T∕CPMA 008-2020 艱難梭菌感染診斷

1、 ICS 11.020C 59團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CPMA0082020艱難梭菌感染診斷Diagnosis of Clostridioides difficile infection2020-10-01實(shí)施2020-07-01發(fā)布 T/CPMA 008-2020目次前言.II引言.III1范圍.12術(shù)語(yǔ)和定義 .13縮略語(yǔ) .14診斷依據(jù) .25診斷原則 .36診斷.37鑒別診斷 .3附錄A（資料性附錄）樣本的核酸檢測(cè).5附錄B (規(guī)范性附錄)艱難梭菌的分離培養(yǎng)和鑒定.7附錄C (規(guī)范性附錄)高毒株RT027和RT078型艱難梭菌的鑒定.10參考文獻(xiàn) .1 3I T/CPMA 008-2020前

2、言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。II T/CPMA 008-2020引言艱難梭菌，即難辨梭狀芽孢桿菌，是引起抗生素相關(guān)性腹瀉的重要病原，艱難梭菌感染成為醫(yī)院獲得性腹瀉的主要病因，已在歐美國(guó)家引起多起暴發(fā)流行。美國(guó)疾病預(yù)防控制中心2017年數(shù)據(jù)顯示，美國(guó)每年艱難梭菌感染患者近23萬(wàn)人，其中死亡人數(shù)至少超1.2萬(wàn)人，產(chǎn)生超10億美元的疾病負(fù)擔(dān)，因此被列為緊迫的公共衛(wèi)生威脅之一。近十年來(lái)調(diào)查研究顯示，我國(guó)艱難梭菌感染呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)。然而，由于缺乏統(tǒng)一的診斷原則和檢測(cè)技術(shù)規(guī)范，我國(guó)艱難梭菌感染率和疾病負(fù)擔(dān)尚不明確。為了規(guī)范艱難梭菌感染流行病學(xué)調(diào)查，提高艱難梭菌診斷的準(zhǔn)確性，本標(biāo)準(zhǔn)

3、遵循科學(xué)性和實(shí)用性原則，對(duì)艱難梭菌感染診斷所需的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷進(jìn)行明確規(guī)定。III T/CPMA 008-2020艱難梭菌感染診斷1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了艱難梭菌感染的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷及鑒別診斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)開展艱難梭菌感染的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。2術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。2.1腹瀉 diarrhea24 h內(nèi)排便次數(shù)在 3次或以上，不成形便，且伴有糞便性狀異常。2.2偽膜性腸炎 pseudomembranous colitis主要發(fā)生在結(jié)腸和小腸的急性纖維素滲出性炎癥，多是在應(yīng)用抗菌藥物后導(dǎo)致正常腸道菌群失調(diào)，艱難梭菌大量繁殖，產(chǎn)生毒素而致。3縮

4、略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BHI：腦心浸液(Brain heart infusion)CDI：艱難梭菌感染(Clostridioides difficile infection)CCTA：細(xì)胞毒性試驗(yàn)(cell cytotoxicity assay)CCFA：環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂(cycloserine-cefoxitin-fructose agar)CDMN：艱難梭菌拉氧頭孢諾氟沙星瓊脂(Clostridium difficile Moxalactam Norfloxacin agar)EIA：酶免疫分析(Enzyme immunoassay)GDH：谷氨酸脫氫酶(Glutamat

5、e dehydrogenase)MLST：多位點(diǎn)序列分型(Multi-locus sequencing typing)NAAT：核酸擴(kuò)增檢測(cè)(Nucleic acid amplification testing)TCD：產(chǎn)毒艱難梭菌(Toxingenic Clostridioides difficile)RT：核糖體分型(Ribo-typing)1 T/CPMA 008-20204診斷依據(jù)4.1危險(xiǎn)因素使用抗菌藥物、住院史、老年（65歲）、使用質(zhì)子泵抑制劑、化療、患有慢性腎臟疾病、管飼或其他免疫功能缺陷等。4.2臨床表現(xiàn)癥狀可由單一腹瀉到發(fā)熱、腹痛、腹脹、惡心和嘔吐等全身性感染癥狀，重癥患者出

6、現(xiàn)偽膜性腸炎，嚴(yán)重的并發(fā)癥有中毒性巨結(jié)腸、腸梗阻、腸穿孔和休克等。分為輕中度、重度和重度伴并發(fā)癥：a)b)輕中度：腹瀉無(wú)全身感染表現(xiàn)（白細(xì)胞計(jì)數(shù)15109 /L，血肌酐35為陰性，33ct35為可疑陽(yáng)性，需重新采集樣本重復(fù)試驗(yàn)一次。注：此處列的引物和探針?lè)謩e為日本 kato和加拿大 Simon學(xué)者報(bào)道，國(guó)內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室都在應(yīng)用，開展流行病學(xué)調(diào)查和檢測(cè)。如為臨床診斷，可使用批準(zhǔn)的商品化試劑盒進(jìn)行 tcdB熒光定量 PCR檢測(cè)。6 T/CPMA 008-2020附錄 B（規(guī)范性附錄）艱難梭菌的分離培養(yǎng)和鑒定B.1培養(yǎng)基的配制B.1.1環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂（CCFA）：500ml水加入34.

