電鏡超薄切片1

1、透射電子顯微鏡生物制品制備技術(shù) 01The photo of light microscope23冷凍蝕刻超薄切片4冰凍蝕刻復(fù)型術(shù) Freeze etch replica5冰凍割斷術(shù) 電鏡細胞化學術(shù) Freeze cracking electron microscope cytochemistry 6免疫組織化學技術(shù) 免疫電鏡術(shù) Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy 7電鏡放射自顯影術(shù) 顯微放射自顯影技術(shù)Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography8掃描電鏡技術(shù) Scanni

2、ng electron microscopy SEM被吞噬的紅細胞9現(xiàn)有的透射電鏡生物制品制備技術(shù)分為兩類：一類是透射電鏡的基本制備技術(shù)，包括超薄切片和負染色法；另一類是生物制品的特殊技術(shù)，其中包括冷凍蝕刻法、冰凍割斷術(shù)、電鏡細胞化學術(shù)、免疫電鏡術(shù)、電鏡放射自顯影技術(shù)、X線微區(qū)分析技術(shù)等。 101、 超薄切片樣品的制備（1） 取材( 基本要求是在活體情況下進行)取材的原則(快、準、輕、小、冷的原則）1） 快速：1分鐘之內(nèi)投入固定液。2） 塊?。?.5-1mm3或截面1mm2的長條。3） 部位準4） 損傷小：器械應(yīng)銳利，避免牽拉、擠壓，防止組織受機械損傷。5） 低溫：0-4oC11取材的方法1）

3、動物材料： 對神經(jīng)組織等要進行原位固定或灌注固定，待組織適當硬化后再取材。12胚胎干細胞的研究132）培養(yǎng)細胞(Cell culture)： 生長在瓶中的細胞到足夠的量，先倒去培養(yǎng)液，然后倒入適量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分鐘、彎頭吸管吹打或用軟器械輕輕地刮下貼壁的細胞，將這種混合液倒入離心管中，2000rpm低速離心15-20分鐘，使細胞呈團，棄去上清液，換一次固定液，將其移入修塊臺，修快成標準塊4oC固定、待用。143）單細胞懸液：精子、血球等其他不易聚集的懸浮游離材料，可加入等量的戊二醛和其他類型的固定液，輕輕地把他們懸浮在固定液中。經(jīng)過固定處理后再離心成團，在50oC中棄去上清液，

4、加入適量的經(jīng)50oC預(yù)溫的2%的瓊漿，使團懸浮，將懸浮團和瓊脂液一同在薄片上展層，固定后切成1mm3的小塊。15（2）固定 (fixation) The aim is to avoid digestion by enzymes (autolysis) or bacteria and to preserve the physical structure, pieces of organs should be promptly and adequately treated before or as soon as possible after removal from the animals bo

5、dy.161）Function of fixationA阻止細胞自溶。B 穩(wěn)定細胞物質(zhì)成分。C 在一些組分的分子之間以化學反應(yīng)和物理反應(yīng)建立鉸鏈，提供一個骨架來穩(wěn)定各種細胞的空間結(jié)構(gòu)。D能提供一定的電子反差 17 理想的固定劑，應(yīng)具備以下條件：能迅速而均勻地滲入組織細胞內(nèi)部，穩(wěn)定細胞內(nèi)各種成分；能即刻將細胞“殺死”，盡可能保持細胞微細結(jié)構(gòu)，減少死后變化；對細胞不產(chǎn)生收縮及膨脹作用，不產(chǎn)生人工假象及變形；可保存酶的活性，以利于細胞化學測定工作的進行。182）影響固定效果的因素固定液的pH值滲透壓緩沖液的類型固定的溫度和時間當前采用的是在04下固定1 4小時。193）常用的幾種固定劑A 四氧化鋨（

6、osmium tetroxide,OsO4）亦稱鋨酸：鋨酸實際上不是酸，它的水溶液是中性的，為一種強氧化劑。0.5-1g包裝，淡黃色晶體。具有揮發(fā)性和毒性，在室溫下易揮發(fā)，其蒸氣對粘膜有刺激作用，在通風櫥內(nèi)配制。20優(yōu)點對蛋白質(zhì)、磷酸脂蛋白、核蛋白固定較好； 對脂類固定較好。分子密度高，產(chǎn)生良好的反差，因此鋨酸固定本身也起到生物染色作用。缺點不能固定糖元和核酸，對微管固定較差。擴散慢，穿透能力差。具有揮發(fā)性和粘膜毒性。不適于進行細胞化學工作。21B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2） 特點：純的容易聚合，目前使用25%水溶液進口分裝。存放時間久了容易變質(zhì)，影響固定。 優(yōu)點 (1

