分子生物學(xué)C 自整

1、Immunology based techniques:ELISA酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點?；驹?它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）酶作用的底物（顯色劑）測量時，抗原（抗體）先結(jié)合在固相載體上，但仍保留其免疫活性，然后加一種抗體（抗原）與

2、酶結(jié)合成的偶聯(lián)物（標(biāo)記物），此偶聯(lián)物仍保留其原免疫活性與酶活性，當(dāng)偶聯(lián)物與固相載體上的抗原（抗體）反應(yīng)結(jié)合后，再加上酶的相應(yīng)底物，即起催化水解或氧化還原反應(yīng)而呈顏色。其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。特點:靈敏性高:該測定法的靈敏度來自作為報告基團(tuán)的酶。眾所周知, 酶是一種有機催化劑，很少量的酶即可誘導(dǎo)大量的催化反應(yīng) ，產(chǎn)生可供觀察的顯色反應(yīng)現(xiàn)象。因此該體系常被稱為酶放大體系。ELISA實現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水

3、平上對其進(jìn)行定量。特異性強:其特異性來自抗體或抗原的選擇性。抗原抗體的結(jié)合實質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。Immunohistochemistry免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。基本原理：抗體

4、和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來，以其達(dá)到對組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。免疫組織化學(xué)的臨床應(yīng)用主要包括以下幾方面：惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；對某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型；軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免

5、疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。為臨床提供治療方案的選擇。Western Blotting蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。蛋白免疫印跡(Western Blot)是將電泳分離后的細(xì)胞或組織總蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質(zhì)檢測技術(shù)，

6、現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。基本原理：與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋

7、白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。Immunoprecipitation免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。優(yōu)點（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免

8、人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險性。（4）靈敏度沒有親和色譜高。Cytometry流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個細(xì)胞，并能同時從一個細(xì)胞中測得多個參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點，成

9、為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。流式細(xì)胞儀( Flow cytometry ,FCM) 將流體噴射技術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子技術(shù)和計算機技術(shù)等集于一體,較其它方法有不可比擬的優(yōu)越性，既可定性又可定量,且具有簡單、快速和敏感性高的特點,可進(jìn)行多參數(shù)和活體細(xì)胞分析。在APO 的研究得到較為廣泛的應(yīng)用，開辟了新途徑。特點1.測量速度快；2.可進(jìn)行多參數(shù)測量；3.是一門綜合性的高科技方法（ FCM綜合了光學(xué)，電子學(xué)，流體力學(xué)，細(xì)胞化學(xué)，免疫學(xué)，激光和計算機等多門學(xué)科和技術(shù)）；4.既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。Animal models:動物疾病模型主要用于實驗生理學(xué)、實驗病理學(xué)和實驗治療學(xué)（包括

10、新藥篩選）研究。人類疾病的發(fā)展十分復(fù)雜，以人本身作為實驗對象來深入探討疾病發(fā)生機制，推動醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展來之緩慢，臨床積累的經(jīng)驗不僅在時間和空間上都存在局限性，而且許多實驗在道義上和方法上也受到限制。而借助于動物模型的間接研究，可以有意識地改變那些在自然條件下不可能或不易排除的因素，以便更準(zhǔn)確地觀察模型的實驗結(jié)果并與人類疾病進(jìn)行比較研究，有助于更方便、更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，研究防治措施。動物模型的優(yōu)越性主要表現(xiàn)在以下幾下方面。（一）避免了在人身上進(jìn)行實驗所帶來的風(fēng)險（二）臨床上平時不易見到的疾病可用動物隨時復(fù)制出來（三）可以克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發(fā)病率低的缺點（四）可以嚴(yán)

11、格控制實驗條件，增強實驗材料的可比性（五）可以簡化實驗操作和樣品收集（六）有助于更全面地認(rèn)識疾病的本質(zhì)因此利用動物疾病模型來研究人類疾病，可以克服平時一些不易見到，而且不便于在病人身上進(jìn)行實驗的各種人類疾病的研究。同時還可克服人類疾病發(fā)生發(fā)展緩慢，潛伏期長，發(fā)病原因多樣，經(jīng)常伴有各種其它疾病等因素的干擾，可以用單一的病因，在短時間內(nèi)復(fù)制出典型的動物疾病模型，對于研究人類各種疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和防治疾病療效的機理等是極為重要的手段和工具。Genetics modelDevelopment modelSpecial model (e.g. language model and circadian

