(優(yōu)選)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用課件

1、（優(yōu)選）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用第一節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)概述瓶子中的細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)：將組織分散成單細(xì)胞，使其在類似于體內(nèi)生存環(huán)境、適宜的體外條件下的生存、生長并維持其結(jié)構(gòu)與功能的技術(shù)。培養(yǎng)過程中細(xì)胞不再形成組織。培養(yǎng)對(duì)象（培養(yǎng)物）是單個(gè)細(xì)胞（群）。（1）概念類似、內(nèi)涵相近（2）培養(yǎng)對(duì)象、培養(yǎng)物的差異（3）二者無嚴(yán)格的界限，可以相互轉(zhuǎn)化辨別：細(xì)胞培養(yǎng)與組織培養(yǎng)的區(qū)別和聯(lián)系？動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 植物細(xì)胞培養(yǎng)（1）技術(shù)的難度（2）專業(yè)的切合角度（3）關(guān)注熱度和應(yīng)用價(jià)值課程內(nèi)容微生物細(xì)胞培養(yǎng)營養(yǎng)要求復(fù)雜、培養(yǎng)條件嚴(yán)格培養(yǎng)的細(xì)胞容易發(fā)生變化培養(yǎng)與真實(shí)的生存環(huán)境有差異簡化生長環(huán)境、方便控制因素細(xì)胞群均一性好、大量、成本低大規(guī)

2、模生產(chǎn)生物制品細(xì)胞培養(yǎng)的利與弊細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程的關(guān)系細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)各環(huán)節(jié)中承上啟下的紐帶。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞工程的最基礎(chǔ)、最核心的技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論方法，按照人們的設(shè)計(jì)，通過細(xì)胞水平上的操作，定向改造細(xì)胞或生物體、創(chuàng)造新種、加速繁育、獲得產(chǎn)物。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合 細(xì)胞器/核移植基因轉(zhuǎn)移染色體操作細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程通過人工培養(yǎng)獲得細(xì)胞或細(xì)胞代謝產(chǎn)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程獲得具有新遺傳特性或特定屬性的產(chǎn)物、組織或生物體細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程細(xì)胞工程是現(xiàn)代生物技術(shù)各環(huán)節(jié)中承上啟下的紐帶。核移植、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、胚胎發(fā)育綜

3、合應(yīng)用克隆羊細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程無限細(xì)胞系、細(xì)胞融合、細(xì)胞免疫的綜合應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程染色體技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)的綜合應(yīng)用多倍體育種動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史1907年：哈里森（Harrison），蛙胚神經(jīng)組織，單玻片懸滴培養(yǎng)法創(chuàng)始人。1923年，卡雷爾（Carrel），卡氏瓶培養(yǎng)法，細(xì)胞組織生存空間的開拓者。1951年， 厄爾（Eagle） ，體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的人工合成培養(yǎng)基開發(fā)者。 波米拉（Pomerat），懸浮培養(yǎng)。1957年，杜爾貝科（Dulbecco），胰蛋白酶消化單層細(xì)胞培養(yǎng)法先行者。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用動(dòng)物育種生物制品生產(chǎn)生物基礎(chǔ)研究臨床醫(yī)學(xué)醫(yī)學(xué)診斷與治療（1）疾病診斷（2）細(xì)胞植入治療羊

4、膜穿刺術(shù) 地中海貧血骨髓細(xì)胞（3）藥物效應(yīng)檢測(cè)動(dòng)物篩選細(xì)胞篩選高效、經(jīng)濟(jì)、特異性檢測(cè)有毒物質(zhì),把致癌、致畸形的物質(zhì)加入培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行染色體的檢驗(yàn),進(jìn)而推斷物質(zhì)的毒性；生物制品的生產(chǎn)夢(mèng)想現(xiàn)實(shí)OR？疫苗激素干擾素單克隆抗體這些都已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)動(dòng)物細(xì)胞作為表達(dá)宿主，可生產(chǎn)蛋白質(zhì)類的生物制品，病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體 ；魚類病毒學(xué)：病毒的分離、鑒定以及病毒疫苗的制備魚類細(xì)胞毒理學(xué)：評(píng)價(jià)樣品對(duì)魚類細(xì)胞的毒性等水產(chǎn)生物基礎(chǔ)理論魚類免疫學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)在水產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用第二節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)知識(shí)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 英國科學(xué)家胡克（R.Hook,1635-1703),27歲成為英國皇家學(xué)會(huì)領(lǐng)導(dǎo)成員, 發(fā)表對(duì)

