高效液相色譜詳解郝建濤通用PPT課件

1、高效液相色譜（HPLC）主講：郝鳳霞能源化工重點實驗室目 錄 基礎理論 上機操作前的準備工作 Agillent 1100 的操作 常見故障排除 HPLC在科研中的應用一、基礎理論溶于流動相(mobile phase)中的各組分經過固定相時，由于與固定相(stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出。 1、色譜柱的分離原理 色譜分析法的分類按兩相的狀態(tài)分類流動相液體流動相氣體固定相固體液體固定相固體液體名稱液固色譜液液色譜名稱氣固色譜氣液色譜總稱液相色譜總稱氣相色譜2、分離模式鍵合相色譜、液液色譜、

2、尺寸排阻色譜鍵合相色譜正相色譜： 流動相極性 固定相極性常規(guī)分析，80 色譜圖和峰參數(shù)色譜圖(chromatogram)-樣品流經色譜柱和檢測器，所得到的信號-時間曲線，又稱色譜流出曲線。基線(base line)-經流動相沖洗，柱與流動相達到平衡后，檢測器測出一段時間的流出曲線。一般應平行于時間軸。噪音(noise)-基線信號的波動。通常因電源接觸不良或瞬時過載、檢測器不穩(wěn)定、流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致。漂移(drift)-基線隨時間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移。3、HPLC中的基本概念和術語色譜峰

3、(peak)-組分流經檢測器時響應的連續(xù)信號產生的曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。峰高(peak height，h)-峰的最高點至峰底的距離。峰寬（peak width，W)-峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。半峰寬（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半處的峰寬。峰面積(peak area，A)-峰與峰底所包圍的面積。死時間(dead time，t0)-不保留組分的保留時間。即流動相（溶劑）通過色譜柱的時間。保留時間(retention time，tR)-從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時

4、間。流動相的洗脫方式等度洗脫輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑梯度洗脫 A 泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器 B泵AB時間B 濃度分析時間長分離度差 MeOH / H2O = 4 / 6MeOH / H2O = 8 / 2等度洗脫95%30%MeOH 濃度梯度洗脫梯度洗脫是 HPLC 的常用手段 梯度洗脫裝置 流動相中含有兩種或兩種以上不同極性的溶劑，在洗脫過程中連續(xù)或間斷的改變流動相的組成，以調節(jié)它的極性，使樣品中每個組分都有較高的分離度，從而實現(xiàn)各組分的圓滿分離，梯度洗脫可提高柱效，縮短分析時間，改善檢測器的靈敏度，它類似于氣相色譜的程序升溫技術。4、高效液相色譜法的應用范圍 高效液相

5、色譜法適于分析沸點高、相對分子質量大，受熱易分解的不穩(wěn)定有機化合物、生物活性物質以及多種天然產物，這些化合物約占全部有機化合物的80%，可應用于化工生產、制藥工業(yè)、食品工業(yè)、生物化工、醫(yī)學臨床檢驗和環(huán)境監(jiān)測等領域。5、HPLC的系統(tǒng)輸液泵 相當于人的心臟，不斷提供連續(xù)、穩(wěn)定、精確的流量進樣器 樣品引入系統(tǒng)色譜柱 關鍵部分，在這里樣品實現(xiàn)分離檢測器 對分離后的樣品進行檢測數(shù)據記錄與處理裝置數(shù)據分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據處理系統(tǒng)HPLC的系統(tǒng)組成Agilent 1100 高效液相色譜儀儲液瓶真空脫氣機混合室自動進樣器分離柱VWD手動進樣自動進樣六通閥進樣演示分離系統(tǒng)色譜柱功能：組

6、分分離目標：分辨力強效率高吸附劑化學鍵和固定相色譜柱化學鍵合相色譜柱:70% 將不同的官能團通過化學反應鍵和到硅膠表面的游離羥基上，而形成化學鍵和固定相，進而形成化學鍵和相色譜柱。反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相色譜是目前應用得最為廣泛的高效液相色譜方法。正相: 20%;-NH2、 -CN其它 (手性柱， 離子交換柱): 10%柱溫箱控制溫度，保證分析結果重現(xiàn)性升高溫度，降低了流動相的黏度，降低柱壓，保證色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性升溫對于反相 HPLC分離強疏水肽的影響 (B27)流動相: A: 含0.05%三氟乙酸的水B: 含0.05%三氟乙酸的乙腈2% B / min進樣量: 10

