東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性及其機(jī)理研究(共10頁(yè))

1、東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性及其機(jī)理(j l)研究【摘要】：東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis(Meyen)是為害嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑是防治這一害蟲(chóng)使用較廣的殺蟲(chóng)劑,為了深入探討東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的抗性機(jī)制,針對(duì)東亞飛蝗不同種群制定相應(yīng)的治理策略,更有效地進(jìn)行抗性治理,本文通過(guò)東亞飛蝗田間種群對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析,探討了東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的現(xiàn)狀;同時(shí)利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),研究分析了抗性產(chǎn)生的生化和分子生物學(xué)機(jī)理,主要研究?jī)?nèi)容如下:一、東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析和增效作用測(cè)定本研究針對(duì)我國(guó)東亞飛蝗發(fā)生規(guī)模、分布特點(diǎn)、農(nóng)藥使用背景差異和

2、種群遺傳特征,采集了河北黃驊、海南黃流和山東無(wú)棣田間種群,選擇有代表性的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行敏感性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),東亞飛蝗無(wú)棣種群對(duì)馬拉硫磷最為敏感,黃驊種群對(duì)毒死蜱和辛硫磷僅有5.4和2.9倍的抗藥性,而黃驊和黃流兩種群對(duì)馬拉硫磷已產(chǎn)生了57.5和14.8倍的抗藥性。可以看出,由于東亞飛蝗不同種群馬拉硫磷選擇壓力的差異已經(jīng)造成(zo chn)不同田間種群對(duì)其抗性程度產(chǎn)生了變化,而且不同的有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)同一種群的選擇壓力已產(chǎn)生不同的抗藥性水平。由此說(shuō)明,研究東亞飛蝗對(duì)常用殺蟲(chóng)劑抗性發(fā)生現(xiàn)狀(xinzhung),建立有效的抗性治理策略,是十分必要的。通過(guò)增效劑磷酸三苯酯(TPP)、順丁烯二酸二乙酯(DE

3、M)及氧化胡椒基丁醚(PBO)在河北黃驊田間種群和敏感品系中對(duì)馬拉硫磷的增效試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),無(wú)論在黃驊種群還是敏感品系中,PBO對(duì)馬拉硫磷都沒(méi)有增效作用(增效比分別為0.9和1.1),但在黃驊種群中TPP和DEM對(duì)馬拉硫磷表現(xiàn)出顯著的增效作用(增效比分別為16.2和3.3),而在敏感品系中TPP和DEM沒(méi)有明顯的增效作用(增效比分別為1.4和1.2);由此推測(cè),酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與黃驊種群馬拉硫磷抗性相關(guān),而細(xì)胞色素P450與馬拉硫磷抗性無(wú)關(guān)。二、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性代謝解毒酶生化機(jī)制研究本研究分析了東亞飛蝗代謝解毒酶系(酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450氧化酶)的生化特性。東亞飛

4、蝗河北黃驊種群和敏感品系代謝解毒酶活性表現(xiàn)出不同程度的差異,其中黃驊種群酯酶對(duì)-NA、-NB及-NA三種底物的水解活性和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)底物CDNB和DCNB水解活性顯著高于敏感品系,分別是敏感品系的2.1-3.2倍和1.2-2.0倍。而對(duì)于細(xì)胞色素P450活性,兩者之間沒(méi)有顯著差異。酯酶聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示,黃驊種群和敏感品系電泳圖譜中條帶帶型沒(méi)有差異,但黃驊種群條帶染色明顯深于敏感品系。據(jù)此推測(cè),黃驊種群與敏感品系之間的酯酶活性和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶差異與河北黃驊東亞飛蝗的抗藥性有關(guān)。用對(duì)氧磷、馬拉氧磷兩種有機(jī)磷抑制劑對(duì)東亞飛蝗海南黃流和山東無(wú)棣種群的羧酸酯酶進(jìn)行體外抑制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5、表明,黃流和無(wú)棣種群的pI_(50)值有顯著差異,黃流種群分別是山東種群的1.16和1.27倍,說(shuō)明黃流種群對(duì)對(duì)氧磷和馬拉氧磷的敏感性較低。然而黃流種群和無(wú)棣種群的羧酸酯酶活性測(cè)定結(jié)果表明,以-NA和-NA為底物時(shí),無(wú)棣種群羧酸酯酶活性分別是黃流種群1.75和1.50倍,具有顯著差異。動(dòng)力學(xué)研究表明,無(wú)棣種群和黃流種群的羧酸酯酶K_和V_(max)值沒(méi)有顯著差異。據(jù)分析黃流種群和無(wú)棣種群羧酸酯酶活性的差異可能是由于生態(tài)環(huán)境的不同所導(dǎo)致的種群分化引起的。根據(jù)目前的研究結(jié)果尚難以斷定對(duì)馬拉硫磷生物測(cè)定中LD_(50)值較低的無(wú)棣種群對(duì)其它農(nóng)藥的敏感性如何?；跓o(wú)棣種群較高的羧酸酯酶活性,我們推測(cè),