5、木栓的觀察，命名Cell。荷蘭人列文虎克（Antoni von Leeuwenhoek,1623-1723）用自磨鏡片做成顯微鏡第一次觀察了活的細(xì)菌和原生動(dòng)物。19世紀(jì)中期細(xì)胞學(xué)說建立施萊登施旺19世紀(jì)中期細(xì)胞學(xué)說建立施萊登施旺細(xì)胞學(xué)說的要點(diǎn)：1、生物體都是由細(xì)胞構(gòu)成；2、細(xì)胞由分裂產(chǎn)生新細(xì)胞；3、細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能（生命活動(dòng)）的基本單位。非細(xì)胞結(jié)構(gòu):細(xì)胞結(jié)構(gòu)：病毒：HIV 、SARS、流感病毒、噬菌體等原核細(xì)胞：真核細(xì)胞：藍(lán)藻細(xì)菌 放線菌支原體 衣原體 立克次氏體所有動(dòng)物除藍(lán)藻外的植物真菌：如蘑菇、酵母菌、霉菌生物原核細(xì)胞真核細(xì)胞原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的本質(zhì)差異原核細(xì)胞真核細(xì)胞無以核膜為界限

6、的細(xì)胞核有以核膜為界限的細(xì)胞核較小較大只有核糖體一種細(xì)胞器多種復(fù)雜的細(xì)胞器無染色體，有DNA分子有染色體（DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成）原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的本質(zhì)差異圓球形、 多面體形、 紡錘形、長梭形、 管狀、 長柱形、 分枝狀、 不規(guī)則性 。細(xì)胞的多樣性支原體巨型烏賊神經(jīng)細(xì)胞蕨藻鴕鳥卵卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核膜細(xì)胞核核仁線粒體高爾基體核糖體細(xì)胞膜溶酶體中心體葉綠體 細(xì)胞壁液泡動(dòng)、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及區(qū)別動(dòng)物細(xì)胞與植物細(xì)胞的比較 細(xì)胞器動(dòng)物細(xì)胞植物細(xì)胞 細(xì)胞壁無有 葉綠體無有 液泡無有 溶酶體有無 圓球體無有 營養(yǎng)方式異養(yǎng)自養(yǎng) 通訊連接方式間隙連接胞間連絲 中心體有無 胞質(zhì)分裂方式收縮環(huán)細(xì)胞板細(xì)胞的分裂一個(gè)母細(xì)

7、胞經(jīng)過一系列復(fù)雜的變化后，分裂成兩個(gè)子細(xì)胞的過程，叫做細(xì)胞分裂。受精卵兩個(gè)子細(xì)胞四個(gè)子細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞分裂的意義？單細(xì)胞生物個(gè)體數(shù)目增多細(xì)胞數(shù)目增多多細(xì)胞生物2、細(xì)胞的生長與生長周期子細(xì)胞從周圍吸收營養(yǎng)，合成自身的組成物質(zhì)、不斷地長大的過程。生長的結(jié)果？生長生長3、細(xì)胞的分化產(chǎn)生了各種不同形態(tài)、功能的細(xì)胞，它們構(gòu)成了生物體的各種結(jié)構(gòu)，以適應(yīng)環(huán)境。細(xì)胞分化的結(jié)果：在個(gè)體發(fā)育中，由一個(gè)或一種細(xì)胞增殖產(chǎn)生的后代，在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定差異的過程，叫細(xì)胞分化。12345細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞分化細(xì)胞生長細(xì)胞分裂、生長、分化的結(jié)果分裂：使細(xì)胞數(shù)目增多生長：使細(xì)胞體積增大分化：使細(xì)胞種類增多細(xì)胞有壽