7、5g艱難梭菌培養(yǎng)基，12115min高壓滅菌。取1支艱難梭菌選擇性添加劑(環(huán)絲氨酸-頭孢西丁)，加入2ml 0.85%的生理鹽水，充分混勻。將混合液加入已冷卻至約50的培養(yǎng)基中，同時(shí)加入5%8%（體積比）的卵黃乳液，輕輕搖勻。傾倒直徑為 90mm平板。4可保存1個(gè)月左右，但推薦使用新鮮配置的培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)。使用前，應(yīng)先在厭氧環(huán)境預(yù)還原過(guò)夜。B.1.2艱難梭菌拉氧頭孢諾氟沙星（CDMN）培養(yǎng)基：同上，添加比例按照產(chǎn)品說(shuō)明書。B.1.3血平板：腦心浸液（BHI），121高壓15min滅菌，添加5%8%的脫纖維羊血，傾倒直徑為90mm平板。B.2樣本的預(yù)處理和厭氧培養(yǎng)取腹瀉糞便樣本直接接種，或

8、80加熱10 min后，又或者先與無(wú)水乙醇等體積混合，室溫放置 30min1h后，3000r/min離心10min，取沉淀再接種于預(yù)還原的 CCFA/CDMN、CHROMIDC. difficile或CHROMagarTM C. difficile等其他選擇性平板上，厭氧環(huán)境，37培養(yǎng)24h48h，觀察有無(wú)可疑菌落。厭氧環(huán)境（任選其一）：自封塑料袋/盒+厭氧產(chǎn)氣袋+厭氧指示劑；厭氧罐+催化劑（80%N2，10%H2和10%CO2）；厭氧箱（80%N2，10%H2和10%CO2）?？梢删洌杭S便樣本中艱難梭菌在CCFA上菌落呈扁平狀，白色或淡黃色不透明的“攤雞蛋樣”，如下圖B.1（a）。在CHR

9、OMIDC. difficile上，艱難梭菌呈黑色，不規(guī)則克隆，如圖B.1（b）。圖 B.1 糞便樣本中艱難梭菌在 CCFA（a）和 CHROMIDC. difficile（b）上可疑菌落形態(tài)7 T/CPMA 008-2020B.3可疑菌落的鑒定B.3.1產(chǎn)毒艱難梭菌（TCD）培養(yǎng)將可疑菌落接種于BHI血平板上進(jìn)行純化，純化的典型菌落接種于 BHI中，厭氧培養(yǎng)48h，0.45m濾膜過(guò)濾培養(yǎng)液，進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。B.3.2生化鑒定艱難梭菌能發(fā)酵葡萄糖、果糖和甘露醇產(chǎn)酸，不發(fā)酵乳糖、麥芽糖和蔗糖，水解七葉苷，液化明膠。不產(chǎn)生吲哚和硫化氫，不產(chǎn)生卵磷脂酶及脂酶，不凝固牛奶。亦可用商品化的試劑來(lái)檢測(cè)，

10、如API20A，Vitek2 Compact或脯氨酸紙片法等商品化檢測(cè)試劑盒等。B.3.3免疫學(xué)檢測(cè)（EIA）鑒定針對(duì)艱難梭菌的GDH抗原和毒素A/B進(jìn)行檢測(cè)，有多種商品化的試劑盒可供選擇，結(jié)果判讀同正文4.4.3部分。B.3.4核酸檢測(cè)鑒定B.3.4.1針對(duì)16S rDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)將可疑艱難梭菌的單個(gè)菌落接種于BHI培養(yǎng)基上，37厭氧培養(yǎng)24h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書操作，提取細(xì)菌DNA；16S rDNA基因的擴(kuò)增：目的條帶為1465 bp引物序列：27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-31492R：5-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-