6、東亞飛蝗無(wú)棣種群可能對(duì)其它的農(nóng)藥具有較高的抗藥性。三、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性靶標(biāo)酶生化機(jī)制研究本研究分析了東亞飛蝗有機(jī)磷靶標(biāo)乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)的生化特性。對(duì)東亞飛蝗黃驊種群、黃流種群、無(wú)棣種群和敏感品系A(chǔ)ChE活性和動(dòng)力學(xué)比較結(jié)果表明,三個(gè)東亞飛蝗田間種群AChE活性與敏感品系相比有顯著差異,黃驊種群、黃流種群和無(wú)棣種群AChE活性分別是敏感品系的4.04、9.55和1.99倍,并且三個(gè)田間種群的K_m值與敏感品系相比也有顯著差異;根據(jù)有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑對(duì)AChE的體外抑制結(jié)果,河北黃驊種群AChE對(duì)馬拉氧磷、氧化毒死蜱及辛硫磷的敏感性與敏感品系相比分別下

7、降了3.2、2.2和1.1倍。而海南黃流種群對(duì)馬拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性分別下降了11.3和19.2倍。同時(shí)發(fā)現(xiàn),對(duì)馬拉硫磷生物測(cè)定中僅有1.8倍抗藥性的山東無(wú)棣種群,其AChE對(duì)馬拉氧磷和氧化毒死蜱的敏感性也分別下降了4.8和2.4倍。結(jié)合東亞飛蝗解毒酶的生化機(jī)制研究,本文認(rèn)為黃驊種群對(duì)馬拉硫磷的抗性機(jī)理主要包括酯酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性升高和乙酰膽堿酯酶的活性升高以及敏感性下降。黃流種群產(chǎn)生抗性主要是由于AChE的活性升高和敏感性降低引起的。而無(wú)棣種群可能對(duì)其它的農(nóng)藥有較高的抗藥性,導(dǎo)致其AChE敏感性的顯著下降。據(jù)此認(rèn)為,東亞飛蝗不同種群抗性產(chǎn)生機(jī)制是不盡相同的,有可能包括多種不同的

8、抗性機(jī)制。四、東亞飛蝗有機(jī)磷抗性分子機(jī)制研究本研究利用簡(jiǎn)并性引物和降落PCR技術(shù)從東亞飛蝗中克隆獲得了3個(gè)東亞飛蝗羧酸酯酶(carboxylesterases,CarEs)基因的cDNA片段,分別命名為CarE1,CarE2和CarE3。根據(jù)昆蟲(chóng)羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)(motif),采用生物信息學(xué)方法對(duì)東亞飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽(expressingsequencetags,ESTs)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了全面搜索,并對(duì)其進(jìn)行了羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ESTs拼接、注釋,獲得了32條羧酸酯酶ESTs和12條谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶ESTs,與克隆獲得的3條羧酸酯酶基因片段同源比對(duì)和拼接后,共得到3

9、4條羧酸酯酶基因片段。采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)上述羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在黃驊種群和敏感品系中的表達(dá)量進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),羧酸酯酶基因CarE1、CarE4、CarE6、CarE12、CarE15、CarE19、CarE22、CarE23、CarE26、CarE27、CarE30和CarE32在黃驊種群中的表達(dá)量分別是敏感品系的3.29、1.13、8.78、3.16、3.17、11.84、2.24、4.92、6.24、4.66、4.47和4.73倍;谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因GST1、GST2、GST3和GST12的表達(dá)量分別是敏感品系的1.25、1.33、2.47和1.61倍。據(jù)此認(rèn)

10、為這些羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)提高與東亞飛蝗的抗藥性密切相關(guān)。對(duì)東亞飛蝗AChE基因克隆和Westernblot分析結(jié)果認(rèn)為直翅目昆蟲(chóng)AChE基因可能有其特殊性,尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。本文通過(guò)東亞飛蝗不同種群對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析,揭示了東亞飛蝗的田間抗性現(xiàn)狀。通過(guò)生化和分子生物學(xué)方法分析了東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷的抗性機(jī)理,發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗不同種群在產(chǎn)生抗性過(guò)程中的機(jī)制是不盡相同的,有可能包括多種不同的抗性機(jī)制。這些研究結(jié)果對(duì)于有效地進(jìn)行抗性治理,延緩東亞飛蝗的抗性發(fā)展均具有重要的實(shí)踐意義。本文首次借助現(xiàn)有的東亞飛蝗的ESTs數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)抗性相關(guān)解毒酶基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究,用real-tim

