細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)

1、細(xì)胞因子的檢測(cè)細(xì)胞因子（cytokine, CK）指由免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞（血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）合成與分泌的，具有多種生物功能的小分子蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。因能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能而得名?？山閷?dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與免疫應(yīng)答和組織修復(fù)等。細(xì)胞因子一、細(xì)胞因子概述以生物學(xué)作用進(jìn)行劃分的分類白細(xì)胞介素（Interleukin） IL-1、IL-2、 IL-18干擾素（Interferon） IFN-、IFN-、IFN-腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor） TNF- 、 TNF- 集落刺激因子（Colony-stimulating factor） M-CS

2、F、G-CSF轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor） TGF- 趨化因子（Chemokine） IL-8、GROs、MCP-1生長(zhǎng)因子（Growth factor） EGF、FGF、IGF、PDGF 細(xì)胞因子間的相互作用IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、 GM-CSFTNF TGF IL-1 IFNIL-1 IFNTNFIL-1 TGFIFNIL2 IL-4IFN IL2 IL-4 IL-5 IL-6TNF IFN IL-1 TGFTNF IL-1 IFN IL-5 GM-CSF G-CSF M-GSFTNFTNF IL-1 TGFIL-1 IL-6 GM-

3、CSF G-CSF M-GSF IL-1 IL-6IL-1 IL-6 GM-CSF G-CSF M-GSF IFN內(nèi)皮細(xì)胞成纖維細(xì)胞TB 二、 細(xì)胞因子檢測(cè)的方法與原理（一）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)（二）免疫學(xué)檢測(cè)（三）分子生物學(xué)檢測(cè)1、細(xì)胞增殖或增殖抑制試驗(yàn)2、細(xì)胞毒活性測(cè)定3、抗病毒活性測(cè)定法4、細(xì)胞趨化活性測(cè)定法（一）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)1、細(xì)胞增殖和增殖抑制測(cè)定法以細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞株為靶向，通過(guò)觀察特定的細(xì)胞因子刺激或抑制依賴性細(xì)胞株增殖來(lái)評(píng)估細(xì)胞因子的活性水平。常用的檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法有3H-TdR摻入法、比色法、染色法和直接計(jì)數(shù)法等。其中測(cè)定細(xì)胞代謝酶反應(yīng)細(xì)胞增殖數(shù)的比色法包括 MTT、XTT、

4、MTS和NAG等方法。 通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞DNA合成的增加或減少來(lái)判斷細(xì)胞增殖的方法。在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，DNA合成的增加使得指示細(xì)胞對(duì)核苷或堿基的需求增多，若將核苷標(biāo)記上可以示蹤的同位素（3H/125I ），通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的同位素含量，則可反映細(xì)胞增殖的程度。結(jié)果客觀易于自動(dòng)化；適用于大標(biāo)本量的測(cè)定 優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)方法的特異性受依賴細(xì)胞株影響；放射性污染(1) 放射性核素?fù)饺敕ㄌ攸c(diǎn)：不使用放射性核素， 以細(xì)胞代謝變化為增殖指征 指示細(xì)胞的增殖情況與線粒體代謝活性相關(guān) 測(cè)定步驟類似相同點(diǎn)不同點(diǎn)與同位素?fù)饺敕ㄏ啾葥饺胛铮篗TT而非3H-TdR；反應(yīng)條件：選用的細(xì)胞及其濃度、 培養(yǎng)時(shí)間不同(2) MTT 比色

5、法2、細(xì)胞毒活性測(cè)定對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，若與細(xì)胞共育將會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，待測(cè)細(xì)胞因子作一系列稀釋后加至指示細(xì)胞培養(yǎng)體系，以檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的死細(xì)胞數(shù)作為判斷指標(biāo)，死細(xì)胞數(shù)量與細(xì)胞因子的活性呈正比。應(yīng)用系列稀釋的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品，制作其活性與劑量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此作為待測(cè)品活性的定量測(cè)定的基礎(chǔ)。 本法常用于TNF等的測(cè)定Wish、Hep2/c 人干擾素L929 小鼠干擾素Ratec 大鼠干擾素A549MDBK 多種族的IFN-和IFN-本法常用于IFN等的測(cè)定，IFN可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抑制病毒RNA和DNA合成的酶，保護(hù)細(xì)胞不受病毒感染，產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。 VSV、EMCV及

6、Sindbis virus等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)、抑制病毒蝕斑形成或抑制病毒的產(chǎn)量3、抗病毒活性測(cè)定法常用于檢測(cè)抗病毒活性的細(xì)胞株常用于攻擊細(xì)胞的病毒檢測(cè)抗病毒活性的方法趨化性(chemotaxis)： 誘導(dǎo)細(xì)胞向由趨化因子低濃度處向趨化因子高濃度處作定向移動(dòng)的特性,可采用瓊脂糖和微孔小室趨化試驗(yàn)?；瘜W(xué)增活性(chemokinesis)： 細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力的特性,可采用瓊脂糖小滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)。趨化因子誘導(dǎo)細(xì)胞移動(dòng)的方式4、趨化活性測(cè)定法濾膜：計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化試驗(yàn)原理示意靶細(xì)胞的選擇與培養(yǎng)1、對(duì)所測(cè)的細(xì)胞因子有特異的敏感性2、易培養(yǎng)、保存、生物學(xué)特性穩(wěn)定3、有