11、3反應(yīng)體系（50L）Premix Ex TaqTM ( 2)25L1L27F（25mol/L）1492R（25mol/L）DNA模板（20-80ng/L）ddH2O1L3L20LPCR循環(huán)參數(shù)：95；93min4 ，530s0，730s2s，4030個(gè)循環(huán)；72。 6min擴(kuò)增產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。序列比對(duì)：擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，進(jìn)行DNA序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，并輸入NCBI(/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)，確定是否為艱難梭菌。B.3.4.2針對(duì) tpi基因進(jìn)行普通PCR，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物序列：tpi-F: AAAGAAGCTACTAAGGGTACAAAtpi-R:

12、 CATAATATTGGGTCTATTCCTAC產(chǎn)物大小230bp；8 T/CPMA 008-2020反應(yīng)體系(25L)：Premix Ex TaqTM (2)12.5L上游引物(20 pmol/L)下游引物(20 pmol/L)DNA模板2L2L2LddH2O6.5L反應(yīng)條件： 95;953min，530s5，730s2，430s0個(gè)循環(huán); 72 5min結(jié)果判讀： 230bp處有唯一條帶。B.3.4.3艱難梭菌細(xì)胞毒素編碼基因（tcdB）的核酸檢測(cè)應(yīng)用細(xì)菌 DNA提取試劑盒，提取純培養(yǎng)艱難梭菌基因組 DNA后，其余操作詳見附錄 A?；虿捎蒙唐坊脑噭┖羞M(jìn)行檢測(cè)。B.3.5質(zhì)譜鑒定應(yīng)用基質(zhì)輔

13、助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS），通過(guò)獲得菌株的蛋白譜圖，并與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，完成種屬鑒定。9 T/CPMA 008-2020附錄 C（規(guī)范性附錄）高毒株 RT027型和 RT078型艱難梭菌的鑒定C.1多位點(diǎn)序列分型（MLST）DNA提取C.1.1同（附錄B）中的核酸檢測(cè)，針對(duì)艱難梭菌的7個(gè)管家基因位點(diǎn)（adk, atpA, dxr, glyA, recA, sodA和tpi）進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如表C.1：表 C.1 7個(gè) MLST管家基因擴(kuò)增引物序列基因引物名稱adkF序列（5-3）adkTTACTTGGACCTCCAGGTGCTTTCCACTTCCTAAGGCT

14、GCTGATGATTTAAGTAAACAAGCTGAATCATGAGTGAAGTCTTCTCCGCTACTTTCCATTCTATCTGCCAACTCTTTGTGCTATAAAATAGCTGATGAGGTTGGAGCTTCTAGCCTTAGATTCTTCATCCAGTAATGAAATTGGGAGAAGCATTCAGCTTGCTTAAATGGTGCCAGTTGTCAATGTATTCATTTCATAACTTCATTTGCTTTTACACCATGAGAAAACCTATAATTGCAGTTGAAGGTTTAACACTTCCACCadkRatpAdxratpAFatpARdxrFdxrRglyArecAs

15、odAtpiglyAFglyARrecAFrecARsodAFsodARtpiFtpiR反應(yīng)體系（50L）：Premix Taq酶（TAKARA）25L，ddH2O 20L，上/下游引物（25pmol/L）1/1L，DNA模板（20-80ng/L）3L。PCR循環(huán)參數(shù)：95；15min94 ，530s0，740s2，370s5個(gè)循環(huán)；72。5minC.1.2測(cè)序比對(duì)進(jìn)行雙向測(cè)序，拼接DNA序列，與數(shù)據(jù)庫(kù)(/cdifficile/)進(jìn)行比對(duì)，得到所測(cè)得基因位點(diǎn)的特定等位基因值，并形成相應(yīng)的由 7個(gè)基因值組成的等位基因譜，判斷其序列型（ST）以及clade群。C.1.3RT027型和RT078型的

16、基因組合及clade群具體基因組合見表C.210 表 C.2 RT027和 RT078的 MLST基因組合型別adk1atpAdxr1glyA10recAsodA3tpi5ST1cladeRT027RT078181925551111811C.2毒力基因檢測(cè)DNA提取同附錄B.3.3，針對(duì)艱難梭菌的tcdA、tcdB、cdtA、cdtB進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)其中tcdB基因的引物，擴(kuò)增條件和體系見附錄A。tcdA、cdtA和cdtB的擴(kuò)增引物和條件如下（表C.3-C.6）：表 C.3 tcdA基因擴(kuò)增引物、產(chǎn)物大小和反應(yīng)條件基因引物產(chǎn)物大小/bp369（A+B+）110（A-B+）循環(huán)參數(shù)tcdAt