11、ePCR對(duì)代謝解毒酶羧酸酯酶基因和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因在抗性和敏感種群中差異表達(dá)進(jìn)行了定量分析,確定了抗性形成過(guò)程中的關(guān)鍵代謝解毒酶基因,這將極大地推動(dòng)?xùn)|亞飛蝗抗性機(jī)制的系統(tǒng)深入研究。綜上所述,本文研究結(jié)果對(duì)東亞飛蝗抗性機(jī)制和東亞飛蝗的抗性治理均具有重要的理論和實(shí)踐意義?！娟P(guān)鍵詞】：東亞飛蝗有機(jī)磷抗性抗性機(jī)理代謝酶靶標(biāo)酶【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：博士【學(xué)位授予年份】：2008【分類(lèi)號(hào)】：S433.2【目錄】：文中部分名詞中英文對(duì)照及縮略語(yǔ)16-18中文摘要18-22ABSTRACT22-27第一章引言27-311本文的研究依據(jù)27-282本文的研究?jī)?nèi)容283本文的目的和意義28

12、-294本研究的特色與創(chuàng)新之處29-31第二章文獻(xiàn)綜述31-73第一節(jié)東亞飛蝗的國(guó)內(nèi)外研究概況31-371.1東亞飛蝗概述31-331.1.1東亞飛蝗分布、生活習(xí)性和形態(tài)特征31-331.2東亞飛蝗國(guó)內(nèi)外研究概況33-371.2.1國(guó)外研究概況33-351.2.2國(guó)內(nèi)研究概況35-37第二節(jié)昆蟲(chóng)抗藥性的研究進(jìn)展37-632.1昆蟲(chóng)抗藥性的定義372.2昆蟲(chóng)抗藥性的分類(lèi)37-382.3昆蟲(chóng)抗藥性研究的歷史和現(xiàn)狀38-392.4昆蟲(chóng)抗藥性的形成及演化39-402.5昆蟲(chóng)抗藥性的研究方法和監(jiān)測(cè)技術(shù)40-472.5.1生物測(cè)定法40-422.5.2生化測(cè)定法42-432.5.3電生理檢測(cè)法432.5.

13、4抗藥性遺傳的測(cè)定43-452.5.5抗藥性分子檢測(cè)45-472.6昆蟲(chóng)抗藥性生理生化機(jī)制47-602.6.1昆蟲(chóng)的行為抗性47-482.6.2昆蟲(chóng)的生理抗性482.6.3昆蟲(chóng)的生化抗性48-602.6.3.1昆蟲(chóng)的代謝抗性48-542.6.3.1.1非專(zhuān)一性酯酶系與抗藥性的關(guān)系49-502.6.3.1.2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與抗藥性的關(guān)系50-522.6.3.1.3細(xì)胞色素P450與抗藥性的關(guān)系52-542.6.3.2昆蟲(chóng)的靶標(biāo)抗性54-602.6.3.2.1乙酰膽堿酯酶靶標(biāo)與抗性的關(guān)系55-572.6.3.2.2擊倒抗性與鈉離子通道57-592.6.3.2.3氨基丁酸受體氯離子通道與昆蟲(chóng)抗藥

14、性59-602.7抗藥性治理60-632.7.1適度治理60-612.7.2飽和治理612.7.3復(fù)合作用治理61-63第三節(jié)我國(guó)東亞飛蝗抗藥性的研究現(xiàn)狀63-733.1我國(guó)東亞飛蝗的為害63-643.2中國(guó)東亞飛蝗發(fā)生區(qū)的生態(tài)類(lèi)型64-663.2.1蝗區(qū)的概念64-653.2.2東亞飛蝗發(fā)生區(qū)的生態(tài)類(lèi)型65-663.3我國(guó)東亞飛蝗的治理66-693.3.1我國(guó)東亞飛蝗治理的發(fā)展進(jìn)程66-673.3.2我國(guó)東亞飛蝗可持續(xù)治理進(jìn)展67-693.4有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的毒理作用69-703.4.1有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑的發(fā)展及其基本特點(diǎn)693.4.2有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑對(duì)昆蟲(chóng)毒殺作用的機(jī)理69-703.4.3有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑馬

