SPR技術(shù)的應(yīng)用專(zhuān)題

1、1902 年 Wood 在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) SPR 現(xiàn)象；1941 年 Fano 解釋了 SPR 現(xiàn)象；1971 年 Kretschmann 為 SPR 傳感器結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)；1983 年 Liedberg 將 SPR 用于 IgG 與其抗原的反應(yīng)測(cè)定； n1987 年 Knoll 等人開(kāi)始 SPR 成像研究；1990 年 Biacore AB 公司開(kāi)發(fā)出首臺(tái)商品化 SPR 儀器；2016 年 SPR 技術(shù)被正式收錄到美國(guó)和日本藥nn,m典。生物藥分析檢測(cè)方法之 SPR 技術(shù)！近年來(lái)，全球生物制藥發(fā)展異常迅猛，新的生物藥分析檢測(cè)技術(shù)亦層出不窮，SPR 技術(shù)作為其中一員，憑借著其突出的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定

2、性和高重復(fù)性，在 2016 年被正式收錄到美國(guó)和日本的藥典（見(jiàn)美國(guó)藥典USP39 General Information /（1105）Immunological Test Methods- Surface Plasmon Resonance 章節(jié)和日本藥典 2016 版 JP17 General Information / Biotechnological / Biological Products- Surface Plasmon Resonance，2478 頁(yè)）。小編懷著強(qiáng)烈的好奇心，在SPR 技術(shù)知識(shí)的海洋中游走多天，終于撈到了一點(diǎn)點(diǎn)干貨，給大家分享一下。Q+ SPR檢測(cè)技術(shù)的可靠如

3、何？全球生物制藥發(fā)展異常迅猛，新的生物藥分析檢測(cè)技術(shù)亦層出不窮，SPR 技術(shù)作為其中一員，憑借著其突出的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和高重復(fù)性，在 2016 年被正式收錄到美國(guó)和日本的藥典（見(jiàn)美國(guó)藥典USP39 General Information /（1105）Immunological Test Methods- Surface Plasmon Resonance 章節(jié)和日本藥典 2016 版 JP17 General Information / Biotechnological / Biological Products- Surface Plasmon Resonance，2478 頁(yè)）。Q+ S

4、PR到底是不是拉曼光譜？Q1什么是SPR？SPR（Surface plasmon resonance），被稱(chēng)為表面等離子體共振，又稱(chēng)表面等離激元共振，本質(zhì)上是一種物理光學(xué)現(xiàn)象。Q2 SPR技術(shù)檢測(cè)原理是什么？首先，回顧幾個(gè)物理概念：等離子體：通常指由密度相當(dāng)高的自由正、負(fù)電荷組成的氣體，其中正、負(fù)帶電粒子數(shù)目幾乎相等，對(duì)外呈現(xiàn)電中性，是物質(zhì)存在的一種狀態(tài)，與固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)并列，成為物質(zhì)的第四態(tài)，宇宙中大部分物質(zhì)處于等離子狀態(tài)。金屬表面等離子波：把金屬的價(jià)電子看成是均勻正電荷背景下運(yùn)動(dòng)的電子氣體，這實(shí)際上也是一種等離子體。因?yàn)榻饘僦械膬r(jià)電子可以自由移動(dòng)，入射光可能激起電子氣的縱向振動(dòng)，振動(dòng)產(chǎn)生

5、的電荷密度波，沿著金屬和電介質(zhì)的界面?zhèn)鞑?，形成表面等離子波。消逝波：當(dāng)光線(xiàn)從光密介質(zhì)射入到光疏介質(zhì)時(shí)，如果入射角大于某一臨界角（光線(xiàn)遠(yuǎn)離法線(xiàn)）時(shí)，折射光線(xiàn)將會(huì)消失，會(huì)發(fā)生全反射現(xiàn)象，當(dāng)光從光密介質(zhì)射向光疏介質(zhì)并且入射角大于一定角度時(shí)，當(dāng)以波動(dòng)光學(xué)的角度來(lái)研究全反射時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)入射光到達(dá)界面時(shí)并不是直接產(chǎn)生反射光，而是先透過(guò)光疏介質(zhì)約一個(gè)波長(zhǎng)的深度，再沿界面流動(dòng)約半個(gè)波長(zhǎng)再返回光密介質(zhì)，而光的總能量沒(méi)有發(fā)生改變，則透過(guò)光疏介質(zhì)的波被稱(chēng)為消逝波（見(jiàn)下圖）?，F(xiàn)在，我們來(lái)看看 SPR 的檢測(cè)原理：當(dāng)光源發(fā)出的 P 偏振光（電磁波）以一定的角度入射到棱鏡中，在棱鏡與金屬的界面處將發(fā)生反射和折射，當(dāng)入射

