組織切片染色技術應用

1、組織切片染色技術應用學習目標掌握：染色、常規(guī)染色的概念；HE染色的基本步驟。 熟悉：染色的目的、原理；常用染色術語；染色前后的處理；蘇木素-伊紅染色液的配制。 了解：染色的注意事項。 染色概述第一節(jié)一、染色的概念就是利用染料在組織切片上給予顏色，使其與組織或細胞內的某種成分發(fā)生作用，經過透明后通過光譜吸收和折射，使其各種微細結構能顯現不同顏色，這樣在顯微鏡下就可顯示出組織細胞的各種成分。 染色是制片過程中的一個重要環(huán)節(jié) 二、染色的目的將染料配制成溶液將組織切片浸入染色劑內經一定的時間，組織或細胞及其他異常的成分被染上不同深淺的顏色對光產生不同的折射率便于在光鏡下觀察。 染色的物理作用(1）毛細

2、管作用及滲透作用染色劑與組織細胞沒有牢固的結合(2)吸收作用：又稱溶解學說。組織吸收染色劑，牢固的結合。組織的著色與溶液的顏色相同。三、染色原理(3)吸附作用 是固體物質的特性，即較大的物體能從周圍溶液(染液)中吸附一些小顆粒(化合物或離子)到自身的特性。細胞中各種蛋白質或膠體有不同的吸附面，因此能選擇性地吸收不同的離子，即某種蛋白質對某種染色劑有吸附作用,而對別種染色劑無吸附作用，這就可以解釋鑒別染色現象。 三、染色原理 染色的化學作用染色劑按性質可分為酸性、堿性和中性染色劑，而動、植物的細胞內一般也可區(qū)分為酸性(陰離子)和堿性(陽離子)部分。當堿性染色劑溶液中的有色部分成為陽離子時，就能與

3、細胞的陰離子(酸件部分)較牢固地結合，當酸性染色劑溶液中的有色部分成為陰離子時，就能與細胞內的陽離子(堿性部分)較牢固地結合。 三、染色原理 例如，細胞核（尤其是核內的染色質）主要由核酸組成，是酸性的組成成分，故和堿性染色劑(蘇木精)的親和力很強，易于著色。細胞質含堿性物質，故和酸性染色劑(伊紅)的親和力很大，易于著色。進行性染色和退行性染色 進行性染色：組織成分著色由淺至深，當達到所需要的強度時，終止染色。此種方法無需“分化”，例如，卡紅染色。 退行性染色：是先把組織濃染過度，超過所需的程度，然后再用某些溶液脫去多余的染色劑，以達到適當的深度，并使不應著色的組織細胞脫色。這個步驟稱為“分化”

4、。 三、染色原理直接染色，間接染色和媒染劑 直接染色：染色無需第三種物質參加，染色劑和組織即可直接結合著色。 間接染色：單獨染料本身的水溶液或酒精溶液，幾乎不能與組織細胞結合或結合的能力很弱，必須有第三種成分媒染劑參與，才能使染色劑與組織細胞有效地結合起來。媒染劑：通常是雙價或三價金屬如鋁、鐵的硫酸鹽或氧化物。媒染劑在染色中起著架橋作用，既能與染料結合又能與組織相結合，達到了促進染色的效果。 三、染色原理促染劑 用以加強染料和組織細胞結合能力的物質稱為促染劑促染劑如化學反應中的催化劑，少量存在就有明顯的促染作用。它們的作用機制也許是降低表面張力或是改變了染液的pH值。 三、染色原理分化劑 在退

5、行性染色中，附在組織細胞上多余的染色劑需用某些特定的溶液把目的物以外的部分脫去，從而使目的物與周圍組織形成鮮明的對比，同時使目的物本身的色澤也深淺適當。這種選擇性地除去多余染色劑的過程稱為“分化”，所使用的溶液即“分化劑”。有酸性分化劑 、氧化分化劑 、媒染分化劑 三、染色原理變色反應和正色反應 變色反應：染色反應最后目的物所呈現的顏色和染色劑當初的顏色不同。如：黏液用甲苯胺藍可染成紅色，而其余組織則染成不同色調的藍色。正色反應：染色反應最后目的物所呈現的顏色和染色劑的顏色相同。如：酸性品紅總是將組織染成不同色調的紅色；淡綠染成不同色調的綠色。三、染色原理四、染色劑（一）染色劑染色的化學基礎染