15、拉硫磷的基本特點(diǎn)703.5東亞飛蝗有機(jī)磷抗藥性研究70-713.6研究展望71-73第三章東亞飛蝗對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析和增效作用測(cè)定73-811材料與方法74-751.1供試東亞飛蝗的采集及飼養(yǎng)741.2供試藥品74-751.3生物測(cè)定的方法751.4馬拉硫磷增效測(cè)定的方法752結(jié)果與分析75-772.1東亞飛蝗敏感品系和不同田間種群對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性75-762.2東亞飛蝗敏感品系和黃驊種群增效實(shí)驗(yàn)結(jié)果76-773討論77-81第四章東亞飛蝗有機(jī)磷抗性代謝解毒酶生化機(jī)制研究81-971材料與方法82-861.1供試種群821.2供試藥劑82-831.3實(shí)驗(yàn)所用的主要儀器設(shè)備83-841

16、.4酯酶的測(cè)定84-851.4.1酶液的提取841.4.2酯酶活性計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定841.4.3酯酶活力的測(cè)定84-851.4.4羧酸酯酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)K_m、V_(max)值的測(cè)定851.4.5羧酸酯酶的體外抑制851.4.6酯酶非變性聚丙烯酰胺凝膠(Non-denaturingPAGE)電泳分析851.5谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的測(cè)定85-861.6細(xì)胞色素P450單加氧酶活性的測(cè)定861.7蛋白含量的測(cè)定861.8數(shù)據(jù)分析862結(jié)果與分析86-932.1蛋白濃度測(cè)定和酯酶活性計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)86-882.2東亞飛蝗敏感品系和黃驊抗性種群解毒酶活性的差異882.3東亞飛蝗黃流和無(wú)棣種群羧酸酯酶

17、活性、動(dòng)力學(xué)和體外抑制比較88-933討論93-973.1東亞飛蝗黃驊種群代謝解毒機(jī)制93-953.2東亞飛蝗黃流和無(wú)棣田間種群代謝解毒機(jī)制95-97第五章東亞飛蝗有機(jī)磷抗性靶標(biāo)酶生化機(jī)制研究97-1051材料和方法98-1011.1供試種群981.2供試藥劑98-991.3乙酰膽堿酯酶酶液的提取991.4乙酰膽堿酯酶活性的測(cè)定991.5乙酰膽堿酯酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)K_m、V_(max)值的測(cè)定991.6乙酰膽堿酯酶的體外抑制991.7乙酰膽堿酯酶非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳99-1001.8蛋白含量的測(cè)定1001.9數(shù)據(jù)分析100-1012結(jié)果與分析101-1032.1東亞飛蝗不同種群和敏感品系乙酰膽

18、堿酯酶活性比較1012.2東亞飛蝗不同種群和敏感品系乙酰膽堿酯酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較101-1022.3東亞飛蝗不同種群和敏感品系乙酰膽堿酯酶對(duì)不同抑制劑的敏感性102-1033討論103-105第六章東亞飛蝗有機(jī)磷抗性分子機(jī)制研究105-1351材料和方法106-1151.1供試種群1061.2供試藥劑和主要儀器106-1071.3東亞飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽(expressingsequencetags,ESTs)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索1071.4東亞飛蝗羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶的基因克隆107-1111.4.1總RNA提取1071.4.2第一鏈cDNA合成107-1081.4.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)108-1091.4

19、.3.1PCR引物的設(shè)計(jì)108-1091.4.3.2PCR擴(kuò)增1091.4.4東亞飛蝗羧酸酯酶和乙酰膽堿酯酶PCR產(chǎn)物回收與純化1091.4.5質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)和轉(zhuǎn)化109-1111.4.5.1連接反應(yīng)109-1101.4.5.2感受態(tài)細(xì)胞的制備1101.4.5.3轉(zhuǎn)化反應(yīng)和細(xì)菌培養(yǎng)110-1111.4.6質(zhì)粒DNA測(cè)序1111.4.7測(cè)序及同源性比較1111.5東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶的Westernblot分析111-1121.5.1樣品的處理1111.5.2SDS電泳1111.5.3蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜1111.5.4抗體雜交111-1121.6羧酸酯酶基因3末端克隆112-1131.6.1總RNA的提取1121.6.2第一鏈cDNA合成1121.6.3羧酸酯酶基因的3-RACE引物1121.6.43cDNA末端快速擴(kuò)增(3-RACE)112-1131.7東亞飛蝗羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因的定量分析113-1151.7.1總RNA的提取1131.7.2引物設(shè)計(jì)1131.7.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)113-1151.7.4東亞飛蝗羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量比較1152結(jié)果115-1312.1東亞飛蝗羧酸酯酶基因PCR擴(kuò)增cDNA片段的核苷酸順序及推導(dǎo)的氨基酸順序1152.2東亞飛蝗羧酸酯酶基因3RACE擴(kuò)增片段的核苷酸順序