǎng)分化體系，在此基礎(chǔ)上對(duì)干細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控

25、網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。這是本項(xiàng)目重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。（2）活體細(xì)胞納米示蹤與成像技術(shù)作為生物醫(yī)學(xué)研究的基本手段在干細(xì)胞的自我更新與分化的體內(nèi)外研究中發(fā)揮著日益重要的作用。納米標(biāo)記與成像技術(shù)作為非損傷性的新型標(biāo)記技術(shù)將獲得傳統(tǒng)二維細(xì)胞研究技術(shù)難以攝取的信息。（3）系統(tǒng)定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞自我更新和定向分化過程中蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組的差異，找出更接近體內(nèi)環(huán)境中干細(xì)胞自我更新與分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。（4）本項(xiàng)目既有體外三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和分化的研究，又有模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞自我更新和分化的研究，可以驗(yàn)證三維培養(yǎng)體系與體內(nèi)環(huán)境的相似性。4）可行性分析： （1）項(xiàng)目申請(qǐng)人主持了2006-2010年國家重

26、大科學(xué)研究計(jì)劃中“調(diào)控干細(xì)胞自我更新能力的分子網(wǎng)絡(luò)研究”的項(xiàng)目，項(xiàng)目組對(duì)干細(xì)胞的自我更新和定向分化及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了較為深入的研究，取得了一些重要的研究結(jié)果，豐富和發(fā)展了以O(shè)ct4和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子為核心的干細(xì)胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些工作為進(jìn)一步在三維培養(yǎng)條件下研究干細(xì)胞自我更新的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。（2）項(xiàng)目組成員在三維培養(yǎng)體系建立、干細(xì)胞定向分化研究、定量蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞遷移與粘附、納米示蹤與成像技術(shù)等研究以及模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體系建立等方面已有較好的積累（詳見研究基礎(chǔ)）。（3）參加本項(xiàng)目的課題組來自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、中國科學(xué)院動(dòng)物研究所、中國科學(xué)院生物物理所、中國科學(xué)院蘇

27、州納米技術(shù)與納米仿生研究所、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、大連醫(yī)科大學(xué)，課題組依托單位和重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室都具備先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)條件，為該項(xiàng)目的實(shí)施提供了充分必要的條件。（4）本項(xiàng)目所設(shè)置的四個(gè)課題組的研究?jī)?nèi)容相互聯(lián)系，研究成員之間已經(jīng)建立了緊密的協(xié)作關(guān)系。（5）項(xiàng)目申請(qǐng)人戴建武研究員是中國科學(xué)院“百人計(jì)劃”入選者、國家杰出青年基金獲得者、國家重大科學(xué)研究計(jì)劃“調(diào)控干細(xì)胞自我更新能力的分子網(wǎng)絡(luò)研究”（2006-2010）項(xiàng)目首席科學(xué)家，為本項(xiàng)目的運(yùn)行積累了組織和協(xié)調(diào)經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目課題負(fù)責(zé)人均為相關(guān)研究領(lǐng)域的優(yōu)秀學(xué)科帶頭人。學(xué)術(shù)骨干隊(duì)伍由精力充沛的優(yōu)秀青年科研人員組成。5） 課題設(shè)置本項(xiàng)目利用細(xì)胞示蹤和成像技術(shù)，

28、研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞和體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與定向分化的調(diào)控機(jī)理。本項(xiàng)目設(shè)置四個(gè)課題：課題1 干細(xì)胞三維培養(yǎng)與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究課題2 三維培養(yǎng)干細(xì)胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究課題3 干細(xì)胞體內(nèi)維持分化與功能研究課題4 干細(xì)胞的納米示蹤與成像技術(shù)四個(gè)課題相互獨(dú)立又相互聯(lián)系，其中課題4建立的納米示蹤與成像技術(shù)在課題1、課題2、課題3的研究過程中均會(huì)得到應(yīng)用。課題1和課題2的研究為體外研究，其分別研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞的自我更新和定向分化調(diào)控。自我更新和定向分化的調(diào)控機(jī)制既相互區(qū)別又相互聯(lián)系。課題3為模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與定向分化研究，其體內(nèi)的研究結(jié)果可與課題1、課題2體外干細(xì)胞自我更新和定向分化的研