8、命嗎?細(xì)胞能無限制的分裂嗎?細(xì)胞的衰老、死亡細(xì)胞的衰老： 一般指復(fù)制衰老，即體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂后，停止分裂，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝活動(dòng)發(fā)生顯著改變的現(xiàn)象。形態(tài)：細(xì)胞水分減少導(dǎo)致細(xì)胞萎縮， 體積變小。結(jié)構(gòu)：核增大，色素積累， 染色質(zhì)固縮。功能：新陳代謝速度減慢， 呼吸速度減慢 （線粒體功能退化、形變） 有些酶的活性降低 （酪氨酸酶） 細(xì)胞膜通透性功能改變。 衰老細(xì)胞的主要特征細(xì)胞死亡自動(dòng)死亡被動(dòng)死亡(細(xì)胞凋亡)(細(xì)胞壞死)遺傳物質(zhì)控制外界因素 最主要的一種方式，受Bcl-2家族、caspase家族等基因控制的主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺行為。凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞

9、間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。凋亡小體形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個(gè)凋亡小體。凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化。細(xì)胞凋亡過程動(dòng)物個(gè)體內(nèi)不同類型和壽命的細(xì)胞接近于動(dòng)物的整體壽命的細(xì)胞，如神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞等。在胚胎發(fā)育終了時(shí)，這些細(xì)胞不再增加數(shù)量，在個(gè)體的生長期中它們可增長細(xì)胞體積，以使其與軀體成比例。它們隨著個(gè)體衰老而衰老，或者由于這些細(xì)胞的衰老、死亡引起個(gè)體死

10、亡。緩慢更新的細(xì)胞，它們的壽命短于動(dòng)物的平均壽命，如肝細(xì)胞，胃壁細(xì)胞等?？焖俑碌募?xì)胞，如皮膚的表皮細(xì)胞、紅細(xì)胞和白細(xì)胞等。Hayflick界限 細(xì)胞（至少是培養(yǎng)的細(xì)胞），不是不死的、而是有一定壽命的。它們的增殖能力不是無限的，而是有一定界限的。Leonard Hayflick (1928 )正在檢查他培養(yǎng)的WI-38細(xì)胞 體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖與個(gè)體壽命的關(guān)系物種 成纖維細(xì)胞傳代數(shù) 個(gè)體最長壽命（年）龜 90-125 175水貂 30-34 10雞 15-35 30小鼠 14-28 3.5人 胚胎 40-60 110 出生至15歲 20-40 15歲以上 10-30 早老病患者 2-10 10-2

11、0細(xì)胞的無限增殖與癌變癌 Cancer基因控制無限增殖衰老死亡梅艷芳 宮頸癌馬三立 膀胱癌文興宇 肺癌羅京 淋巴癌陳曉旭 乳腺癌腫瘤細(xì)胞正常細(xì)胞為什么會(huì)轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞？癌細(xì)胞正常細(xì)胞原癌基因抑癌基因突變突變癌基因失去抑制作用不能控制（致癌因子的作用）不受控制，惡性增殖原癌基因抑癌基因癌基因（1）物理致癌因子：輻射（紫外線、X射線、電離輻射等）致癌的外界因素（2）化學(xué)致癌因子：無機(jī)物如石棉、砷化物、鉻化物、鎘化物等；有機(jī)物如黃曲霉素、亞硝胺、尼古丁、甲醛、 苯、聯(lián)苯胺、煤焦油、苯并芘等（3）病毒致癌因子： 感染人的細(xì)胞，將其基因整合進(jìn)入人的基因組，誘發(fā)癌變?nèi)纾焊腥疽腋尾《究烧T發(fā)肝癌； 感染人乳頭狀

12、病毒可誘發(fā)宮頸癌； EB病毒是一種皰疹病毒，使兒童患淋巴癌、成人 患鼻咽癌。如何預(yù)防癌癥？ 在多細(xì)胞生物中，每個(gè)個(gè)體細(xì)胞的細(xì)胞核具有個(gè)體發(fā)育的全部基因，只要條件許可，細(xì)胞都可發(fā)育成完整的個(gè)體。細(xì)胞經(jīng)分裂和分化后仍具有形成完整有機(jī)體的潛能或特性。細(xì)胞的全能性高度分化的植物體細(xì)胞具有全能性，離體植物細(xì)胞在一定營養(yǎng)的物質(zhì)、激素和其他適宜的外界條件下，能表現(xiàn)其全能性。高度分化的動(dòng)物體細(xì)胞也具有全能性嗎？ 誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（iPScell）創(chuàng)始人之一。 2006年山中伸彌等科學(xué)家把4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)入小鼠的成纖維細(xì)胞，使其變成多功能干細(xì)胞。這意味著未成熟的細(xì)胞能夠發(fā)展成所有類型的細(xì)胞。 2