7、0L (50g的6M脲/5%乙酸)UV: 210 nm流速: 1 mL/min室溫液相色譜柱: C18色譜柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5m室溫300C400C500C600C700C提高柱溫，可增加柱效（提高靈敏度）檢測器選擇性紫外(VWD、DAD)熒光電化學通用型示差折光蒸發(fā)光散射質譜檢測系統(tǒng)藥典中的液相檢測器 檢測器簡介（一）紫外吸收檢測器（UVD）原理：用特定波長的紫外光照射樣品池，通過檢測透光率的 變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定，波長可變和光二極管陣列三種類型。特點：選擇性檢測器、波長檢測范圍：190-800nm ；對流量和溫度敏感性低、靈敏度較高（10-9g）；應

8、用最廣，對大部分有機化合物有響應；對流動相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。定量基礎：Lambert-Beer定律，AKbc2022/7/12光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。檢測器簡介（二）熒光檢測器（fluorescence detector） （FLD）原理：某些溶質在紫外光激發(fā)后能發(fā)射可見光（熒光）的性質檢測。特點：選擇性檢測器、靈敏度高（10-12g）、對流量和溫度敏感性低。 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農藥、藥物、氨基酸、甾類化

9、合物等有響應。檢測器簡介（三）檢測器簡介（四） 蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）原理：通過檢測光散射程度而測定溶質濃度的檢測器。色譜柱后流出物在通向檢測器途中，被高速載氣（氮氣）噴成霧狀液滴，再進入蒸發(fā)漂移管中，流動相不斷蒸發(fā)，含溶質的霧狀液滴形成不揮發(fā)的微小顆粒，被載氣載帶通過檢測器。在檢測器中，光被散射的程度取決于溶質顆粒的大小與數(shù)量。特點：消除了溶劑的干擾，不受溫度變化影響，靈敏度高，是通用型檢測器。檢測器簡介（五） 電導檢測器（ECD）原理：監(jiān)測溶液的電導率變化的檢測器。特點：選擇性檢測器、測量時要求恒溫、對流動相的組成變化有明顯響應、靈敏度低（10-3g）。適用于離子型化合物。 示差折光

10、指數(shù)檢測器（RID）原理：監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折射率之差來測量試樣濃度的檢測器。特點：通用性檢測器，溫變化要保持在0.001、靈敏度低（10-6g） 二、上機操作前，我們需要準備好什么？如：樣品怎么處理？ 流動相怎么選？ 儀器參數(shù)怎么設置？ 1樣品的前處理 最好使用流動相溶解樣品。 使用預處理除去樣品中的強極性或與柱填 料產生不可逆吸附的雜質。 使用0.45m的過濾膜過濾除去微粒雜質。樣品準備樣品完全溶解在流動相中樣品沒有完全溶解過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒用流動相或比流動相弱的溶劑溶解樣品進樣量盡量小樣品過濾頭的類型：30mm內徑：適用于大進樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)

11、格材料有，纖維素，醋酸纖維，聚四氟乙烯。處理樣品體積少于50l。13mm內徑：適用于范圍廣的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格。3mm內徑：適用于小進樣量的過濾，由0.2m和0.45m兩種規(guī)格。處理樣品體積為7l。濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽，并無任何可溶物。醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶液，推薦用于蛋白質和其相關樣品。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可用于強酸，70%乙醇、二氯甲烷、不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：具有蛋白吸收低，同樣適用水溶性樣品和有機溶劑。注意：1：每張濾膜只能用一次。 2：水相和有機相不要搞混。2流動相的配制流

12、動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應流動相的黏度要盡量小分離效果好柱壓低，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。在流動相配制好后，一定要進行脫氣。準備流動相1) 色譜級純或優(yōu)級純乙腈或甲醇 水超純水，18.2Mcm過濾裝置為什么要過濾？1、對色譜柱、儀器起到保護作用色譜柱：由于填料顆粒很細，色譜柱內腔很小，溶劑和樣品中的細小顆粒會使色譜柱和毛細

13、管容易堵塞。儀器：溶劑和樣品中的細小顆粒會增加進樣閥的堵塞和磨損，同時也會增加泵頭內的藍寶石活塞桿和活塞的磨損。2、消除由于污染對分析結果的影響3) 溶劑準備：脫氣目 的流動相使用前必須進行脫氣處理 ，以除去其中溶解氣體。 以防止在洗脫過程中當流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。 溶解的氧氣還會導致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。 若用FLD，可能會造成熒光猝滅。常用的脫氣方法氦氣脫氣法：利用液體中氦氣的溶解度比空氣低，連續(xù)吹氦脫氣，效果較好，但成本高。加熱回流法：效果較好，但操作復雜，且有毒性揮發(fā)污