29、究結(jié)果相互驗(yàn)證。課題1：干細(xì)胞三維培養(yǎng)與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究研究目標(biāo)：制備出適合干細(xì)胞生長分化的三維膠原支架材料；建立多潛能干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系，闡釋三維培養(yǎng)條件下胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能與自我更新的分子機(jī)制；結(jié)合蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組以及microRNA分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞自我更新表觀調(diào)控機(jī)制，闡明在干細(xì)胞自我更新起關(guān)鍵調(diào)控作用的表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)。研究?jī)?nèi)容：1）適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維支架的構(gòu)建分離純化膠原蛋白，制備不同類型的三維支架材料，使其具有良好的生物相容性，適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，建立適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維膠原支架材料。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化 在膠

30、原支架材料的基礎(chǔ)上，將微環(huán)境中調(diào)控干細(xì)胞自我更新和分化的其它細(xì)胞外基質(zhì)成份、信號(hào)分子或支持細(xì)胞等因素整合到膠原支架材料上，對(duì)三維膠原支架材料進(jìn)行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細(xì)胞自我更新和分化的環(huán)境。3）干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立干細(xì)胞選擇多潛能干細(xì)胞ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)能等。檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在生長和分化過程中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平的變化。4）三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞發(fā)育潛能研究在建立胚胎干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能。利用嵌合以及四倍體補(bǔ)償?shù)确椒ㄨb定三維

31、培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細(xì)胞多能性，并與二維培養(yǎng)體系下干細(xì)胞的發(fā)育潛能相比較。5）三維培養(yǎng)干細(xì)胞的自我更新研究建立ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞三維培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，研究調(diào)控細(xì)胞多能性的這些因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析其如何相互協(xié)同共同控制多能性細(xì)胞的不分化狀態(tài)。6）三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在在自我更新過程中的表觀遺傳學(xué)變化，包括蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組、非編碼RNA表達(dá)譜等。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 大連醫(yī)科大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：戴建武學(xué)術(shù)骨干：汪迎春、劉蕾、丁文勇、林琳、田余祥經(jīng)費(fèi)比例：34%課題

32、2：三維培養(yǎng)干細(xì)胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究研究目標(biāo)：綜合運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、材料科學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，檢測(cè)三維培養(yǎng)中干細(xì)胞自我更新和分化狀態(tài)的各項(xiàng)指標(biāo)，以建立一套完善有效的干細(xì)胞三維培養(yǎng)的評(píng)價(jià)體系。結(jié)合蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞定向分化的分子和細(xì)胞機(jī)制，闡明在干細(xì)胞定向分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號(hào)通路和信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及表觀遺傳網(wǎng)絡(luò)。研究?jī)?nèi)容：1）選擇成體干細(xì)胞包括神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測(cè)比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等。檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和

33、成肌干細(xì)胞在分化過程中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平的變化，包括用免疫染色及活細(xì)胞成像技術(shù)等觀測(cè)細(xì)胞粘附特性及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)特性等。2）運(yùn)用生化方法檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞分化過程中受外界信號(hào)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，分析它們各自信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性。3）用基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在生長和分化過程中的表觀遺傳學(xué)變化，包括蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組、microRNA表達(dá)譜等。4）利用已建立的人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的體外培養(yǎng)模型,在三維培養(yǎng)條件下利用基因芯片或深度測(cè)序的方法取得基因表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建三維條件下心肌分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。承

34、擔(dān)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 中國科學(xué)院生物物理研究所課題負(fù)責(zé)人：劉佳佳學(xué)術(shù)骨干：馬躍、張宏冰、張蕾、楊艷蕊經(jīng)費(fèi)比例：31%課題3：干細(xì)胞體內(nèi)維持分化與功能研究研究目標(biāo)：通過模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與分化研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定與神經(jīng)干細(xì)胞的維持、分化相關(guān)的一些新基因，闡明其作用機(jī)制。明確三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新能力與分化潛能，并對(duì)其導(dǎo)入體內(nèi)后的有效性、安全性進(jìn)行評(píng)估。分析三維培養(yǎng)干細(xì)胞與體內(nèi)干細(xì)胞維持與分化機(jī)制的異同，獲得干細(xì)胞調(diào)控的真實(shí)信息。研究?jī)?nèi)容：1）線蟲內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞維持與分化的關(guān)鍵因子首先建立線蟲神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)觀察體系，利用線蟲容易進(jìn)