12、 model)Diseases modelCell culture based techniquesCell viability test細(xì)胞活力檢測：由組織中分離細(xì)胞檢查活力以了解分離過程對細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查細(xì)胞活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。Cell migration test細(xì)胞遷移也稱為細(xì)胞爬行、細(xì)胞移動或細(xì)胞運動，是指細(xì)胞在接收到遷移信號或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動。細(xì)胞遷移為細(xì)胞頭部偽足的延伸、新的黏附建立、細(xì)胞體尾部收縮在時空上的交替過程。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一，是機體正常生長發(fā)育的生理過程，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運動形式。胚胎發(fā)育、血管生

13、成、傷口愈合、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中都涉及細(xì)胞遷移。細(xì)胞凋亡檢測：為了研究某一蛋白質(zhì)在細(xì)胞遷移中所扮演的角色，一般來說科學(xué)家可以將某蛋白的編碼基因進(jìn)行突變，甚至應(yīng)用新近的RNAi現(xiàn)象，或者加入該蛋白質(zhì)的阻斷劑（inhibitor）來抑制某一個蛋白質(zhì)的表現(xiàn)，并分析此抑制對于細(xì)胞遷移的影響，反而得知被抑制的蛋白質(zhì)與細(xì)胞遷移的作用。Apoptosis detection細(xì)胞凋亡檢測：在胚胎發(fā)育、造血、免疫系統(tǒng)的成熟以及維護(hù)正常組織和器官的細(xì)胞恒定與生長平衡，乃至機體衰老方面都起著重要作用。因此，有關(guān)凋亡的研究在臨床和基礎(chǔ)等各個領(lǐng)域已經(jīng)廣泛開展,凋亡細(xì)胞的檢測方法顯得非常重

14、要。Cell cycle synchronization在一般培養(yǎng)條件下，群體中的細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期時相之中。為了研究某一時相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋亡，常需采取一些方法使細(xì)胞處于細(xì)胞周期的同一時相，這就是細(xì)胞同步化技術(shù)。選用DNA合成抑制劑可逆地抑制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其他細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)，最終可將細(xì)胞群體阻斷在G1/S期交界處；一些抑制微管聚合的藥物，因抑制有絲分裂裝置的形成和功能行使，可將細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，即使細(xì)胞同步于M期。同步化細(xì)胞的檢測：對各個時期的同步化細(xì)胞可通過流式細(xì)胞術(shù)來鑒定其細(xì)胞周期，通過比較各時相細(xì)胞的百分比，看是否達(dá)到預(yù)期的目的。High conten

15、t screeningHCS是指在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細(xì)胞形態(tài)、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)各個環(huán)節(jié)的影響, 在單一實驗中獲取大量與基因、蛋白及其他細(xì)胞成分相關(guān)的信息, 確定其生物活性和潛在毒性的過程。同時, 也是一種應(yīng)用高分辨率的熒光數(shù)碼影像系統(tǒng)，旨在獲得被篩樣品對細(xì)胞產(chǎn)生的多維立體和實時快速的生物效應(yīng)信息, 在細(xì)胞水平上檢測多個指標(biāo)的多元化、功能性篩選技術(shù)平臺。HCS的優(yōu)勢高內(nèi)涵篩選的篩選結(jié)果是多樣化的,它以多指標(biāo)多靶點共同作用為主要特點,涉及的靶點包括胞內(nèi)成分、細(xì)胞的膜受體、細(xì)胞器等。從篩選載體上看，高內(nèi)涵藥物篩選與高通量藥物篩選并沒有顯著的