6、色劑分子能夠顯示顏色的基因，稱為發(fā)色團。 主要的發(fā)色團有： N=N， N=O， C=O， C=C 偶氮基 亞硝基 羰基 烯基含有發(fā)色團的苯環(huán)化合物，稱為色原。 苯+發(fā)色團=色原染色劑分子中還需具備促使染色劑與組織細胞相結合的基因，這樣基因又稱為助色團。如NH2 COOH OH SO3H 氨基 羧基 羥基 磺酸基四、染色劑（二）染色劑的分類1按來源分 2按主要用途分 3按染色劑分子中的發(fā)色團分 4按染色劑的化學性質分 四、染色劑1按來源分（1）天然染色劑：蘇木素、胭脂紅、地衣紅和番紅花。（2）合成染色劑：從煤焦油中提取的苯衍生物。無機化合物，如硝酸銀、氯化金、磺、鋨酸和高錳酸鉀等。四、染色劑2按

7、主要用途分（1）胞核染色劑：蘇木素、胭脂紅、甲苯胺藍、美藍和孔雀綠等。（2）胞質染色劑：伊紅、淡綠、橘黃G、酸性品紅和苦味酸等。（3）脂質染色劑：蘇丹、蘇丹、蘇丹黑、硫酸尼羅藍和油紅等。四、染色劑3按染色劑分子中的發(fā)色團分（1）亞硝基類：發(fā)色團為亞硝基（-NO)，如萘酚緣-B。（2）硝基染料：發(fā)色團是硝基（-NO2），如苦味酸。（3）偶氮類：發(fā)色團為偶氮基（-N=N-），屬于這一類的染色劑 有橘黃G、剛果紅、俾士麥棕和許多蘇丹類的脂質染色劑。（4）醌亞胺類：含有兩個發(fā)色團，一個是印胺基（-N=）、一個是醌型苯環(huán)，如硫堇、美藍、甲苯胺藍O、硫酸尼羅藍、中性紅和堿性藏紅花O、焦油紫等。（5）苯甲烷

8、染料：發(fā)色團是醌型苯環(huán)，如孔雀緣、淺綠、堿性品紅、酸性品紅、結晶紫和甲基緣等。（6）山叮染料：發(fā)色團是醌型苯環(huán)，如派羅寧和伊紅Y等。（7）蒽醌染料：此類染色劑含有色原蒽醌，如茜素和胭脂蟲酸。（8）噻唑類（9）喹啉類使用極少 四、染色劑4按染色劑的化學性質分（1）酸性染色劑： 色原-助色團-Na色原-助色團+Na+。常用的如伊紅、酸性品紅、苦味酸、橘黃G、剛果紅、水溶性苯胺藍和淡綠等酸性染料常用以染細胞質等堿性成份。（2）堿性染色劑： 色原-助色團-Cl色原-助色團+Cl。常用的如蘇木素、卡紅、次甲基藍、甲苯胺藍、硫堇和美藍等堿性染料常用以染細胞核等酸性成份。五、常用染色術語 1普通染色在組織制

9、片技術中，常規(guī)制片最廣泛應用的是蘇木精和伊紅染色，又稱為常規(guī)染色（HE染色）。2特殊染色特殊染色就是為了顯示特定的組織結構或其他的特殊成分，是常規(guī)染色的必要補充，也是染色技術中不可缺少的部分。它在病理診斷中起到輔助作用。3單一染色選用一種染料進行的染色，如用鐵蘇木素染睪丸生精細胞等。4復染色用兩種不同性質的染料進行染色的方法，如用蘇木素和伊紅分別使細胞核及胞質染成兩種顏色。5多種染色選用兩種以上的染料的染色，如Mosson三色染色法。六、染色前后處理 （一）染色前處理1脫蠟至水 二甲苯10min，37二甲苯10min，37無水乙醇 2min 無水乙醇 2min 95乙醇 2min 85乙醇 2

10、min 75乙醇 2min 流水沖洗六、染色前后處理2除去汞鹽沉淀物 對于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脫臘后需脫汞（浸入5%碘酒精10min），脫碘（5%硫代硫酸鈉）流水洗染色。 六、染色前后處理3脫甲醛色素 （1）濃氨水1ml，75%乙醇200ml。切片脫蠟后置溶液中30min或較久流水洗染色。（2）1%氫氧化鉀1ml，80%乙醇100ml。切片脫蠟后置溶液中10min流水洗5min80%乙醇5min蒸餾水洗染色。 六、染色前后處理4除鉻沉著物 組織用含鉻的Zenker氏液等固定的，有鉻沉淀物。除鉻沉著物可應用鹽酸乙醇溶液，或用5%碘酒和5%硫代硫酸鈉水溶液處理。 六、染色前后