35、行大規(guī)模篩選的特性，進(jìn)行全基因組RNAi篩選和化學(xué)誘變。然后通過內(nèi)源啟動(dòng)子融合熒光實(shí)驗(yàn)，探明相應(yīng)調(diào)控因子的組織表達(dá)譜。運(yùn)用細(xì)胞自主性拯救實(shí)驗(yàn)探明該因子調(diào)控內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞維持與分化的分子機(jī)制。2）同源干細(xì)胞分化調(diào)控因子在哺乳動(dòng)物干細(xì)胞分化中的作用研究哺乳動(dòng)物中相對(duì)應(yīng)的同源干細(xì)胞分化調(diào)控因子，利用RNAi和基因敲除技術(shù)研究這些調(diào)控因子如何影響哺乳動(dòng)物干細(xì)胞的維持與分化。3） 三維培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞在小鼠紋狀體區(qū)的維持、分化與神經(jīng)回路的重建將使用近紅外量子點(diǎn)和磁性納米顆粒對(duì)三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記。經(jīng)納米材料示蹤標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞將通過立體定位的方法直接注入到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁，即神經(jīng)干細(xì)

36、胞的niche區(qū)。在細(xì)胞導(dǎo)入后不同時(shí)間分別使用增殖細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞、分化細(xì)胞、成熟神經(jīng)元、神經(jīng)突觸等特異的分子標(biāo)記，系統(tǒng)地檢測(cè)外源神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的維持、分化行為以及功能回路的建立。同時(shí)使用核磁共振活體成像技術(shù)，對(duì)干細(xì)胞移植動(dòng)物后進(jìn)行三維、非破壞性納米技術(shù)示蹤以分析外源神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、定位、遷移、分化等。4) 外源神經(jīng)干細(xì)胞參與神經(jīng)功能的恢復(fù)使用神經(jīng)退行性疾病模型小鼠舞蹈病模型小鼠作為外源神經(jīng)干細(xì)胞的受體。干細(xì)胞移植后通過檢測(cè)舞蹈病模型小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力可以直接從功能上評(píng)估外源干細(xì)胞參與神經(jīng)組織修復(fù)的能力。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 課題負(fù)責(zé)人：

37、唐鐵山學(xué)術(shù)骨干：丁梅、關(guān)麗英、李夏、陳倩經(jīng)費(fèi)比例：18%課題4：干細(xì)胞的納米示蹤與成像技術(shù)研究目標(biāo)：建立干細(xì)胞納米示蹤與成像新技術(shù)，包括制備出高生物相容性、高量子產(chǎn)率的量子點(diǎn)，建立量子點(diǎn)標(biāo)記活細(xì)胞及亞細(xì)胞組分的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)三維培養(yǎng)干細(xì)胞以及活體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，建立三維培養(yǎng)干細(xì)胞和活體干細(xì)胞的三維、非損傷性的納米示蹤與成像技術(shù)。研究?jī)?nèi)容：1）高量子效率、高生物相容性量子點(diǎn)的制備（1） 高量子效率、高生物相容性量子點(diǎn)的制備：在我們已有工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)量子點(diǎn)合成技術(shù)，開發(fā)高量子效率的、熒光范圍從可見光區(qū)到近紅外光區(qū)的量子點(diǎn)，并提高量子點(diǎn)的生物相容性，滿足三維培養(yǎng)的干細(xì)胞和活體干細(xì)胞標(biāo)記和

38、成像。（2） 高生物相容性和高弛豫率磁性納米顆粒的制備：通過控制納米粒的粒徑、化學(xué)成分以及表面性質(zhì)使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。2）三維培養(yǎng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記：與課題1和2進(jìn)行合作，針對(duì)三維培養(yǎng)的干細(xì)胞及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，分別用相應(yīng)的識(shí)別分子（如抗體、適配體、信號(hào)肽等）對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行特異性修飾，對(duì)細(xì)胞骨架組分、細(xì)胞因子（如Wnt、FGF、BMP、Notch和TGF-等）及相關(guān)受體、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)蛋白、非編碼RNA進(jìn)行特異性標(biāo)記。3）活體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記：用近紅外量子點(diǎn)或磁性納米粒子對(duì)三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記，采用立體定位注射的方法導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用近紅外量子點(diǎn)的熒光信