6、角大于臨界角時(shí)，光線(xiàn)將發(fā)生全內(nèi)反射，在全內(nèi)反射的情況下，電場(chǎng)在金屬與棱鏡的界面處并不立即消失，而是向金屬介質(zhì)中傳輸振幅呈指數(shù)衰減的消逝波，同時(shí)引發(fā)金屬中的自由電子產(chǎn)生表面等離子波，當(dāng)金屬表面等離子波與消逝波發(fā)生共振時(shí)，檢測(cè)到的反射光強(qiáng)度會(huì)大幅度地減弱，能量從光子轉(zhuǎn)移到表面等離子，入射光的大部分能量被金屬表面等離子波吸收，使得反射光的能量急劇減少。當(dāng)入射光波長(zhǎng)固定時(shí)，反射光強(qiáng)度是入射角的函數(shù)，其中反射光強(qiáng)度最低時(shí)所對(duì)應(yīng)的入射角為共振角（Resonance Angle）。表面等離子共振（SPR）對(duì)附著在金屬薄膜表面的介質(zhì)折射率非常敏感，當(dāng)表面介質(zhì)的屬性改變或者附著量改變時(shí)，共振角將不同。因此，SP

7、R 譜（共振角的變化 VS 時(shí)間）能夠反映與金屬膜表面接觸的體系的變化。上圖中展示的是 SPR 芯片工作原理， 這里的 SPR 芯片指的是一個(gè)帶有葡聚糖（Dextran）的金屬表面（Mental Surface），而配體蛋白（Ligand）的氨基端可以與葡聚糖結(jié)合從而被固定到金屬表面。下方光源發(fā)出的一個(gè)單波長(zhǎng)激光束進(jìn)入到棱鏡（Prism）中，導(dǎo)致多角度的光線(xiàn)入射到金屬表面，幾乎所有入射的光線(xiàn)都會(huì)發(fā)生反射，但有一個(gè)例外，在入射角達(dá)到某一個(gè)角度時(shí)，光子的能量會(huì)被金屬吸收轉(zhuǎn)化成表面等離子體波，在這個(gè)角度沒(méi)有光線(xiàn)被反射出來(lái)，而是以很小的強(qiáng)度被檢測(cè)器檢測(cè)到，這個(gè)角度被稱(chēng)為共振角。由于等離子體波會(huì)在金屬表

8、面?zhèn)鞑?，所以金屬表面偶?lián)的配體蛋白與任何物質(zhì)發(fā)生相互作用都將導(dǎo)致共振角發(fā)生改變。這兩張圖是對(duì) SPR 芯片工作原理的進(jìn)一步解釋?zhuān)篈 圖中有一偶聯(lián)了抗原的芯片，當(dāng)樣本流過(guò)芯片，抗體與抗原結(jié)合，導(dǎo)致樣本通道（Sample Channel 2）的共振角發(fā)生改變，而對(duì)照通道（Reference Channel 1，是沒(méi)有偶聯(lián)抗原的對(duì)照表面）共振角不發(fā)生改變，此時(shí)利用這兩個(gè)通道共振角之差（Channel2-Channel 1）繪制出的共振單位 RU（Resonance Units）隨時(shí)間變化的曲線(xiàn)是一個(gè)向上的曲線(xiàn)，當(dāng)樣本被洗去且抗體開(kāi)始從抗原結(jié)合處解離下來(lái)，此時(shí)出現(xiàn)的傳感曲線(xiàn)是一個(gè)向下的曲線(xiàn)。B 圖顯示

9、的是結(jié)合多個(gè)蛋白的情況，當(dāng)抗體結(jié)合到抗原上時(shí)出現(xiàn)的傳感曲線(xiàn)是一個(gè)向上的曲線(xiàn)，之后如果有另一個(gè)包含抗體的受體的樣本流過(guò)芯片，則會(huì)在上一個(gè)曲線(xiàn)基礎(chǔ)上向上形成另一個(gè)曲線(xiàn)。Q3 SPR技術(shù)的發(fā)展歷程是怎樣的？1902 年 Wood 在光學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) SPR 現(xiàn)象；1941 年 Fano 解釋了 SPR 現(xiàn)象；1971 年 Kretschmann 為 SPR 傳感器結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)；1983 年 Liedberg 將 SPR 用于 IgG 與其抗原的反應(yīng)測(cè)定；1987 年 Knoll 等人開(kāi)始 SPR 成像研究；1990 年 Biacore AB 公司開(kāi)發(fā)出首臺(tái)商品化 SPR 儀器；2016 年 SPR

10、技術(shù)被正式收錄到美國(guó)和日本藥典。Q4 SPR技術(shù)有哪些用途？SPR 技術(shù)可用于生物分子間結(jié)合特異性的分析、濃度定量、結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力分析以及熱力學(xué)分析，能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè) DNA 與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)分子之間、藥物與蛋白之間、核酸與核酸之間、抗原與抗體之間以及受體與配體等生物分子之間的相互作用。Q5如何使用SPR技術(shù)？2016 年 SPR 技術(shù)被正式收錄到美國(guó)和日本藥典后，越來(lái)越多的被應(yīng)用到生物藥的研發(fā)和質(zhì)控中。近期發(fā)表于 Biomaterials 上的一篇關(guān)于改造 Fc 片段作為蛋白藥物載體從而優(yōu)化蛋白藥物給藥途徑的文章中，SPR 技術(shù)被用于對(duì)比 FcRn（Cat#FCM-H5286, ACRO