14、染。抽真空脫氣法：易抽走有機相。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中，用超聲波振蕩10-15min，此法效果最差。在線真空脫氣法：Agilent1100LC真空脫機利用膜滲透技術， 在線脫氣，智能控制，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。3、流動相流速的選擇具體根據色譜柱的內徑選擇 柱子的內徑（5m填料）流速（ml/min）4.61 - 23.00.4 - 0.82.10.2 - 0.41.00.05 - 0.094、波長選擇首先在可見紫外分光光度計上測量樣品液的吸收光譜，以選擇合適的測量波長，如最靈敏的測量波長并避開其它物質的干擾。從紫外光譜中還可大體知道

15、在HPLC中的響應值，如吸收度小于0.5時，HPLC測定的面積將會很小。5記錄時間第一次測定時，應先將空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液各進一針，并盡量收集較長時間的圖譜（如30分鐘以上），以便確定樣品中被分析組分峰的位置、分離度及是否還有雜質峰在較長時間內才洗脫出來，確定是否會影響主峰的測定。三、Agilent 1100 機器操作1、檢查流動相Purge閥（清洗閥、排液閥）處于松開狀態(tài)Purge閥 逆時針打開清洗閥順時針關閉清洗閥毛細管出口,流向進樣器廢液管,清洗閥打開時溶劑由此流向廢液瓶.1、檢查流動相Purge閥（清洗閥、排液閥）處于松開狀態(tài)把流動相放入溶劑瓶中，且濾頭浸入到液面下 A 水

16、 B 甲醇 C 乙腈 D 緩沖液2、沖洗管路選擇流動相為10異丙醇90水 （按此比例配好溶液后存放在礦泉水瓶中） 調節(jié)流速大約為1d/3s。3、打開電腦，等待TAP窗口出現(xiàn)4、打開1100各模塊開關指示燈狀態(tài)每個部件接通電源后LED燈顯示綠色關機 power off準備進樣 power on沒準備好Not Ready運行Run故障Error駐留ResidentBlink儀器LED狀態(tài)顯示電源開關顯示黑Black黑Black黃Yellow綠Green紅Red黃閃爍Yellow blinking6種LED儀器狀態(tài)：5、待1100自檢完畢，雙擊online，啟動工作站化學工作站自動與1100LC通訊

17、，進入工作站畫面。其它功能菜單文件處理運行控制儀器控制序列放棄任務在線幫助工作站任務切換快捷鍵方法存取快捷鍵序列存取快捷鍵運行方法運行序列面對工作站，我該怎么辦？What should I do？我們知道要運行樣品需要設置控制儀器的參數(shù)，比如泵流速、流動相比例、柱溫、檢測器波長、樣品校正等；在Agilent化學工作站中我們把儀器控制和數(shù)據分析以及儀器相關的運行等所有參數(shù)稱為一個方法Method；所以要運行一個樣品，首先要得到一個正確的方法；在Agilent化學工作站中要得到方法要么調用一個已經存在的方法，要么自己編輯一個新的方法；一般來說，通過查閱資料比如國家標準或行業(yè)標準、藥典、專業(yè)技術資料

18、、EPA等都可以得到樣品分析的詳細方法；您需要做的就是把這些方法在Agilent化學工作站中建立起來，然后運行儀器并得到數(shù)據。6、方法的編輯1）調用方法在Method中點擊Load Method工作站彈出下面對話框.在右面對話框中選中要調用的方法名,點擊“OK”,該方法即被激活.使用 Edit Entire Method 編輯一個完整的方法2）編輯一個新方法選擇所要編輯的內容畫面1:方法組成在你想要的部分前選中,否則方法里將不包括該部分的內容。比如本方法不包括數(shù)據分析的內容。方法信息儀器控制與數(shù)據采集數(shù)據分析運行時間表方法信息 (Method Information)畫面2：方法信息輸入您想要

19、對方法的說明，比如方法的用途、來源等信息。包括：流量(Flow)，流動相組成(Solvents)，停止采集時間(Stop Time)，梯度編程(Timetable)，壓力限制設定(Pressure Limits)泵的操作參數(shù)壓力限制：Max最高壓力，Min最低壓力流動相梯度表輸入流量(Flow)輸入停止采集時間(Stop Time)輸入流動相組成，B、C、D可輸，A=100-B-C-D輸入流動相名稱畫面3：泵參數(shù)（四元泵）檢測器參數(shù)設置畫面5：檢測器參數(shù)VWD輸入使用的波長控溫范圍：低于室溫1080兩個單獨的加熱區(qū)。 安裝切換閥可以進行柱切換。可以容納30 cm長色譜柱。安裝柱識別可以自動記錄