39、號(hào)或磁性納米粒子的核磁信號(hào)對(duì)活體內(nèi)的干細(xì)胞進(jìn)行定位與跟蹤，為研究其在體內(nèi)生理環(huán)境下的增殖與分化機(jī)制提供證據(jù)。4）三維培養(yǎng)干細(xì)胞的近紅外熒光成像技術(shù)：利用單分子/單量子點(diǎn)熒光共定位技術(shù)，研究修飾后的近紅外量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞骨架組分、細(xì)胞因子等的特異性標(biāo)記性能。針對(duì)紅外量子點(diǎn)的激發(fā)與發(fā)射光譜特性，研究適合近紅外成像的激光共聚焦顯微技術(shù)；研究近紅外量子點(diǎn)在三維培養(yǎng)干細(xì)胞中的示蹤技術(shù)，發(fā)展基于熒光成像的二維、三維培養(yǎng)干細(xì)胞分化過程定量分析手段。5）活體干細(xì)胞的三維、非損傷性示蹤技術(shù)：研究近紅外光在活體干細(xì)胞中的散射與吸收性質(zhì)，開發(fā)利用近紅外量子點(diǎn)標(biāo)記的活體動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)；并且利用活體動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)，對(duì)移

40、植體內(nèi)的近紅外量子點(diǎn)標(biāo)記的干細(xì)胞進(jìn)行三維示蹤；結(jié)合納米磁性粒子造影技術(shù)，通過核磁共振成像對(duì)磁性納米粒子標(biāo)記的干細(xì)胞在活體內(nèi)的維持和分化進(jìn)行成像示蹤。承擔(dān)單位：中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所課題負(fù)責(zé)人：王強(qiáng)斌學(xué)術(shù)骨干：鄧宗武、吳東岷、李曉然經(jīng)費(fèi)比例：17%四、年度計(jì)劃年度研究?jī)?nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年構(gòu)建適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維支架，建立干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系。三維培養(yǎng)體系下干細(xì)胞表型研究，并與二維培養(yǎng)體系相比較。建立三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞定向分化的研究體系，檢測(cè)比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞功能等。用二維培養(yǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，建立穩(wěn)定的

41、蛋白質(zhì)/磷酸化蛋白質(zhì)分離、純化、質(zhì)譜學(xué)鑒定、以及生物信息學(xué)分析的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析體系。模式動(dòng)物干細(xì)胞體內(nèi)觀察體系和小鼠腦內(nèi)立體定位細(xì)胞導(dǎo)入的方法研究。制備熒光光譜從可見光區(qū)到近紅外區(qū)的量子點(diǎn)和超順磁納米顆粒，對(duì)其表面進(jìn)行功能化修飾，對(duì)量子點(diǎn)熒光性能研究。選擇適宜干細(xì)胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)材料，建立干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系。獲得三維培養(yǎng)干細(xì)胞形態(tài)、增殖情況、凋亡情況等細(xì)胞表型結(jié)果。初步建立三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞定向分化體系。建立成熟的能鑒定超過3000個(gè)干細(xì)胞總蛋白和1000個(gè)磷酸化位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)體系。獲得多個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因線蟲株系，并完成系統(tǒng)跟蹤神經(jīng)干細(xì)胞及其分化子細(xì)胞在體內(nèi)的生成、遷移以及分化過程；得到小鼠腦內(nèi)細(xì)

42、胞導(dǎo)入的立體定位參數(shù)。制備得到高質(zhì)量的量子點(diǎn)和磁性粒子，并對(duì)其表面進(jìn)行生物相容性修飾；完成單分子/單量子點(diǎn)熒光成像系統(tǒng)搭建。 發(fā)表論文3-5篇第二年1三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化2三維培養(yǎng)干細(xì)胞的自我更新相關(guān)基因的表達(dá)研究。3三維培養(yǎng)干細(xì)胞定向分化的研究4制備二維和三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞的蛋白質(zhì)樣品，并應(yīng)用IMAC技術(shù)和免疫親和層析技術(shù)純化磷酸化蛋白，乙?；鞍?、以及泛素化蛋白，并進(jìn)行初步的質(zhì)譜學(xué)分析。5獲得二維和三維不同培養(yǎng)狀態(tài)下的干細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，利用microRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。對(duì)篩選到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。6檢測(cè)以Wnt，Notch為代表的信號(hào)分子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)維持及定