16、區(qū)別，也在微孔板上進(jìn)行。其優(yōu)點是它的檢測體積并未因檢測指標(biāo)增加而增高，操作步驟同樣簡單可行、自動化。更重要的是, 獲取信息是以細(xì)胞為單位，而不像是以微板孔為單位，這就意味著研究者可以從細(xì)胞群體中的各種反應(yīng)獲取信息，而不是像以前那樣信息僅僅來源于一個微板孔中的所有細(xì)胞的平均反應(yīng)。也就是說，研究者得以用更少的時間和花費進(jìn)行更多的實驗，獲取更多研究信息和統(tǒng)計相關(guān)數(shù)據(jù)?；诩?xì)胞的小分子庫高內(nèi)涵篩選已用于識別新的有治療作用的先導(dǎo)化合物，目前已對十萬余個化合物展開了基于圖像的篩選。目前高內(nèi)涵藥物篩選主要在影響細(xì)胞功能方面應(yīng)用，例如細(xì)胞毒性、G蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)劑、轉(zhuǎn)錄因子的活化、活性物質(zhì)釋放等。可調(diào)節(jié)的掃描

17、模板可用于腔室玻片、多孔板以及組織芯片掃描。多重掃描任務(wù)可應(yīng)用于單個腔室或多孔，對個體實驗設(shè)計提供最大的自由度。獲取的數(shù)據(jù)立刻傳輸?shù)奖镜胤?wù)器以便進(jìn)行有效分析和存儲，獨立于平臺的開放式顯微鏡環(huán)境(OME)接口自動創(chuàng)建鏈接到現(xiàn)有的圖像分析解決方案總而言之，HCS為單個實驗提供高度的靈活性和真實的圖像，并確保高通量研究所需的自由度，應(yīng)用廣泛且靈活性強。Imaging based techniquesFluorescent labeling熒光標(biāo)記技術(shù)指利用一些能發(fā)射熒光的物質(zhì)共價結(jié)合或物理吸附在所要研究分子的某個基團(tuán)上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。FRET熒光共振能量轉(zhuǎn)移當(dāng)一個熒光分子

18、（又稱為供體分子）的熒光光譜與另一個熒光分子（又稱為受體分子） 的激發(fā)光譜相重疊時， 供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光， 同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減。FRET 程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為710 nm 時即可發(fā)生FRET; 隨著距離延長， FRET呈顯著減弱。 供體和受體之間FRET的效率，可以由E=1/1+(R/R0)exp6反映，其中R表示供體和受體之間的距離，R0表示福氏半徑，依賴供體發(fā)射譜和受體激發(fā)譜的重疊程度，以及供體和受體能量轉(zhuǎn)移的偶極子的相對方位。發(fā)生原理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指在兩個不同的熒光基團(tuán)中，如果一個熒光基團(tuán)（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另

19、一個基團(tuán)（受體 Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個熒光基團(tuán)間的距離合適時（一般小于100），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即以前一種基團(tuán)的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到后一個基團(tuán)發(fā)射的熒光。簡單地說，就是在供體基團(tuán)的激發(fā)狀態(tài)下由一對偶極子介導(dǎo)的能量從供體向受體轉(zhuǎn)移的過程，此過程沒有光子的參與，所以是非輻射的，供體分子被激發(fā)后，當(dāng)受體分子與供體分子相距一定距離，且供體和受體的基態(tài)及第一電子激發(fā)態(tài)兩者的振動能級間的能量差相互適應(yīng)時，處于激發(fā)態(tài)的供體將把一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給受體，使受體被激發(fā)，在整個能量轉(zhuǎn)移過程中，不涉及光子的發(fā)射和重新吸收。如果受體熒光量子產(chǎn)率為零，則發(fā)生能

20、量轉(zhuǎn)移熒光熄滅；如果受體也是一種熒光發(fā)射體，則呈現(xiàn)出受體的熒光，并造成次級熒光光譜的紅移。Infrared imaging紅外成像技術(shù)是一項前途廣闊的高新技術(shù)。比0.78微米長的電磁波位于可見光光譜紅色以外，稱為紅外線，又稱紅外輻射。是指波長為0.781000微米的電磁波，其中波長為0.782.0微米的部分稱為近紅外，波長為2.01000微米的部分稱為熱紅外線。自然界中，一切物體都可以輻射紅外線，因此利用探測儀測量目標(biāo)本身與背景間的紅外線差可以得到不同的熱紅外線形成的紅外圖像。Dual-Luciferase assayLuciferase報告基因系統(tǒng)是以熒光素(luciferin)為底物來檢測

21、螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統(tǒng)。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物熒光(bioluminescence)。然后可以通過熒光測定儀也稱化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用的一種檢測方法。轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結(jié)合