20、進樣次數(shù)。柱溫箱畫面6：恒溫柱箱參數(shù)設置輸入控制溫度溫度編程表從Method菜單選擇Save Method / Save Method as或從存貯方法工具圖標存貯方法。存貯方法換名保存覆蓋保存另存時在此處輸入方法名7、樣品的測定要分析單個樣品, 從RunControl菜單選擇 Sample Info., 輸入樣品信息。樣品信息包括：操作者姓名(Operator Name)，存盤數(shù)據文件(Data File)，樣品參數(shù)(Sample Parameters)。然后運行方法(Run Method)。指定樣品瓶號及數(shù)據路徑樣品瓶所放位置子目錄名稱數(shù)據形式Manual為手動，Prefix/Counte

21、r為自動累加。從Instrument 菜單選擇System on。鼠標左鍵點擊紅色或藍色標題，即可將Y軸顯示成對應的相應值和單位8、數(shù)據分析從“View ”菜單中，單擊“Data analysis”進入數(shù)據分析畫面 從“File ”菜單選擇“Load signal ” ，選中您的數(shù)據文件名，如下圖所示。單擊Ok。 調用信號文件疊放多個信號文件做譜圖優(yōu)化,從“Graphics”菜單中選擇“Signal options ”選項。從Ranges中選擇Auto scale及合適的顯示時間，單擊ok，或選擇”Use Ranges ”調整。反復進行，直到圖的比例合適為止。 圖形優(yōu)化圖形優(yōu)化Signal O

22、ptions信號選項積 分 從“Integration ”中選擇 “Auto integrate ”，如積分結果不理想，再從菜單中選擇“Integration Events ”選項，選擇合適的Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。積分參數(shù)優(yōu)化Integration Events積分參數(shù)選項（及快捷鍵）積分參數(shù)Slope Sensitivity設置斜率靈敏度，截除噪音積分Peak Width設置半峰寬度，遠大于或小于該數(shù)值的峰的積分將被截除Area Reject設置面積截除，截除面積低于此值的峰的積分Height Rejec

23、t設置峰高截除Shoulders設置肩峰參數(shù)這是一張優(yōu)化了積分參數(shù)的譜圖積分，噪音及雜質積分已被截除。9、打印報告10、回到Method and Run control 可繼續(xù)測量11、關機1）沖洗管路和色譜柱30min A：水 B：甲醇（如果使用了D緩沖溶液，則用一干凈小燒杯盛放超純水） 流速：5ml/min2）用甲醇2030ml沖洗進樣閥3）關閉工作站4）關閉TAP窗口5）關1100的電源6）關電腦7）在大型儀器使用記錄本上登記8）關閉實驗室的水、電、氣及門窗等小結：液相色譜操作步驟倒入流動相，裝柱開機：計算機Bootp 開設備打開Chemstation工作站創(chuàng)建（調用）方法排氣：打開排氣

24、閥，先排有機相、再排無機相，5ml/min流速調至0.1ml/min，擰緊排氣閥。平衡柱子：梯度升速至最終流速，基線平直1015min系統(tǒng)平衡后點擊“start”開始進樣操作結束：10%有機相+90%水洗柱0.5h；再用純有機相洗0.51h；梯度降速至0ml/min關機、卸柱子四、常見故障排除 液相色譜儀結構復雜，且不同型號的色譜儀，出故障時產生的現(xiàn)象有可能不同，以下羅列的現(xiàn)象僅供參考：現(xiàn) 象原 因排除方法輸液泵壓力指示為零(或0.5 MPa)且柱后無液體流出。1.柱前導管接頭漏液2.泵柱室內有大量氣泡存在3.貯液瓶內試劑用完4.輸液泵未工作1.檢查各接口是否有漏液；2.放開泵出口接頭；用“清