43、向分化的影響。開展全基因組RNAi篩選，確定與體內(nèi)干細(xì)胞定向分化相關(guān)的潛在靶基因。 7優(yōu)化近紅外量子點(diǎn)和磁性納米顆粒對(duì)三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記的條件， 并將經(jīng)納米材料示蹤標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞將通過立體定位的方法直接導(dǎo)入到包裹小鼠紋狀體的腦室側(cè)壁，即神經(jīng)干細(xì)胞的niche區(qū)。8利用特異性的識(shí)別分子對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行修飾，制備特異性修飾量子點(diǎn)，通過單分子/單量子點(diǎn)熒光共定位技術(shù)研究量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞及其亞結(jié)構(gòu)組分的特異性標(biāo)記，并進(jìn)行體外干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及標(biāo)記；優(yōu)化磁共振影像技術(shù)中磁共振影像脈沖序列、空間分辨率和以細(xì)胞數(shù)量為基準(zhǔn)的信號(hào)靈敏度等系統(tǒng)指標(biāo)。1初步獲得二維、三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和定向分化相關(guān)基因

44、表達(dá)差異。2制備能夠進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的二維和三維干細(xì)胞總蛋白樣品。其中每個(gè)總蛋白樣品不少于1毫克，每個(gè)蛋白質(zhì)修飾的樣品不少于500微克。3確定二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在生長和分化過程中microRNA的時(shí)空表達(dá)譜。系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定一批二維和三維培養(yǎng)條件下未分化干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化細(xì)胞中有表達(dá)差異的microRNA。4 探明以Wnt，Notch為代表的信號(hào)分子在神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)維持及定向分化中的作用， 確定幾個(gè)與體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化相關(guān)的靶基因。5 完成三位培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞體外納米材料標(biāo)記的適宜條件和干細(xì)胞腦內(nèi)導(dǎo)入。6實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)對(duì)細(xì)胞及其亞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)單分子水平雙色熒光共定位測(cè)量，定位精度20

45、nm；完成對(duì)磁共振影像技術(shù)的各種優(yōu)化指標(biāo)。發(fā)表論文5-8篇第三年1三維培養(yǎng)干細(xì)胞發(fā)育潛能鑒定。2三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。3三維培養(yǎng)干細(xì)胞定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究。4大規(guī)模的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。系統(tǒng)地鑒定并比較二維和三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)和翻譯后修飾的差異。5microRNA基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控研究：microRNA基因結(jié)構(gòu)分析，包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、可能的內(nèi)含子等；重點(diǎn)分析獨(dú)立轉(zhuǎn)錄的microRNA基因的上游調(diào)控元件；用報(bào)告基因系統(tǒng)研究microRNA基因的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。6對(duì)RNAi篩選獲得的靶基因進(jìn)行初步表達(dá)圖譜分析，解析其在神經(jīng)干細(xì)胞定向分化中可能的細(xì)胞自主或

46、非自主性行為，并獲得相應(yīng)突變體，進(jìn)一步分析該靶基因功能，開展以EMS為主的化學(xué)誘變，分離神經(jīng)干細(xì)胞定向分化有缺陷的突變株系。7小鼠體內(nèi)納米示蹤標(biāo)記，系統(tǒng)地檢測(cè)外源神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的維持、分化行為。同時(shí)使用核磁共振活體成像技術(shù)，分析外源神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、定位、遷移、分化等。8將近紅外量子點(diǎn)或磁性納米粒子標(biāo)記的干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記，研究適合近紅外成像的激光共聚焦顯微技術(shù)，然后利用熒光信號(hào)進(jìn)行二維培養(yǎng)干細(xì)胞在老鼠體內(nèi)行為示蹤，實(shí)現(xiàn)活體干細(xì)胞的標(biāo)記；利用磁共振影像示蹤技術(shù)系統(tǒng)研究二維培養(yǎng)干細(xì)胞移植小鼠腦部后的維持分化過程及其功能。1獲得二維、三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞發(fā)育潛能差異結(jié)果。2確定二維、三維培