22、，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式作用元件實現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╨uciferase assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段。其原理簡述如下：（1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前方的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic等。（2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或其它相關(guān)的細(xì)胞系。如果此轉(zhuǎn)錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強度成正比。（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光

23、，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。Live imaging分子成像技術(shù)使活體動物體內(nèi)成像成為可能，它的出現(xiàn)，歸功于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因動物模型的使用、新的成像藥物的運用、高特異性的探針、小動物成像設(shè)備的發(fā)展等諸多因素。分子成像技術(shù)可用于研究觀測特異性細(xì)胞、基因和分子的表達(dá)或互作過程，同時檢測多種分子事件，追蹤靶細(xì)胞，藥物和基因治療最優(yōu)化，從分子和細(xì)胞水平對藥物療效進(jìn)行成像，從分子病理水平評估疾病發(fā)展過程，對同一個動物或病人進(jìn)行時間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。成像的優(yōu)點轉(zhuǎn)基因老鼠分子成像和傳統(tǒng)的體外成像或細(xì)胞培養(yǎng)相比有著明顯

24、優(yōu)點。首先，分子成像能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時間分布，從而了解活體動物體內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)過程、特異性基因功能和相互作用。第二，由于可以對同一個研究個體進(jìn)行長時間反復(fù)跟蹤成像，既可以進(jìn)步數(shù)據(jù)的可比性，避免個體差異對試驗結(jié)果的可影響，又不需要殺死模式動物，節(jié)省了大筆科研用度。第三，尤其在藥物開發(fā)方面，分子成像更是具有劃時代的意義。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，由于進(jìn)進(jìn)臨床研究的藥物中大部分由于安全題目而終止，導(dǎo)致了在臨床研究中大量的資金浪費，而分子成像技術(shù)的問世，為解決這一困難提供了廣闊的空間，將使藥物在臨床前研究中通過利用分子成像的方法，獲得更具體的分子或基因述水平的數(shù)據(jù)，這是用傳統(tǒng)的方法無法了解的領(lǐng)域，所

25、以分子成像將對新藥研究的模式帶來革命性變革。其次，在轉(zhuǎn)基因動物、動物基因打靶或制藥研究過程中，分子成像能對動物的性狀進(jìn)行跟蹤檢測，對表型進(jìn)行直接觀測和（定量）分析。MRIMolecular cloning techniquesRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴增。RT-PCR的指數(shù)擴增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數(shù)的RN

26、A。RT-PCR廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監(jiān)測某種RNA的含量。檢測基因表達(dá)的方法，參見Northern Blot法。RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉(zhuǎn)錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，即鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反轉(zhuǎn)錄酶和莫羅尼鼠類白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反轉(zhuǎn)錄酶。在完成逆轉(zhuǎn)錄過程之后,通過PCR進(jìn)行定量分析的時候，隨著技術(shù)的發(fā)展，real-time PCR（實時熒光PCR）或ddPCR（數(shù)字PCR）技術(shù)也被用來做

27、定量分析，它們比普通PCR進(jìn)行定量分析時靈敏度更高，定量更精確。Real-time PCRReal-Time PCR 技術(shù)，又稱實時定量熒光PCR，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行總量分析或通過Ct值對模板進(jìn)行相對定量。定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量

28、PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域。適用性和特點：1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計條件都不能解決。5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。6、廣泛用于人類傳

29、染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。Mutagenesis PCRProkaryotic expression system原核表達(dá)系統(tǒng)：在各種表達(dá)系統(tǒng)中，最早被采用進(jìn)行研究的是原核表達(dá)系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)。該項技術(shù)的主要方法是將已克隆入目的基因DNA片段的載體(一般為質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化細(xì)菌(通常選用的是大腸桿菌)，通過IPTG誘導(dǎo)并最終純化獲得所需的目的蛋白。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達(dá)系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達(dá)系統(tǒng)無法對表達(dá)時間及表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，有些基