25、洗”鍵沖洗泵體；3.添加流動相；4.按輸液泵操作方法，檢查其工作狀態(tài)。 常 見 故 障 排 除現(xiàn) 象原 因排除方法輸液泵壓力指示超過規(guī)定的范圍，且柱后無液體流出1.分離柱阻力過大(陳舊柱子)2.柱前導管堵塞3.泵柱塞內有少量氣泡存在4.柱子進口處過濾膜堵塞5.進樣閥手柄未旋到底(處于中間狀態(tài))6.導管中有顆粒狀固體堵塞1.更換柱子2.從柱后開始逐級向上拆開接頭檢查3.拆開泵接頭，用“清洗”檔趕盡氣泡。4.拆開柱前接頭、更換或清洗過濾膜5.左右旋動六通閥至極限位置6.逐級檢查，并更換導管 常 見 故 障 排 除現(xiàn) 象原 因排除方法柱前壓力逐漸升高1.流動相中存在大顆粒的物質2.樣品未經過過濾處理

26、3.柱子輸入端濾片污染1.流動相經5m的真空抽濾瓶過濾后再使用2.樣品須經濾膜過濾3.拆下柱的濾片用超聲波清洗，同時刮去柱口表面被污染的固定相基線大幅度波動(即紫外檢測器的輸出電平值極不穩(wěn)定)1.流通池內留有大量的氣泡2.流通池漏液3.紫外檢測器有故障1.排除氣泡2.檢修流通池3.停止恒流泵工作，檢查紫外檢測器 現(xiàn) 象原 因排除方法組份峰極小或不出峰1.波長選擇不正確2.檢測器輸出衰減 太大3.進樣口漏液4.進樣閥樣品廢液管堵塞，樣品未進入定量管 5.進樣后未按啟動鍵6.定量管容積過小7.樣品濃度過稀8.檢測器燈源老化或失效9.流動相不純1.按標準重新選擇波長2.重新選擇輸出量程范圍3.修理進

27、樣閥4.拆下六通閥上廢液管(5#，6#)重新安裝5.進樣后立即按啟動鍵6.更換大容量定量管7.濃縮樣品后再進樣8.更換燈源9.選擇高純度的流動相 常 見 故 障 排 除現(xiàn) 象原 因排除方法溫度指示波動11.設置溫度值過低2.柱箱密封蓋未蓋好3.溫度控制器未啟動4.柱箱升過高溫后， 再設置低溫5.溫控部件有故障6.控溫鉑電阻接觸 不良1.設置最低溫度應 室溫以上102.檢查柱安裝過程3.按 起始 鍵(指示燈 亮)4.開機后會逐漸穩(wěn)定 (正?，F(xiàn)象)5.修理溫度控制器6擰緊固定鉑電阻引 線的螺釘 常 見 故 障 排 除現(xiàn) 象原 因排除方法檢測器開機時屏幕 顯示不正常，出現(xiàn)缺字、坐標圖形異樣、光標無法

28、移動等現(xiàn)象。工作電源不正常或儀器附件有強干擾源存在。1.檢查工作電源電壓，采取穩(wěn)壓措施2.關機后重新開機3.檢測器微機系統(tǒng)故障常見圖譜分析 由于液相色譜儀在工作中受到的影響因素較多，因此出現(xiàn)的色譜圖形也較為復雜，除與操作者的使用和儀器所處的環(huán)境有關外，還與分離柱、流動相性質、分析對象的性質、所選擇的工作條件有關。現(xiàn)僅對與儀器性能有關的常見圖譜作一粗略分析，供參考。 圖 譜分析原因現(xiàn)象說明及排除1.環(huán)境溫度變化過大2.液流不穩(wěn)定或有漏液3.在技術指標范圍內1.避開室內通風口位 置和發(fā)熱或制冷源2.觀察泵的工作狀態(tài), 并查漏3. 110-4Au 圖 譜分析原因現(xiàn)象說明及排除1.外界干擾訊號2.輸液泵柱室內有氣泡3.流通池內有氣泡1.使機殼良好接地， 排除附近干擾源2.用“清洗”鍵或排 放閥排除氣泡3.拆下輸入導管，大 流量沖洗池體或在 池體出口增加阻力 (接長排液導管)漂移1.儀器在穩(wěn)定中2.在技術指標范圍內3.柱箱升過高溫后， 再處于室溫工作4.檢測器工作不穩(wěn)定1.正?，F(xiàn)象2.屬正常狀態(tài)3.將分離柱從柱箱 內取出后使用4.元器件工作點不穩(wěn) 定，修理后再使用 圖 譜分析原因現(xiàn)象說明及排除1.組份分離不佳 a.色譜柱選擇有誤 b.流動相不符合分析要求 c.柱后導管過長2.波長選擇不正確3.流速過大1.重疊峰 a.更換色譜柱 b.重新選擇流動相 c.盡可能