13、007年，他所在的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)人體表皮細(xì)胞使之具有胚胎干細(xì)胞活動(dòng)特征的方法。此方法誘導(dǎo)出的干細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)樾呐K和神經(jīng)細(xì)胞，為研究治療多種心血管絕癥提供了巨大助力，這一研究成果在全世界被廣泛應(yīng)用。山中伸彌京都大學(xué)IPS細(xì)胞研究所所長2012年，獲得諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 細(xì)胞全能性高低與細(xì)胞分化程度有關(guān)，分化程度越高，細(xì)胞全能性越低，全能性表達(dá)越困難。胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞多能干細(xì)胞全能干細(xì)胞專能干細(xì)胞干細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞核的全能性第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件 細(xì)胞培養(yǎng)是以第一流的技術(shù)為基礎(chǔ)的，沒有其它可接受的標(biāo)準(zhǔn)。高深的理論知識(shí)本身不能產(chǎn)生良好的培養(yǎng)。我相信有了實(shí)踐才能產(chǎn)生滿意的結(jié)果。動(dòng)物

14、組織培養(yǎng)英國，華斯萊實(shí)操理論動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的難點(diǎn)1、營養(yǎng)要求復(fù)雜；2、動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，對(duì)剪切力敏感；3、適應(yīng)環(huán)境能力差，對(duì)環(huán)境（pH、溶解氧、溫度、剪切力）敏感；4、倍增時(shí)間長，生長緩慢，易受微生物污染。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件（1）無菌條件無菌條件是細(xì)胞體外培養(yǎng)最基本的條件。！當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此在進(jìn)行培養(yǎng)中，保持細(xì)胞生存環(huán)境無污染、代謝物及時(shí)清除等，是維持細(xì)胞生存的基本條件。蒸汽滅菌過濾除菌化學(xué)滅菌輻射滅菌火焰滅菌多重保險(xiǎn)、確保無污染抗生素?zé)o菌室（十萬級(jí)）無菌操作臺(tái)（百級(jí)）著裝

15、視頻資料污染難100%避免及時(shí)確認(rèn)污染采取必要措施看 檢及時(shí)確認(rèn)發(fā)生的微生物污染最常發(fā)生的是霉菌和細(xì)菌污染。霉菌污染易于發(fā)現(xiàn)，如培養(yǎng)液中長出了各種菌落，肉眼可見，不難確認(rèn)細(xì)菌感染時(shí)，有的引起培養(yǎng)液混濁，鏡下可見大量細(xì)菌，有的培養(yǎng)液無明顯改變?nèi)鐟岩晌廴荆匾獣r(shí)可向肉湯或瓊脂培養(yǎng)基里滴少量培養(yǎng)物，置37溫箱培養(yǎng)數(shù)日，觀察有無菌落形成，以驗(yàn)證是否污染。經(jīng)常發(fā)生和難以發(fā)現(xiàn)的是支原體污染。PPLO體積小，只有0.25 1 m大小，且無細(xì)胞壁。 PPLO污染后的細(xì)胞仍然能生存，甚至無明顯變化，有時(shí)導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生不同程度的病理改變。（2）營養(yǎng)條件 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)營養(yǎng)要求非常嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、

16、葡萄糖、核酸外，還需要血清。培養(yǎng)液是細(xì)胞營養(yǎng)的直接來源。碳水化合物：提供碳骨架和能量氨基酸：12種基本氨基酸（精氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸）和谷氨酰胺維生素：常用的有煙酰胺、葉酸、核黃素、維生素B12、泛酸、吡哆醇及維生素C，維持細(xì)胞生長生長因子：包括激素類物質(zhì)和促生長因子，如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、血小板生長因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、生長調(diào)節(jié)素等無機(jī)鹽：鉀、鈉、鈣、鎂、氮和磷等基本元素外，也需微量元素，如鐵、鋅、硒等血清成分：激素生長因子結(jié)合蛋白貼壁擴(kuò)展因子微量元素如硒缺點(diǎn)：價(jià)格貴、質(zhì)量不穩(wěn)定（3）理