30、因的持續(xù)表達(dá)可能會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，過量表達(dá)可能導(dǎo)致非生理反應(yīng)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難；而且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低。Eucaryotic expression system真核表達(dá)系統(tǒng)：為克服上述不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領(lǐng)域，其優(yōu)點是：根據(jù)原核生物蛋白與靶DNA間作用的高度特異性設(shè)計，而靶DNA與真核基因調(diào)控序列基本無同源性，故不存在基因的非特異性激活或抑制；能誘導(dǎo)基因高效表達(dá)，可達(dá)105倍，為其他系統(tǒng)所不及；能嚴(yán)格調(diào)控基因表達(dá)，即不僅可控制基因表達(dá)的“開關(guān)”，還可人為地調(diào)控基因表達(dá)量。因此，利用真核表達(dá)

31、系統(tǒng)來表達(dá)目的蛋白越來越受到重視。目前，基因工程研究中常用的真核表達(dá)系統(tǒng)有酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。genome or cDNA library基因組文庫（Genomic Library）定義：把某種生物基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌克隆子群體中，這個群體即為這種生物的基因組文庫。用限制性內(nèi)切酶切割細(xì)胞的整個基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段，然后將這些DNA片段與載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長成克隆。這樣，一個克隆內(nèi)的每個細(xì)胞的載體上都包含有特定的基因組DNA片段，整個克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和稱為基因組文庫。DNA

32、 sequencingDNA測序（DNA sequencing，或譯DNA定序）是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式?？焖俚腄NA測序方法的出現(xiàn)極大地推動了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)現(xiàn)。在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中，和在眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，如診斷，生物技術(shù)，法醫(yī)生物學(xué)，生物系統(tǒng)學(xué)中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現(xiàn)代的DNA測序技術(shù)的快速測序速度已經(jīng)有助于達(dá)到測序完整的DNA序列，或多種類型的基因組測序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。測序目的：確定重組DNA的方向與結(jié)構(gòu)對突變進(jìn)行定位和鑒定

33、比較研究Next generation sequencing日本大阪大學(xué)產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究所的傳合知二教授和谷口正輝副教授的研究小組利用電測方法，成功識別構(gòu)成DNA（脫氧核糖核酸）的核酸堿基的一個分子。這一方法與目前的DNA測序檢測原理完全不同，具有超高速、無標(biāo)記和低成本的優(yōu)點，在量體定制個人醫(yī)療、精確搜查罪犯、超高速檢驗病毒等領(lǐng)域具有極高應(yīng)用價值。相關(guān)論文發(fā)表在自然納米技術(shù)雜志網(wǎng)絡(luò)版上。依據(jù)個人遺傳信息開發(fā)醫(yī)療藥品、根據(jù)精確的DNA檢測迅速抓捕罪犯、超高速高精度檢查流感病毒，這些都要求開發(fā)出快速低成本的DNA測序法。實現(xiàn)下一代DNA測序的基本原理是在納米空洞中配置納米電極，用電測方法測量一個DNA

34、的核酸堿基排列。但是電測識別一個分子的技術(shù)開發(fā)極其困難，尚未有驗證該原理的實例。研究小組利用納米加工技術(shù)制作電極間距為1納米的電極，這種方法能在納米電極間以0.01納米的精度進(jìn)行控制。隨后將核酸堿基的一個分子夾在電極之間，通電后經(jīng)過測定發(fā)現(xiàn)有三個核酸堿基分子顯示異常電流值，證明通過電測可識別一個分子單位的核酸堿基分子種類。這種電測方法是下一代DNA測序基本原理在世界上首次驗證成功。研究人員將納米電極放入溶解在水溶液中的構(gòu)成DNA要素的4個核酸堿基分子，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。在測定電極間的電流時間變化時發(fā)現(xiàn)，除腺嘌呤之外的3個核酸堿基分子各有不同的電流值，根據(jù)電流值的不同，可識別出

35、不同的核酸堿基分子。在兩個核酸堿基分子等量混合時進(jìn)行測定，可觀測到兩個核酸堿基分子的特征性電流峰值，驗證了可根據(jù)電流值識別相應(yīng)的核酸堿基分子。Gene manipulationViral vectors related technology LentivirusAAVphage display病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入其他細(xì)胞，進(jìn)行感染的分子機制?？砂l(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中?？蓱?yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗?？晒├玫牟《究煞譃槟孓D(zhuǎn)錄病毒、慢病毒與腺病毒。Transgenic animal將外源重組基因轉(zhuǎn)染并整合到動物受體細(xì)