7、)對組織穿透力強。(2)能保存某些酶的活性，對糖元、細胞膜、核基質(zhì)等有較好的作用。(3)而且組織塊在溶液中可保存較長的時間，適用于進行超微細胞化學研究。 22C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉劑配制。其分子小，滲透力強，固定迅速，對酶的活性保存好。 232）固定的方法A 單固定法：單細胞或固定液易于浸透的組織 1-2%四氧化鋨（1-2h）。B 雙固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）-鋨酸（1% 4oC 2h）。C 原位固定和灌注固定：24附 幾種常見固定劑的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,對含水較多的組織可用PH值8.0，細菌、病毒可用PH值在

8、7.0以下。0. 2mol/L磷酸緩沖液的配制 磷酸二氫鈉（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O） 29g 重蒸水 加到500ml 調(diào)PH到7.4250.2mol/L二甲坤酸鹽酸緩沖液重蒸水 25ml二甲坤酸鈉（Na(CH3)2AsO2.3H2O） 2.14g0. 1mol/L鹽酸 8ml重蒸水 加至50ml調(diào)PH到7.4 26B 固定液的配制鋨酸固定液的配制2%的鋨酸固定液的配制：清洗烘干器皿 1G鋨酸+50ml雙蒸水（棕色瓶）數(shù)日可用。0.1mol/L磷酸鹽緩沖液或二甲坤酸鹽緩沖液配制的1%鋨酸固定液。 2%的鋨酸緩沖液 10ml 0.2mol/L緩沖

9、液 10ml 調(diào)節(jié)PH應(yīng)為7.3-7.427戊二醛固定液的配制25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6重蒸水（ml） 4.6 4 3.40.2ml/L緩沖液（ml） 5 5 5戊二醛最終濃度 1 2.5 4調(diào)節(jié)固定液PH值到7.3-7.428（3） 脫水(dehydration)1）清洗:固定后均用和固定液相同的緩沖液沖洗3次，每次15分鐘2） 脫水：常用的脫水劑為乙醇和丙酮。How to choose? Why? 乙醇引起組織中脂類物質(zhì)抽提較丙酮少，且不會使組織變硬、變脆，故為常用脫水劑，然乙醇不容易和用于包埋劑的環(huán)氧樹脂相混溶，因此在進入包埋劑之前常用中間劑環(huán)氧丙烷置換。29脫水程序如下表

10、濃度50%70%90%100%時間10-1510-1510-153次（每次10-15）溫度4oC4oC轉(zhuǎn)室溫室溫30經(jīng)驗(experiment)：脫水劑臨時配制。濃度梯度上升。脫水時間和濃度。脫水時的連續(xù)性。脫水劑的選擇。31（4）浸透是通過脫水劑稀釋包埋劑，最終讓包埋劑取代脫水劑，使其滲透到組織中去。 脫水和包埋劑的比例2:11:2純包埋劑時間1-2h2-3h2h溫度室溫室溫37oC溫箱32經(jīng)驗(experiment)：浸透時間。浸透溫度。33（5） 包埋(embeding)：目的:包埋的目的是讓包埋劑完全浸透到組織內(nèi)部，經(jīng)加溫逐漸聚合成堅硬的固體，成為細胞結(jié)構(gòu)的支架，能夠承受切片的各種力的

11、作用，有利于切薄片。包埋劑的性質(zhì):粘度適中，有良好的切割性能。能耐受電子束的轟擊，高溫不易升華、不變形。透明度好。對人無害。34包埋劑的種類環(huán)氧樹脂類： 目前國內(nèi)使用較多的環(huán)氧樹脂有進口的Epon 812和國產(chǎn)的618。35 原理:環(huán)氧樹脂具有環(huán)氧基和羥基兩個主要化學反應(yīng)基團，環(huán)氧基是線型聚合物的末端，易與其它含活性氫原子的化合物如胺類反應(yīng)，形成首尾相接的長鏈狀聚合物。而單體中的羥基能與酸酐結(jié)合，形成分子間的橫橋連接。因此，將環(huán)氧樹脂、胺類和酸酐三者按比例混合，在一定溫度條件下，可形成具有三維空間結(jié)構(gòu)的交鏈狀聚合物。36這種聚合物收縮率小、均勻，組織損傷小，耐電子束的轟擊。包埋后可保存細胞內(nèi)的

12、微細結(jié)構(gòu)。其缺點是粘度較大，操作不便、切片較為困難，而且反差較弱。37低粘度包埋劑(Spurr) 為適應(yīng)臨床診斷電鏡的需要，目前低粘度包埋劑的應(yīng)用已日趨廣泛。這是一種低粘度的樹脂，能較好地滲入組織內(nèi)部，對組織結(jié)構(gòu)保存好，耐電子束轟擊，可廣泛應(yīng)用于各種生物材料，尤其適宜于較致密的組織。 38水溶性包埋劑： 是進行細胞化學研究較理想的包埋劑。 原理:水溶性包埋劑可以在較低溫度的紫外線照射下進行聚合，避免了一般包埋劑必須在高溫下聚合而給酶活性帶來的破壞，所以是酶活性定位和定量研究十分優(yōu)良的包埋劑。 包埋劑:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(簡稱GMA)、聚乙二醇、Aquon等 39所加的固化劑，