47、養(yǎng)干細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)差異。3明確mTOR信號(hào)通路在干細(xì)胞定向分化中的作用4確定新發(fā)現(xiàn)的microRNA的基因結(jié)構(gòu)；確定一些microRNA的啟動(dòng)子元件和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。5揭示某些細(xì)胞因子、小分子化合物在人類心肌分化上的作用機(jī)制。6通過5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)， 定量鑒定出超過3000/1000個(gè)二維和三維培養(yǎng)干細(xì)胞的總蛋白/磷酸化位點(diǎn)，以及不少于50個(gè)乙酰化和泛素化位點(diǎn)。7進(jìn)一步確認(rèn)與神經(jīng)干細(xì)胞維持分化有關(guān)的幾個(gè)靶基因的功能，并分離神經(jīng)干細(xì)胞定向分化缺陷株系。8完成約60-80只小鼠的腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入，系統(tǒng)地分析外源神經(jīng)干細(xì)胞在小鼠腦內(nèi)的定位、遷移、維持與分化。9實(shí)現(xiàn)二維培養(yǎng)干細(xì)胞的近紅外量子點(diǎn)標(biāo)記三維熒光成

48、像技術(shù)和磁性納米粒子的活體磁共振成像。發(fā)表論文5-8篇第四年1三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步研究。生物信息學(xué)分析，找出三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并用生物化學(xué)和分子生物學(xué)的手段對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)的研究結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。microRNA在干細(xì)胞自我更新和定向分化中的功能研究和靶基因的鑒定。利用多種蛋白標(biāo)記，深入分析化學(xué)誘變獲得的突變體其表型產(chǎn)生的根源，開展基因克隆，表達(dá)譜建立等工作，結(jié)合遺傳互作，蛋白質(zhì)互作，找到哺乳動(dòng)物中相對(duì)的同源蛋白，通過RNAi等基因敲除手段研究其在三維培養(yǎng)干細(xì)胞中調(diào)控干細(xì)胞維持和分化的作用。將三位培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞將通過立體定位的

49、方法移植到舞蹈病模型小鼠腦內(nèi)，功能上評(píng)估外源干細(xì)胞參與神經(jīng)組織修復(fù)的能力。利用活體熒光成像手段或者核磁共振成像技術(shù)對(duì)三維培養(yǎng)的干細(xì)胞和活體干細(xì)胞進(jìn)行示蹤。建立基于熒光成像的三維培養(yǎng)干細(xì)胞分化過程的定量分析手段；利用磁共振影像示蹤技術(shù)系統(tǒng)研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞移植體內(nèi)后的維持分化過程及其功能，在單納米粒子水平研究干細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特異性標(biāo)記技術(shù)，實(shí)現(xiàn)納米示蹤與成像。爭(zhēng)取確定15-20個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)，找出調(diào)控三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子。2. 闡明在干細(xì)胞定向分化中mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路是否起關(guān)鍵調(diào)控作用。3. 篩選多個(gè)影響干增殖分化的microRNA；鑒定多個(gè)microRNA調(diào)控的靶基因

50、并進(jìn)行相關(guān)功能研究。4. 揭示某些細(xì)胞因子、小分子化合物在人類心肌分化上的作用機(jī)制。5通過系統(tǒng)地研究與神經(jīng)干細(xì)胞維持分化有關(guān)的幾個(gè)靶基因，確定靶基因間的相互調(diào)控關(guān)系以及在哺乳動(dòng)物三位培養(yǎng)干細(xì)胞中的作用6完成約60只舞蹈病模型小鼠的腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞導(dǎo)入，系統(tǒng)地從功能上分析外源神經(jīng)干細(xì)胞參與神經(jīng)退行性疾病模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)組織的修復(fù)。7實(shí)現(xiàn)三維培養(yǎng)干細(xì)胞的近紅外量子點(diǎn)標(biāo)記三維熒光成像技術(shù)和磁性納米粒子的活體磁共振成像。發(fā)表論文5-10篇。第五年1確定調(diào)控三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和定向分化信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子的基礎(chǔ)上，對(duì)其上下游的調(diào)控因子及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入研究。2進(jìn)一步確定神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)維持、定向分化調(diào)