17、化條件溫度pH滲透壓氣分壓體外體內(nèi) 溫度維持細(xì)胞旺盛生長須有恒定適宜的溫度。細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比，低溫下會(huì)使細(xì)胞代謝速率降低。溫度過高導(dǎo)致細(xì)胞死亡，這主要是由酶和蛋白質(zhì)所需要的最適溫度決定的。如人體細(xì)胞最適溫度為36.50.5，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。恒溫培養(yǎng)箱 魚類是變溫動(dòng)物，耐溫范圍較廣，因此魚類細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度的要求沒有哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)那么嚴(yán)格。牙鲆鰓細(xì)胞系大西洋鱈前腎巨噬細(xì)胞對(duì)蝦肌肉組織細(xì)胞草魚細(xì)胞水生哺乳動(dòng)物2）pH值：動(dòng)物細(xì)胞生長大多需要輕微堿性環(huán)境，最佳為7.27.過酸（低于6）或過堿（高于7.6）可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這主要與蛋白質(zhì)的變性和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)

18、受損有關(guān)。耐受性強(qiáng) 耐受性差3）氣體二氧化碳培養(yǎng)箱氣體是細(xì)胞生長代謝的必需條件，主要包括氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)(TCA)，產(chǎn)生細(xì)胞生長增殖所需的能量和合成細(xì)胞生長所需用的各種成分。二氧化碳主要具有調(diào)節(jié)pH的作用。供給的體積分?jǐn)?shù)一般為5%。4）滲透壓 用平衡鹽溶液配制各種試劑、洗滌，主要含無機(jī)鹽和葡萄糖。魚類細(xì)胞可耐受的滲透壓范圍更廣。某些海水魚，需要添加1.5%的氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓。海洋節(jié)肢動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（4）常用培養(yǎng)器培養(yǎng)板培養(yǎng)皿細(xì)胞反應(yīng)器疫苗、激素生產(chǎn)培養(yǎng)瓶第四節(jié)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)一、培養(yǎng)細(xì)胞的生長類型和特征貼壁型細(xì)胞懸浮型細(xì)胞(非貼壁型)兼性貼壁細(xì)胞：種類較少成纖維細(xì)胞型上皮細(xì)胞

19、型不規(guī)則多角形放射狀梭形火焰形球形游走型、多形型密度高、適用大規(guī)模培養(yǎng)三大類培養(yǎng)細(xì)胞的生長特點(diǎn)a)貼附生長b)接觸抑制c)密度依賴性 細(xì)胞貼壁是一個(gè)非常復(fù)雜的多因素相關(guān)過程，支持物表面的清潔程度、所帶電荷以及培養(yǎng)基中的一些蛋白、激素、多肽類物質(zhì)都會(huì)影響，血清促進(jìn)細(xì)胞貼壁主要是糖蛋白起的作用。三大特點(diǎn) 粘附是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式 粘附是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式含義：有兩方面結(jié)果：基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須粘附于一固相表面才能生存和生長。培養(yǎng)細(xì)胞的貼附、伸展1234接觸抑制：細(xì)胞在貼壁生長過程中，

20、隨著細(xì)胞分裂，數(shù)量增加，形成一個(gè)單層，此時(shí)細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。50代以后失去接觸抑制接觸抑制1.培養(yǎng)的細(xì)胞之間仍有在形態(tài)和機(jī)能上的相互依存關(guān)系。在結(jié)構(gòu)上，如：上皮細(xì)胞仍見有橋粒在生理活動(dòng)上，單個(gè)細(xì)胞雖能生長繁殖, 但不如群體細(xì)胞能力強(qiáng)，當(dāng)相鄰細(xì)胞接觸，便導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)停止，細(xì)胞相互溝通生物信息的結(jié)果。 2.培養(yǎng)的細(xì)胞和基質(zhì)之間 對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)仍有依存性 去分化(脫分化):各種分化細(xì)胞，逐漸失去各自的形態(tài)與功能“個(gè)性”，表現(xiàn)出某種趨同性 如:培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞 在適當(dāng)刺激下，可分化為 其它結(jié)締組織細(xì)胞和肌組織細(xì)胞，表現(xiàn)出類似未分化的間充質(zhì)細(xì)胞的特性，返祖 。1. 去分化并不意