13、有十二烯基虎鉑酸酐（DDSA）和甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐（MNA）,增韌劑為鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速劑為2,4,6,一三苯酚（DMP30）。401環(huán)氧樹脂的性能和配制：618樹脂 5ml十二烯基丁二酸酐 DSA（固化劑） 5ml苯二甲酸二丁酯 DBP（增塑劑） 0.3ml2,4.6三苯酚 稱DMP30（加速劑） 0.1ml 60oC烘箱內(nèi)加溫使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化劑、增塑劑、加速劑，邊加邊攪拌，最后充分攪拌10分鐘，至37oC溫箱中使氣泡逸出。 41Epon812的配制A液： Epon812 62ml DDSA(固化劑) 100mlB液： Epon812 10

14、0ml MNA(固化劑) 89ml A液和B液分別配制，使用時用不同比例將二者混合后再加1.5%DMP-30(加速劑)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋塊的硬度。421） 包埋的方法43常規(guī)包埋 將浸透在包埋劑的組織塊，轉(zhuǎn)移到包埋囊中，使之位于囊的中央，然后加包埋劑。 把寫好標本塊編號的小紙條卷成環(huán)狀，放入囊中，插入包埋劑中。 不加蓋，37oC過夜，這也就是純包埋劑浸透。 次日，升溫到60oC48小時固化。 固化完畢，關(guān)溫箱，自然冷卻。 去掉外殼，取出組織包埋塊將組織包埋塊，存放在干燥器中。 44定向包埋：注意事項防潮、干燥。包埋劑要充分混勻。防氣泡。包埋后立即清

15、洗器皿。自身保護。干燥器中存放包埋塊。 45（6）切片1）選擇和清洗載網(wǎng)。常用的載網(wǎng)有圓形的銅網(wǎng)，細胞化學和免疫組織化學常用鎳網(wǎng)、不銹鋼網(wǎng)和銀絲網(wǎng)。直徑為3mm，目數(shù)為200-300 462） 支持膜的制備： 福爾莫瓦膜：常用氯仿配制的 0.2%-1.5%的聚乙烯醇縮甲醛液（formrar）。注：制膜時室內(nèi)的溫度小于60%，否則會出現(xiàn)白點。 火棉膠膜：特點，火棉膠膜的機械強度比福爾莫瓦膜弱，但制作容易。常用1-2%醋酸異戊酯溶液采用漏斗法和貼附法制膜。 帕羅丁支持膜：目前國外比較常用，一般配制30%左右的帕羅丁醋酸戊酯溶液制膜，方法同火棉膠同。 碳膜：炭膜的機械程度和穩(wěn)定性較好，適用于高分辨率

16、的觀察，用真空噴鍍儀采用碳升華噴鍍法制備。 復(fù)合膜：有機膜上噴鍍5-10nm的碳膜。 微孔支持膜：高分辨率觀察使用。472） 包埋塊修整：修成四面錐體（45oC角）485）超薄切片機的構(gòu)造 6）切片操作 7） 切片厚度: 灰色 40-50nm 銀灰色 50-70nm 金黃色 70-90nm 紫色 90nm以上49(7)染色1） 常用的電子染色劑醋酸鈾(UO2(CH3COO)2.2H2O：特性：具有放射性和毒性，對光不穩(wěn)定，儲存、染色最好閉光，變混則失效。廣泛使用，能產(chǎn)生較高的反差。主要是提高核酸、核蛋白和結(jié)締組織纖維成分的反差；對糖分、分泌顆粒、溶酶體等也能染色，但對膜的結(jié)構(gòu)染色較差。常用濃度

17、：50%-70%的乙醇或丙酮配制的2%-3%的溶液。染的時間：組織塊染色時間為1-2h或過夜。片染30min即可。 50枸櫞酸鉛（lead acetate）：特點：毒性大。與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成白色的碳酸鉛沉淀。高PH（11-12）染色效果好。也是目前最廣泛使用的染色液。它具有很高的電子密度，對細胞超微結(jié)構(gòu)均有廣泛的親和性，能提高細胞膜系統(tǒng)及酯類的反差。枸櫞酸鉛（lead citrate）溶液的配制硝酸鉛Pb(NO3)2 1.33g枸櫞酸鈉Na3(C6H6O7).2H2O 1.76g雙蒸水 30ml混合后振蕩30min呈乳白色，加1.0mol/L新鮮配制的NaOH8ml雙蒸水 加至50ml 調(diào)PH到12 512） 染色方法A、 手工染色 單染色：用一種染色液；一般材料鉛染好，免疫組化鈾染好。 雙染色：先用醋酸鈾染色，再用檸檬酸鉛染