生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建

1、生物制藥技術(shù)2016-3-71生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建生物制藥技術(shù)（含實(shí)驗(yàn)）課程教學(xué)大綱教學(xué)內(nèi)容理論課學(xué)時(shí) 緒論1 基因與工程細(xì)胞的構(gòu)建3 工程細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)與蛋白表達(dá)2 重組蛋白的分離純化2 生物制藥的制劑研究1 生物制藥的質(zhì)量研究與分析技術(shù)4 生物制藥的中試研究2 生物制藥的穩(wěn)定性研究1 生物制藥的主要藥效學(xué)研究1 生物制藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究1教學(xué)內(nèi)容理論課學(xué)時(shí)小課討論學(xué)時(shí) 生物制藥的安全性評(píng)價(jià)3 第一次PBL生物制藥立項(xiàng) 2 抗體藥物3 基因治療與基因藥物2 腫瘤的細(xì)胞免疫治療3 第二次PBL腫瘤的治療 2 個(gè)體化醫(yī)學(xué)診療2 生物制藥的知識(shí)產(chǎn)權(quán)問題1 生物制藥的藥品注冊(cè)2 第三次PBL生物制

2、藥申報(bào) 22生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建生物制藥研發(fā)的基本流程基因構(gòu)建發(fā)酵培養(yǎng)分離純化制劑研究質(zhì)量研究中 試放 大穩(wěn)定性研 究藥效學(xué)研 究安全藥理研 究臨床申報(bào)藥學(xué)(實(shí)驗(yàn)室)藥學(xué)(中試)藥理學(xué)臨床試驗(yàn)3生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.2 工程細(xì)胞的發(fā)酵培養(yǎng)與蛋白表達(dá)2.3 重組蛋白的分離純化2.4 生物制藥的制劑研究2.5 生物制藥的質(zhì)量研究與分析技術(shù)2.6 生物制藥的中試研究2.7 生物制藥的穩(wěn)定性研究第二章 重組蛋白藥物的藥學(xué)概論原核細(xì)胞真核細(xì)胞4生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1.1 基本概念2.1.2 質(zhì)粒、載體2.1.3 工程細(xì)胞與細(xì)胞庫2.1.4 表達(dá)方式選擇2.1.5 基

3、因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)2.1.6 實(shí)例2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建第二章 重組蛋白藥物的藥學(xué)概論5生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建基因重組分子水平、提取、連接、轉(zhuǎn)染、復(fù)制、表達(dá)別稱基因工程、DNA重組、遺傳工程、基因操作、克隆工程細(xì)胞的三要素基因載體宿主細(xì)胞2.1.1 基本概念6生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建基因一段具有蛋白結(jié)構(gòu)編碼的核酸序列載體質(zhì)粒、噬菌體、病毒限制性內(nèi)切酶、連接酶抗生素抗性基因Kan、Neo、Tet、Amp、Str宿主細(xì)胞細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.1 基本概念7生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建組建表達(dá)載體條件強(qiáng)啟動(dòng)子兩側(cè)的調(diào)控序列選擇標(biāo)記正確

4、的讀碼框架合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）SD序列與起始密碼子ATG之間合適的距離被翻譯的蛋白性質(zhì)與穩(wěn)定性合適的宿主細(xì)胞2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。SD序列在細(xì)菌mRNA起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處，有一段富含嘌呤的堿基序列，能與細(xì)菌16S rRNA3端識(shí)別，幫助從起始AUG處開始翻譯2.1.1 基本概念8生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1.2 質(zhì)粒、載體2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建9生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建10生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建11生物制藥

5、技術(shù)2基因構(gòu)建克 隆鑒 定宿主細(xì)胞細(xì)胞篩選細(xì)胞庫合成、分離、RT-PCR優(yōu)化、測(cè)序抗性基因、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)宿主與產(chǎn)品的相關(guān)性表達(dá)水平、產(chǎn)品鑒定三級(jí)細(xì)胞庫、遺傳穩(wěn)定性載 體2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.3 工程細(xì)胞與細(xì)胞庫12生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建原始種子庫主種子庫工作種子庫2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建13生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建調(diào)控調(diào)控生物遺傳中心法則DNA RNA Protein2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建14生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Primary Structure The sequence of amino acids on the polypeptide chainSecond

6、ary Structure Conformation of the polypeptide chain (3D structure)Tertiary Structure Three Dimensional Structure (Folding) of the proteinQuaternary Structure Complexation with other proteins (Similar or dissimilar structures)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.4 表達(dá)方式選擇15生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建依賴于制備過程的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)Prokaryotic cells Easier