21、味著完全返回胚胎時(shí)期的原始細(xì)胞狀態(tài)如:高度分化的神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)已經(jīng)喪失的增生活性不可能恢復(fù) 但已經(jīng)具備的生物電活動(dòng)特性不會(huì)完全失去 2. 再分化：可重新表現(xiàn)出分化特點(diǎn) 如：把表皮細(xì)胞放在氣液界面上培養(yǎng)，可分化成含大量角蛋白絲的角質(zhì)細(xì)胞 、內(nèi)皮細(xì)胞，但，這種能力會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長 逐漸喪失?？傊?，體外培養(yǎng),使細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能上的“可塑性”增大1、取材無菌器械鋒利及時(shí)培養(yǎng)剔除無關(guān)成分營養(yǎng)豐富記錄保存信息資料視頻 原代培養(yǎng)也稱初代培養(yǎng)，是從供體取出組織或分離細(xì)胞接種培養(yǎng)后至第一次傳代之前的細(xì)胞培養(yǎng)階段。二、動(dòng)物細(xì)胞的原代培養(yǎng)選取原則：個(gè)體健壯、無病，無外傷，避免選用某些攜帶內(nèi)源性病菌的魚類。個(gè)體越年

22、輕，其細(xì)胞一般保持較強(qiáng)的分裂能力，體外培養(yǎng)成功的可能性就越大。因此，胚胎或幼體應(yīng)該是細(xì)胞傳代的很好材料。組織材料的來源水生無脊椎動(dòng)物：主要包括甲殼類、貝類、海綿等。水生脊椎動(dòng)物，主要是魚類。 供培養(yǎng)的組織材料要經(jīng)過嚴(yán)格的擦洗、消毒與多次沖洗。海洋動(dòng)物的組織還需用75%酒精、稀高錳酸鉀溶液或二氯化汞、雙氯苯雙胍己烷溶液等再處理，以殺滅海洋中一些弧菌類有機(jī)體。再用維持液反復(fù)沖掉多余消毒劑，這樣處理既能殺死細(xì)菌又能維持細(xì)胞活性。組織材料的清洗消毒弧菌是菌體短小，彎曲成弧形，尾部帶一鞭毛的革蘭氏陰性菌。如霍亂弧菌?；【鷮購V泛分布于河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動(dòng)物體內(nèi)。目前弧菌有91種。主要魚貝類致

23、菌為：溶藻弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌等細(xì)胞懸液的分離：組織材料的分離組織塊的分離：機(jī)械分散法（多級(jí)篩網(wǎng)）剪切分離法酶消化法離心法血液、羊水、胸腔水、腹水胰蛋白酶膠原蛋白水解酶 2、培養(yǎng)方法常用，操作簡便；成功率較高適合組織量少；生長較慢、耗時(shí)長注意事項(xiàng)：輕拿輕放，及時(shí)更換培養(yǎng)液將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法步驟繁瑣、易污染、成本高；適用大量組織、耗時(shí)短、效率高； 應(yīng)用消化分散法將組織細(xì)胞間質(zhì)（基質(zhì)、纖維）除去，使細(xì)胞分散，然后接種培養(yǎng)。酶消化酶消化法 采用較為廣泛的方法，適用于絕大多數(shù)組織，并且在貼壁細(xì)胞傳代時(shí)也多用此種方法。經(jīng)常采用的消化酶有胰

24、蛋白酶、膠原酶等。利用消化法得到的細(xì)胞量大，均一性好，細(xì)胞貼壁后可迅速形成單層。要注意不同組織需不同的消化酶濃度以及消化時(shí)間，否則會(huì)因消化過度而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。胰酶-EDTA消化液能與細(xì)胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細(xì)胞連接松散冷消化熱消化a、貼壁培養(yǎng)法b、懸浮培養(yǎng)法少數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于懸浮生長型，如淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。懸浮生長的細(xì)胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡便。傳代時(shí)不需要再分散，此法細(xì)胞增殖快、產(chǎn)量高。多數(shù)細(xì)胞屬于貼壁生長型，使分散的單細(xì)胞先貼附在瓶壁或支撐物上后，再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。最終在附著表面擴(kuò)展成單層。有接觸抑制的特性，一旦細(xì)胞形成單層,生長就會(huì)受到抑制，細(xì)胞產(chǎn)量有限。（1）組織塊固定法當(dāng)組織量較