11、處理（二）染色后的處理 1脫水 95%乙醇、各5min100%乙醇、各5min。2透明 二甲苯、各5min透明。3封固 通常用中性樹膠或加拿大樹膠加蓋玻片封固。 七、染色的注意事項 1切片脫蠟應徹底。 2常規(guī)染色、特殊染色等，組織要進行固定處理，做酶反應的組織固定更應嚴格。凡用含升汞固定液固定的組織，切片脫蠟后，應經脫汞處理，同時要慎防切片脫落。3各種染料試劑一般選用化學純。各種染料啟用新品時應先試染。配成的染液、試液應盛于有色試劑瓶內，瓶簽應寫明名稱、含量、配制年月日，順序保存于避光櫥中，必要者放冰箱內。凡須臨用時配制者，配量應適當。 4染色各步驟所需的時間，常受溫度、切片厚度等影響，可根據

12、鏡下觀察所見酌情予以調整。5染色過程中，勿使切片干燥。染色完畢后用顯微鏡檢查染色結果是否符合要求，并核對標本種類、號碼、數量是否無誤。常規(guī)染色第二節(jié)一、常規(guī)染色的概念 在組織制片技術中，常規(guī)制片最廣泛應用的是蘇木精和伊紅染色，稱為常規(guī)染色（HE染色），又稱普通染色。 二、蘇木素-伊紅染色液的配制 （一）蘇木素染液的配制方法常用的有： 1.哈瑞氏（harris）蘇木素染液最常應用染色時間為5min10min配制 蒸餾水 1000ml 蘇木素 3g5g 碘酸鈉 1g 鉀明礬 50g80g 水醋酸 20ml其優(yōu)點是：配后即可應用染色力較強。其缺點是：極易產生金屬膜沉淀。二、蘇木素-伊紅染色液的配制2

13、.埃利希（Ehrlich），蘇木素染液 配制 無水乙醇 100ml 甘油 100ml 蘇木精 2g 鉀明礬 2g3g 醋酸 5ml10ml置于陽光下自然氧化3個月左右成熟。其優(yōu)點是： 染色結果甚佳，貯存愈久染色愈強，而且不需分色。二、蘇木素-伊紅染色液的配制（二）分化液 1鹽酸酒精，是最常用的分化液。 配方：70酒精 99ml 濃鹽酸 1ml二、蘇木素-伊紅染色液的配制（三）還原液 1氫氧化氨液： 配方：濃氨水 1ml 蒸餾水 99ml 2飽和碳酸鋰液： 配制：碳酸鋰 1g 蒸餾水（冷） 78ml 3流水沖洗還原。二、蘇木素-伊紅染色液的配制（四）伊紅染液 配方：伊紅Y（水溶） 0.5glg

14、蒸餾水 99ml 若取用伊紅Y（醇溶性）應溶于99ml 75或95的乙醇中。 若在伊紅液中加入0.5毫升冰醋酸，可加速其染色過程，并使胞質的色澤更為艷麗。三、染色方法蘇木精伊 紅嗜堿性結構：細胞核粗面內質網游離核糖體等嗜酸性結構：細胞質基質溶酶體、線粒體等細胞器膠原纖維等常規(guī)脫蠟蘇木素染色（5-15min），水洗鹽酸乙醇溶液分化（30s），水洗伊紅染色（1-3min），水洗氨水反藍（30s），水洗90%乙醇（5min）80%乙醇（30s）100%乙醇（2次10min）二甲苯（3次5min）封片染色脫水透明封片脫蠟 染色的時間，應根據室溫，及組織的具體情況來確定，做之前做預實驗。 在染色后，重新進入酒精和二甲苯，最后用中性樹膠封片，以便長期保存。* 切片: 固定梯度酒精上行二甲苯石蠟。* 染色: 石蠟二甲苯梯度酒精下行水。* 保存: 水梯度酒精二甲苯中性樹膠。* 蘇木素是堿性染料，藍紫色，可以使細胞核等著色。被蘇木素著色的結構本身為酸性，具有嗜堿性。* 伊紅是酸性染料，粉紅色?？梢詫⒋蠖鄶导毎募毎|染成紅色。被伊紅著色的結構本身為堿性，具