17、cdA-FtcdA-R95；9,15min4 ，5,30s2，7,30s2，35個(gè)循環(huán)；72n。,5mi引物序列如表 C.4所示：表 C.4 tcdA基因擴(kuò)增的引物序列基因引物序列 (5-3)參考文獻(xiàn)tcdAtcdA-FtcdA-RAGATTCCTATATTTACATGACAATATGTATCAGGCATAAAGTAATATACTTTLemee et al.(2004)表 C.5 cdtA和 cdtB基因擴(kuò)增引物、產(chǎn)物大小和反應(yīng)條件基因引物產(chǎn)物大?。╞p）循環(huán)參數(shù)cdtAcdt Aposcdt Arevcdt Bposcdt Brev37594,5min； 94,1min， 50,1min，7

18、2,1min，30個(gè)循環(huán)；72 mi,5n94,5min； 94 ，,1min50，,1min30個(gè)循環(huán)；72cdtB510，,172,5min表 C.6 cdtA和 cdtB基因擴(kuò)增的引物序列序列 (5-3)基因引物參考文獻(xiàn)cdtAcdt Aposcdt Arevcdt Bposcdt BrevTGAACCTGGAAAAGGTGATGAGGATTATTTACTGGACCATTTGCTTAATGCAAGTAAATACTGAGAACGGATCTCTTGCTTCAGTCStubbs et al. (2000)cdtBStubbs et al. (2000)擴(kuò)增產(chǎn)物由1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。C.

19、3核糖體分型11 C.3.1核酸提取5% chelex-100提取DNA，步驟如下：a)b)c)5% chelex-100（4保存）制備：取 2.5g chelex-100溶于 50ml已高壓的超純水；磁力攪拌，至樹脂均勻分布；使用寬口槍頭吸取 100L chelex溶液移至 1.5ml離心管。用小接種環(huán)（1L）收集 1平環(huán)的細(xì)菌轉(zhuǎn)移至上述 100L chelex溶液中，金屬浴 100，12min；14000r/min。離心 12min，吸取 50L上清液存于 1.5ml EP管。用 NanoDrop測(cè) DNA濃度，可存于-20，備用。C.3.2PCR擴(kuò)增針對(duì)16s23s rDNA基因間隔區(qū)（

20、Intergenic Spacer，ITS）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)其產(chǎn)物DNA片段的數(shù)量以及大小不同從而進(jìn)行分型。PCR引物：Cd16s：5-CTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG-3Cd23s：5-GCGCCCTTTGTAGCTTGACC-3PCR反應(yīng)體系(50L)：Buffer( 1)5L8LMgCl2(2mol/L)dNTP mix(200mol/L)8L0.6L牛血清蛋白 BSA 0.1% (w/v）0.75LTaq聚合酶上游引物 Cd16s(0.2 mol/L)0.2L0.2L10L下游引物 Cd23s(0.2 mol/L)DNA模板(100ng/L)ddH2O17.25L注：B

21、uffer（1）：10mol/L Tirs-HCL（pH 8.3）, 50mol/L KCL配制成Buffer（10）每次試驗(yàn)需設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。PCR循環(huán)參數(shù)：95；10min94，1min58，1min72，2min25個(gè)循環(huán)；72。7minPCR產(chǎn)物純化：使用MinElute PCR試劑盒進(jìn)行純化，操作步驟遵產(chǎn)品說(shuō)明書。測(cè)PCR純化產(chǎn)物濃度，稀釋至終濃度為10ng/L100ng/L（推薦30ng/L）。PCR純化產(chǎn)物可存于-20，備用。C.3.3毛細(xì)管電泳全自動(dòng)DNA/RNA分析系統(tǒng)，進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。參數(shù)：選擇DNA high resolution卡夾、alignment mark

22、er (15bp1kb)、DNA size marker (50bp800bp)，選擇方法OM500，自動(dòng)運(yùn)行，反應(yīng)終止后，導(dǎo)出結(jié)果，使用 BioNumerics7.6的QIAxcel模塊，結(jié)合已建立的核糖體型別庫(kù)（含ATCC和歐洲艱難梭菌參比實(shí)驗(yàn)室的RT027和RT078標(biāo)準(zhǔn)株），通過(guò)比對(duì)分析是否含有暴發(fā)流行株RT027和RT078。12 T/CPMA 008-2020參考文獻(xiàn)1 L.Clifford Mcdonal, Dale N.Gerding, Stuart Johnson et al. Clinical practice guidelines for Clostridiumdiffi

23、cile infection in adults and children:2017 update by the infectious disease society of American (IDSA) andsociety for healthcare epidemiology of American (SHEA) J. Clinical Infectious Diseases, 2018, 66(7):e1-e48.2 European surveillance of Clostridium difficile infections-Surveillance protocol version 2.3. ECDC,2018.3 Laboratory procedures for diagnosis and typing of human Clostridium difficile infection. ECDC,2018.4 European society of clinical microbiology