25、少時(shí)可采用此法。它是將組織剪成約一立方毫米的小塊, 按一定比例將組織塊貼在瓶壁上, 至少三十分鐘以上, 然后輕輕加人營養(yǎng)液置溫箱培養(yǎng)。 （2）機(jī)械分散法此法適用于細(xì)胞間連接較松散的組織, 如胚胎組織及幼魚全魚。將組織剪成約一立方毫米耐的小塊, 放入底部有一銅網(wǎng)的注射器內(nèi), 用手的壓力將組織擠出網(wǎng)孔, 最后將分散的組織吹打后加人營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)。（3）絡(luò)合劑分散法目前使用的絡(luò)合劑主要是乙二胺四乙酸, 它能與細(xì)胞間鈣離子、鎂離子結(jié)合而使細(xì)胞連接松散, 經(jīng)吹打即可分散。該法目前主要用于囊胚細(xì)胞培養(yǎng)及上皮型細(xì)胞系的傳代。（4）酶消化法該法是目前采用極為廣泛的方法, 適用于絕大多數(shù)組織器官。所用的酶主要是

26、胰酶, 常用濃度是0.25%。根據(jù)酶消化時(shí)溫度的不同, 又可進(jìn)一步分為冷消化法及熱消化法。（5）冷消化法此法是將組織剪成約刀的小塊, 然后置一倍體積的胰酶中, 四攝氏度培養(yǎng)。草魚肝臟組織細(xì)胞的原代培養(yǎng)：1魚體用0.01%高錳酸鉀溶液浸泡消毒半小時(shí)。2用70%酒精棉花擦洗解剖部位。3剖開腹腔，取出0.5cm3的組織，除去粘膜和血塊等，小燒杯中用小剪刀剪碎，用Hanks液洗34次。4轉(zhuǎn)入三角瓶，加0.25%胰酶20消化30分鐘。5消化完畢，加少許Hanks液，離心6倒去消化液，用Hanks液重懸12次。7用含有小牛血清的生長液重懸。8計(jì)數(shù)，分裝培養(yǎng)。實(shí)例視頻資料 細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后，傳到新

27、的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)的過程。進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代。需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)的原因？ 初次傳代的注意點(diǎn)：（1）充分生長；（2）消化時(shí)間的控制；（3）接種量大一些。細(xì)胞濃度應(yīng)在200萬個(gè)細(xì)胞/毫升以上，接種量太少不容易傳代成功。三、動(dòng)物細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1 懸浮細(xì)胞的傳代 直接傳代：使懸浮細(xì)胞沉底，吸掉約2/3上清，懸浮細(xì)胞，然后分別接種兩只或多只培養(yǎng)瓶。 離心傳代：將培養(yǎng)液于1000rpm離心，棄去上清，加入新的生長液，吹打懸浮細(xì)胞，然后分別接種兩只或多只培養(yǎng)瓶。2 貼壁細(xì)胞的傳代確認(rèn)細(xì)胞有無污染，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；消化液量要適當(dāng)，以搖動(dòng)時(shí)能蓋滿單層細(xì)胞為度；消化時(shí)間不宜過久，一般在室溫下靜置25min,當(dāng)見細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞層出現(xiàn)麻布樣網(wǎng)孔、細(xì)胞質(zhì)回縮現(xiàn)象，即可終止消化。終止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培養(yǎng)基。用吸管輕輕吹打瓶壁，使細(xì)胞脫落制成懸液，計(jì)數(shù)后記錄其濃度。接種培養(yǎng)。消化傳代視頻資料1待細(xì)胞長成單層后，倒去培養(yǎng)液，加胰酶-EDTA消化液，當(dāng)單層細(xì)胞呈白色一片，而且細(xì)胞間出現(xiàn)針孔狀空隙時(shí)，停止消化，再倒去消化液。2加入細(xì)胞生長液，吹打分散3分裝培養(yǎng)，一般一瓶傳二瓶，有的細(xì)胞株可以分裝三瓶培養(yǎng)細(xì)胞的生長增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生命期一代貼附生長細(xì)胞的生長過程兩個(gè) 型曲線S培養(yǎng)細(xì)胞的生命期衰老死亡總細(xì)胞產(chǎn)量培養(yǎng)時(shí)間系列傳代原代培養(yǎng)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細(xì)胞的生命期細(xì)胞系連續(xù)細(xì)