11、Biosystems, Newark, DE）與改造前 Fc 片段和改造后 Fc 片段結(jié)合的動(dòng)力學(xué)差異，具體實(shí)驗(yàn)流程及結(jié)果如下：器材：Biacore T100 & CM5 傳感器芯片（GE Healthcare, Pittsburgh, PA）。主要試劑：soluble human Neonatal Fc-receptor (FcRn, Cat#FCM-H5286, ACROBiosystems, Newark, DE).簡(jiǎn)易流程：1. 芯片表面預(yù)處理：利用共價(jià)結(jié)合將 FcRn 蛋白偶聯(lián)在羧基化處理的葡聚糖芯片（CM5）表面。偶聯(lián)方法分很多種，包括直接偶聯(lián)（氨基偶聯(lián)、巰基偶聯(lián)、醛偶聯(lián)等）和捕獲

12、（親和素生物素捕獲系統(tǒng)、NTA6His 捕獲系統(tǒng)等）兩大類(lèi)。此實(shí)驗(yàn)選擇氨基共價(jià)偶聯(lián)：第一步芯片活化，pH 4.5-5 條件下使用交聯(lián)劑 EDC / NHS 使芯片表面酯化；第二步配體偶聯(lián)（配體蛋白純度要求在 90% 以上，用量以 30-50KD 蛋白為例，需準(zhǔn)備蛋白濃度 10-50ug/ml，1ml 左右，隨著蛋白性質(zhì)的不同和分子量的變化可以調(diào)整），將購(gòu)自 ACROBiosystems 的 FcRn 蛋白偶聯(lián)到 CM5 芯片表面（酯化后的芯片表面酯基和 FcRn 蛋白上的氨基發(fā)生反應(yīng)）；第三步封閉，用 1M 乙醇胺鹽酸鹽（PH8.5）封閉芯片上多余的有活性的羧基。此次實(shí)驗(yàn) FcRn 最終偶聯(lián)水

13、平為 9000RU（Response Units）。對(duì)照表面的設(shè)計(jì)：CM5 芯片分 1，2，3，4 四個(gè) Flow Cell 通道，一般 1，2 通道配對(duì)使用（1 通道作為參比），3，4 通道配對(duì)使用（3 通道作為參比），參比通道對(duì)照表面可設(shè)計(jì)成空白表面、活化-封閉無(wú)配體固定的表面或偶聯(lián)了偽裝配體的表面。此次實(shí)驗(yàn)參比通道對(duì)照表面選擇活化-封閉無(wú)配體固定的方式來(lái)做削減對(duì)照，當(dāng)對(duì)進(jìn)樣過(guò)程進(jìn)行分析時(shí)，對(duì)照表面的削減可用來(lái)消除因樣品溶解緩沖液與儀器運(yùn)行緩沖液成分不同所造成的容積差及一些非特異性結(jié)合信號(hào)。2. 進(jìn)樣：首先用運(yùn)行緩沖液（50 mM phosphate, 100 mM sodium chlo

14、ride, and 0.01% vol/vol Tween 20, pH 6.0 or 7.4）稀釋樣本，此實(shí)驗(yàn)樣本有 recombinant Fc （重組Fc蛋白），sc（Fc）2 （單鏈Fc二聚體）， hGH-Fc（人生長(zhǎng)激素Fc融合蛋白）和 hGH-sc（Fc）2 （人生長(zhǎng)激素單鏈Fc二聚體融合蛋白）四種。進(jìn)樣時(shí)間為 2min（重組Fc蛋白組為 1min 除外），進(jìn)樣流速 20ul/min， 蛋白解離時(shí)間為 2.5min。3. 芯片再生：殘留蛋白用再生緩沖液（10 mM HEPES, 150 mM NaCl, and 0.01% vol/vol Tween 20, pH 7.4)）洗脫下

15、來(lái)，時(shí)間為 30sec，流速設(shè)為 30ul/min。4. 數(shù)據(jù)分析：Biacore T100 評(píng)價(jià)軟件（version2.0.2）分析生成傳感圖。SPR傳感圖結(jié)果展示：上圖是 PH6.0 條件下，連續(xù)兩倍稀釋法稀釋的四種待測(cè)樣本分別與 CM5 芯片上偶聯(lián)的 FcRn（Cat#FCM-H5286，ACROBiosystems，Newark，DE）結(jié)合的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析結(jié)果圖，圖中對(duì)應(yīng)樣本分別是：（A） Fc （稀釋梯度為 400 nM to 6.25nM），（B） sc（Fc）2（稀釋梯度為 3,200 nM to 6.25 nM），（C）hGH- sc（Fc）2（稀釋梯度為 6,400 nM to 50 nM）， and （D）hGH-Fc（稀釋梯度為 6,400 nM to 6.25 nM）。除了上文中提到的應(yīng)用外，SPR 技