51、控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步從病理學(xué)上分析外源神經(jīng)干細(xì)胞移植后的維持與分化。3預(yù)備結(jié)題。1建立干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系和干細(xì)胞納米示蹤成像方法。2豐富和完善干細(xì)胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建立調(diào)控三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新信號(hào)和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2確定神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)維持、定向分化相關(guān)的幾個(gè)靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；完成外源神經(jīng)干細(xì)胞參與神經(jīng)退行性疾病損傷組織修復(fù)的功能評(píng)估。發(fā)表論文5-10篇。一、研究?jī)?nèi)容本項(xiàng)目的主要研究?jī)?nèi)容如下：（一）干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立1）干細(xì)胞培養(yǎng)三維支架材料的制備分離純化膠原蛋白，制備三維支架材料，使其具有良好的生物相容性、適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，制備適合干細(xì)胞培養(yǎng)的三維膠原支架材料。細(xì)胞外基質(zhì)成份膠原

52、蛋白本身為機(jī)體內(nèi)細(xì)胞所處三維環(huán)境中的固有成份，其具有良好的細(xì)胞相容性，可最大限度地在體外模擬體內(nèi)干細(xì)胞生活的環(huán)境。2）三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化在膠原支架材料的基礎(chǔ)上，考慮多方因子和因素，將微環(huán)境中調(diào)控干細(xì)胞自我更新和定向分化的其它細(xì)胞外基質(zhì)成份、信號(hào)分子或支持細(xì)胞等因素整合到膠原支架材料上，對(duì)三維膠原支架材料進(jìn)行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細(xì)胞自我更新和定向分化的環(huán)境。3）干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞的自我更新、代謝、形態(tài)學(xué)及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化，包括用免疫染色及活細(xì)胞成像技術(shù)等觀察細(xì)胞粘附特性及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)特性等。

53、干細(xì)胞選擇多潛能干細(xì)胞（ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞）和成體干細(xì)胞（神經(jīng)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞）。（二）三維培養(yǎng)干細(xì)胞的發(fā)育潛能與自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究1）ES細(xì)胞是最為人們熟知的多能性細(xì)胞，iPS細(xì)胞具有ES細(xì)胞相似的多能性。我們?cè)诮⑴咛ジ杉?xì)胞三維培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能，利用嵌合以及四倍體補(bǔ)償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細(xì)胞多能性，并與二維培養(yǎng)體系下干細(xì)胞的發(fā)育潛能相比較。2）細(xì)胞多能性的維持受到內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子Oct4和Nanog等調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制，外源信號(hào)和內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子之間協(xié)同作用共同維持ES細(xì)胞的不分化狀態(tài)。我們擬在建立ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞三維

54、培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上，研究調(diào)控細(xì)胞多能性的這些因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析其如何相互協(xié)同共同控制多能性細(xì)胞的不分化狀態(tài)。并與二維培養(yǎng)體系下干細(xì)胞的自我更新調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相比較。（三）三維培養(yǎng)干細(xì)胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究研究將以向神經(jīng)、心肌、骨骼肌的分化研究為主，主要內(nèi)容如下：1）檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌、成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)屬性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等。檢測(cè)并比較干細(xì)胞定向分化過程中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平的變化，用免疫染色及活細(xì)胞成像技術(shù)等觀測(cè)細(xì)胞粘附特性及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)特性等。2）運(yùn)用生化方法檢測(cè)并比較二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在分化過程中受外界信號(hào)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)

55、胞內(nèi)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，分析它們各自信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性。其中神經(jīng)細(xì)胞研究將以Erk及mTOR信號(hào)通路為主。心肌細(xì)胞研究利用已建立的人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的體外培養(yǎng)模型，在三維培養(yǎng)條件下利用基因芯片或深度測(cè)序的方法取得基因表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建三維條件下心肌分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。骨骼肌細(xì)胞的研究將以PI3K/AKT/GSK3信號(hào)通路為主。（四）三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新與定向分化的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究1）外界的誘導(dǎo)物如生長因子或其它一些小分子可以和細(xì)胞表面的受體結(jié)合并在細(xì)胞內(nèi)引起級(jí)聯(lián)放大的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。這些級(jí)聯(lián)放大的信號(hào)可以控制或調(diào)節(jié)一系列參與細(xì)胞生長、增殖和分化的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，如基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)以及蛋白質(zhì)的合成，修飾和降解。蛋白質(zhì)激酶是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最重要的分子，干細(xì)胞的自我更新是受磷酸化蛋白嚴(yán)密調(diào)控的。我們將系統(tǒng)而定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下多潛能細(xì)胞與成體干細(xì)胞自我更新