36、胞基因組中，從而形成在體內(nèi)表達(dá)外源基因的動物，稱為轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)系統(tǒng)，包括外源基因、表達(dá)載體和受體細(xì)胞等，基因組的轉(zhuǎn)移則是細(xì)胞核移植和動物克隆技術(shù)，人工合成與設(shè)計基因、全基因乃至基因組的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是合成生物學(xué)。遺傳的基本物質(zhì)是DNA，基因則是位于染色體上有遺傳效應(yīng)的DNA片段，對于儲存在生物全套染色體中的全部遺傳信息，可稱其為基因組。由于不同種類、不同個體的生物基因組成是不同的，因此對動物個體來說，非自身的基因成分屬于外源基因，如果把外源基因整合或?qū)雱游锶旧w基因中，那么這個外源基因就被稱為轉(zhuǎn)基因(transgene)(即轉(zhuǎn)移來的基因)，這種動物就是轉(zhuǎn)基因動物（transgeni

37、c animals）。轉(zhuǎn)基因動物是指將特定的外源基因?qū)珓游锸芫鸦蚺咛ィ怪€(wěn)定整合于動物的染色體基因組并能遺傳給后代的一類動物。TetON/tetOFF systemCre/Lox systemCre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用，是條件性基因打靶、誘導(dǎo)性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心?；贑re-LoxP的基因打靶要分兩步來進(jìn)行。首先要在胚胎干細(xì)胞的基因組中引入LoxP序列，這一步可以通過打靶載體的設(shè)計和對同源重組子的篩選來實現(xiàn)。下一步通過Cre介導(dǎo)的重組來實現(xiàn)靶基因的遺傳修飾或改變。Cre-LoxP系統(tǒng)既可以在細(xì)胞水平上用Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染中靶細(xì)胞，

38、通過識別LoxP位點將抗性標(biāo)記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標(biāo)記基因的條件性敲除小鼠?；蛘邔re基因置于可誘導(dǎo)的啟動子控制下，通過誘導(dǎo)表達(dá)Cre重組酶而將LoxP位點之間的基因切除（誘導(dǎo)性基因敲除），實現(xiàn)特定基因在特定時間或者組織中的失活。RNA interferenceRNA干擾（RNA interference, RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象?；虺聊饕修D(zhuǎn)錄前水平的基因沉默(TGS)和轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉

39、默(PTGS)兩類:TGS是指由于DNA修飾或染色體異染色質(zhì)化等原因使基因不能正常轉(zhuǎn)錄;PTGS是啟動了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶mRNA序列特異性的降解機制。有時轉(zhuǎn)基因會同時導(dǎo)致TGS和PTGS。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，（長度超過三十的dsRNA會引起干擾素毒性）所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域。1.高效性 2、特異性 位置效應(yīng) 競爭效應(yīng)可傳播性Antisense RNA反義RNA，根據(jù)反義RNA的作用機制可將其分為3類：類反義RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和（或）部分編碼區(qū)，直接抑制翻譯，或與靶mRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，從而易被R

40、NA酶 降解；類反義RNA與mRNA的非編碼區(qū)結(jié)合，引起mRNA構(gòu)象變化，抑制翻譯；類反義RNA則直接抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄。反義RNA是指與mRNA互補的RNA分子，也包括與其它RNA互補的RNA分子。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補結(jié)合, 即抑制了該mRNA的翻譯。通過反義RNA控制mRNA的翻譯是原核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種方式，最早是在E.coli 的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的，許多實驗證明在真核生物中也存在反義RNA。近幾年來通過人工合成反義RNA的基因, 并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成反義RNA，即能抑制某特定基因的表達(dá)，阻斷該基因的功能，有助于了解該基因?qū)?xì)胞生長和分化的作用。同時也暗示了該方法對腫瘤實施基因治療的可能性。功能在原核生物中反義RNA具有多種功能，例如調(diào)控質(zhì)粒的復(fù)制及其接合轉(zhuǎn)移，抑制某些轉(zhuǎn)位因子的轉(zhuǎn)位，對某些噬菌體溶菌-溶源狀態(tài)的控制等。下文僅舉數(shù)例。