7、 to make Cheaper to produce Improper folding of protein No glycosylation No Secretion Eukaryotic cells Can properly fold the protein Glycosylate-(maybe differently) Harder to clone Harder to maintain in cell culture May harbor viruses Lower yields Higher expense2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.4 表達(dá)方式選擇16生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建

8、2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建17生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)18生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建Soluble Inclusion BodySecreting2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)19生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建優(yōu)點(diǎn)突出正確指導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊提供糖基化等多種翻譯后加工在新基因發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中起極為重要的作用生產(chǎn)階段系統(tǒng)表達(dá)水平達(dá)到7g/L生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)國家新藥研發(fā)中均選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)20生

9、物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建正常細(xì)胞生長特性錨地依賴性血清依賴性接觸抑制性形態(tài)依賴性體外培養(yǎng)正常細(xì)胞改變某些特征，越過生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)無限制分裂細(xì)胞系形成2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)21生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)受體細(xì)胞條件細(xì)胞系特征喪失細(xì)胞接觸抑制和錨地依賴性遺傳穩(wěn)定性外源基因多次傳代不丟失合適的標(biāo)記便于篩選與維持生長快且齊分裂周期短，生長均一安全性不合成、分泌致病物質(zhì)，不致癌以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞必須條件2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)22生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩

10、選藥物作用機(jī)理APH-氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋呤DHFR變體抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)23生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建常用宿主細(xì)胞 商業(yè)化CHO中國倉鼠卵巢細(xì)胞系BHK小倉鼠腎細(xì)胞系COS非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞系NSO小鼠骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系HEK293人胚腎細(xì)胞

11、系NIH313鼠成纖維細(xì)胞系因穩(wěn)定性與糖基化不同，根據(jù)表達(dá)目的蛋白選擇適當(dāng)細(xì)胞系哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)24生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建真核表達(dá)載體必要原件高活性啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列、有效mRNA翻譯信號(hào)復(fù)制子、抗生素抗性基因、限制性酶切位點(diǎn)標(biāo)志基因內(nèi)含子內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建 一般真核mRNA的翻譯都需要5帽子來介導(dǎo)核糖體結(jié)合，但真核生物和病毒中還存在一些例外情況，例如一些基因5端具有一段較短的RNA序列（約150-250bp），這類RNA序列能折疊成類似于起始tRNA的結(jié)構(gòu)，從而介導(dǎo)核糖體與

12、RNA結(jié)合，起始蛋白質(zhì)翻譯，這段非翻譯RNA被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（Internal ribosome entry site, IRES）2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)25生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建誘導(dǎo)的方式IPTG/乳糖低溫pH低磷表達(dá)檢測(cè)方式表達(dá)標(biāo)志物電泳GFP遺傳穩(wěn)定性基因穩(wěn)定性瓊脂糖電泳、指紋圖譜、PCR、測(cè)序表達(dá)穩(wěn)定性表達(dá)標(biāo)志物、活性四環(huán)素蛻皮激素他可莫斯/雷帕霉素RU4862.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)26生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建高效表達(dá)外源蛋白的基本原理通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)2.1 基因與工程細(xì)胞

13、構(gòu)建2.1.5 基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)27生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑第一個(gè)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的溶栓藥物人組織纖溶酶原激活劑(tPA)目前市場(chǎng)上銷售的阿替普酶(tPA)采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體細(xì)胞為CHO系統(tǒng)人tPA也可由大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白折疊效率低2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.6 實(shí)例28生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.6 實(shí)例29生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建代表藥物優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)第一代鏈激酶（SK）尿激酶（UK）溶栓能力強(qiáng)缺乏特異性導(dǎo)致出血過敏反應(yīng)第二代組織型纖溶酶原激活劑（tPA）具有溶栓特異性副作用較少半衰期短需大量注射第三代瑞替普酶（rPA）蘭替普酶（NPA）溶栓快速治療效率高半衰期長生產(chǎn)工藝復(fù)雜第四代PAI-1 抑制劑可以口服給藥半衰期長價(jià)格低廉仍處于試驗(yàn)階段未開發(fā)用于臨床組織纖溶酶原激活劑2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建2.1.6 實(shí)例30生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建tPArPA 527個(gè)氨基酸 分子量65kD缺失突變 355個(gè)氨基酸 分子量39kDKringle、絲氨酸蛋白酶區(qū)Finger區(qū)、Kringle、Kringle、EGF區(qū)、絲氨酸蛋白酶區(qū)2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑2.1.6 實(shí)例31生物制藥技術(shù)2基因構(gòu)建2.1 基因與工程細(xì)胞構(gòu)建組織纖溶酶原激活劑2.