7、良好的生長(zhǎng)狀態(tài)4、種屬適配各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 干擾因素IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPOIL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4各類細(xì)胞因子檢測(cè)的常用靶細(xì)胞細(xì)胞因子 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng) 干擾因素IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒細(xì)胞

8、（M、H）趨化法GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5TNF/ L929 （M、H）細(xì)胞毒法IFN wish（H）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN- L929（M）病變保護(hù)法 IFN- 、 IFN- 敏感性較高特異性不高操作繁瑣易受干擾生物學(xué)活性測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)（二）免疫學(xué)檢測(cè)細(xì)胞因子(或受體)與相應(yīng)的特異性抗體( 單克隆抗體或多克隆抗體)結(jié)合，通過(guò)同位素、熒光或酶等標(biāo)記技術(shù)加以放大和顯示， 從而定性或定量顯示細(xì)胞因子(或受體)的水平。1、ELISA法2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)3、流式細(xì)胞分析法1、ELISA方法ELISA法是應(yīng)用最為廣泛的非均相酶標(biāo)免疫分析技術(shù)，一

9、步或多步的抗原抗體反應(yīng)和一步酶促反應(yīng)構(gòu)成ELISA的基本步驟，可作定性或定量分析。ELISA法不僅可以用于細(xì)胞因子檢測(cè)，也可用于可溶性細(xì)胞因子受體或可溶性粘附因子的測(cè)定 敏感性偏低不能判斷細(xì)胞因子的生物學(xué)活性。ELISA特異、簡(jiǎn)便易于推廣和標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)可同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本且試驗(yàn)廢棄物便于處理細(xì)胞因子測(cè)定的首選方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)2、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(ELISPOT或ElisaSpot) 在包被有待測(cè)細(xì)胞因子抗體的微孔板上，加入可分泌相應(yīng)細(xì)胞因子的待測(cè)細(xì)胞，經(jīng)在有或無(wú)刺激物存在的條件下培養(yǎng)，待測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子于其周?chē)⒈话迳系奶禺愋钥贵w捕獲。后續(xù)的反應(yīng)如同ELISA，即在洗去細(xì)胞后視用于試驗(yàn)的酶標(biāo)抗體

10、為一抗或二抗，分別作直接或間接法。 一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞，斑點(diǎn)的顏色深淺程度與細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子量相關(guān) 基本原理ELISPOT3、流式細(xì)胞分析法 流式細(xì)胞分析法，是基于熒光抗體染色技術(shù)并借助流式細(xì)胞儀敏感的分辨力所建立的方法。該法主要用于細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面粘附分子的檢測(cè)，通過(guò)特異性的熒光抗體染色，能簡(jiǎn)單、快速地進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞水平的細(xì)胞因子或粘附因子的檢測(cè)，精確判斷不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子和膜分子的表達(dá)情況。 1分離和培養(yǎng)待檢細(xì)胞 2細(xì)胞固定 3封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn) 4染色與分析 基本步驟細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)激活膜抗原標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子標(biāo)記使用流式細(xì)胞分析法，可以：區(qū)分不同分泌特性

11、的細(xì)胞亞群： Th1細(xì)胞 IFN- Th2細(xì)胞 IL-4細(xì)胞表面的粘附分子或細(xì)胞因子受體： 單克隆抗體技術(shù) 直接或間接熒光抗體染色 無(wú)需作細(xì)胞固定和非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉 待測(cè)細(xì)胞是新鮮分離或培養(yǎng)的活細(xì)胞，保持良好狀態(tài)免疫學(xué)測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)： 特異性高 操作簡(jiǎn)便、快速，無(wú)需依賴細(xì)胞株 影響因素較少且易控制，重復(fù)性好，方法容易標(biāo)準(zhǔn)化。缺點(diǎn)： 所測(cè)定的只是細(xì)胞因子的蛋白含量，與其生物活性不一定呈正比 結(jié)果與所用的抗體來(lái)源及親和力有很大的關(guān)系 敏感性相對(duì)較低 標(biāo)本中細(xì)胞因子的可溶性受體，會(huì)影響特異性抗體對(duì)細(xì)胞因子的結(jié)合（三）分子生物學(xué)檢測(cè)此方法測(cè)定的并非細(xì)胞因子本身，而是細(xì)胞因子的基因。方法：1、Northern印跡雜交法2、Southern 印跡雜交法 3、PCR與逆轉(zhuǎn)錄PCR4、原位雜交，原位PCR和原位RTPCR 三、常用細(xì)胞因子的檢測(cè)方法IL-2的檢測(cè)IFN-的檢測(cè)TNF的檢測(cè)待檢樣品（細(xì)胞上清） 指示細(xì)胞（CTLL-2）按不同稀釋度加入37C，16-20小時(shí)加入3HTdR（1-5Ci）37C，4-6