生化分離工程蘇海佳第三章細(xì)胞破碎

1、生化分離工程蘇海佳第三章細(xì)胞破碎微生物的代謝產(chǎn)物多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于在發(fā)酵液中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的多數(shù)蛋白質(zhì)不會(huì)被分泌到發(fā)酵液中，而是在細(xì)胞內(nèi)沉積。脂類和一些抗生素也是包含在生物體中。目標(biāo)產(chǎn)物就是細(xì)胞本身，如面包酵母。胞外胞內(nèi)細(xì)胞細(xì)胞破碎是指：選用物理、化學(xué)、酶或機(jī)械的方法來破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜。胞外物質(zhì)胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)酵液預(yù)處理澄清液收集菌體細(xì)胞破碎轉(zhuǎn)入液相碎片別離主要?jiǎng)澐譃閮纱箢? 化學(xué)法和機(jī)械法31 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成1. 細(xì)菌的細(xì)胞壁 所有的細(xì)菌細(xì)胞壁由鞏固的骨架肽聚糖組成 1、肽聚糖由聚糖鏈借短肽交聯(lián)而成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，

2、使細(xì)胞有一定的形狀和強(qiáng)度；2、短肽一般由4-5個(gè)氨基酸組成，常含有D-氨基酸與二氨基庚二酸；3、聚糖鏈由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交替通過1-4糖苷健連接而成。短肽接在N-胞壁酸上，相鄰的短肽交叉相連，形成網(wǎng)狀。所有細(xì)菌都含有肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁較厚，約15-50nm，肽聚糖含量占40%一90%。其余是多糖和磷壁酸；革蘭氏陰性菌的肽聚糖層約，外有一外壁層約8-l0nm，由脂蛋白和脂多糖及磷脂構(gòu)成的兩層外壁層。革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁比革蘭氏陰性菌鞏固，較難破碎。特點(diǎn)： 破碎阻力：肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度，與肽鍵的數(shù)量和交聯(lián)度有關(guān)。 Gram-negative

3、 procaryotes革蘭氏陰性原核生物E.coli1、里層葡聚糖的細(xì)纖維細(xì)胞壁的剛性骨架；2、覆蓋在細(xì)纖維上的是一層糖蛋白；3、外層是由1，6磷酸二脂鍵共價(jià)連接而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的甘露聚糖；4、其內(nèi)部有甘露聚糖酶的復(fù)合物。2、酵母的細(xì)胞壁組成：由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，比革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁厚，更難破碎。例如，面包酵母的細(xì)胞壁厚約70nm。特點(diǎn)：破壁阻力：壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和壁厚。植物細(xì)胞壁的主要組成成分是纖維素 在初生壁上還有半纖維素和果膠質(zhì)纖維素是由鏈狀結(jié)構(gòu)的-D-葡萄糖以1，4-葡萄糖苷鍵結(jié)合，纖維素分子束聚集微纖絲 植物細(xì)胞壁的框架，而其他物質(zhì)填充在微纖絲之間的空隙中植物細(xì)胞壁

4、的根本結(jié)構(gòu)。在枯燥植物體中纖維素約占總重的1/3一1/2。就是使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜受到不同程度的破壞 (增大通透性)或破碎，釋放其中的目標(biāo)產(chǎn)物。 細(xì)胞的大小，形狀、聚合物的交聯(lián)程度破碎細(xì)胞的目的影響破碎的因素： 3.2 細(xì)胞破碎和產(chǎn)物釋放原理利用化學(xué)、生化試劑或酶改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，增大胞內(nèi)物質(zhì)的溶解速率，或完全溶解細(xì)胞壁，形成原生質(zhì)體，在滲透壓作用下，細(xì)胞膜破裂釋放胞內(nèi)物質(zhì)。化學(xué)法壓縮力和剪切力高壓勻漿、珠磨、撞擊破碎、超聲波破碎機(jī)械法主要有：酸堿處理、化學(xué)試劑處理、酶溶滲透壓沖擊法和凍結(jié)融化法物理滲透法細(xì)胞破碎機(jī)理 3.3 mechanical disruption 機(jī)械破碎1、處理量大

5、，破碎快，時(shí)間短，效率較高，工業(yè)規(guī)模的重要手段；2、作用力：擠壓，剪切和撞擊作用；3、在許多情況下，細(xì)胞內(nèi)含物全部釋放出來；4、由于機(jī)械攪拌產(chǎn)生熱量，破碎要采用冷卻措施。機(jī)械法破碎特點(diǎn)機(jī)械破碎主要的方法有珠磨法、高壓勻漿法、撞擊破碎法和超聲波等方法。1. 高壓勻漿法high-pressure homogenization 原理：利用高壓迫使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速撞擊造成細(xì)胞破裂，在高壓勻漿器中，細(xì)胞經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞和由高壓到常壓的突變，從而造成細(xì)胞壁的破壞，細(xì)胞膜隨之破裂，胞內(nèi)產(chǎn)物得到釋放。高速勻漿破碎的動(dòng)力學(xué)方程為：細(xì)胞破碎率S與操作壓力P和循環(huán)次數(shù)N之間的關(guān)系。

6、 k為破碎速度常數(shù)上述參數(shù)隨微生物種類和培養(yǎng)條件的不同而有所差異壓力P可用動(dòng)能表達(dá)： 影響因素：細(xì)胞破碎率用包內(nèi)產(chǎn)物釋放率表示： 1、壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)，操作壓力影響最大。工業(yè)生產(chǎn)中常采用的壓力為5570Mpa。2、不同菌種，不同生長期以及不同培養(yǎng)條件。優(yōu)點(diǎn)：1、操作參數(shù)少，且易于確定；2、樣品損失量少，在間歇處理少量樣品方面效果好3、適用于酵母和大多數(shù)細(xì)胞的破碎。適用范圍：1、適用于酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞；2、細(xì)胞濃度可達(dá)20%；3、團(tuán)狀或絲狀真菌易造成堵塞，一些易損傷勻漿閥，質(zhì)地堅(jiān)硬的亞細(xì)胞器一般不適用；4、需設(shè)置冷卻裝置。原理：細(xì)胞懸浮液與玻璃珠或石英砂，或氧化鋁一起高速攪拌，

7、研磨使細(xì)胞到達(dá)某種程度破碎，2. 珠磨法Bead milling作用力：剪切力層之間的碰撞和磨料的滾動(dòng)WSK臥式高效全能珠磨機(jī)ZM系列臥式密閉珠(砂)磨機(jī)兩種情況下，細(xì)胞破碎動(dòng)力學(xué)可近似表示為：t：為細(xì)胞懸浮液在破碎室內(nèi)的平均停留時(shí)間其中V 為懸浮液體積m3，Q為懸浮液流量m3/S，S為破碎率，k為破碎速率常數(shù)，與許多因素有關(guān)。可采用間歇式與連續(xù)操作。間歇操作：t為破碎操作時(shí)間即連續(xù)操作：1、隨細(xì)胞種類而異；2、同一進(jìn)料速度，細(xì)胞濃度，那么破碎率，能耗；3、同一懸浮液中，破碎的能耗與破碎率成正比，提高破碎率，導(dǎo)致電能消耗增加；4、對(duì)一定細(xì)胞，存在適宜的微球粒徑，通常D/d=30-100， D：

8、微球粒徑；d：目標(biāo)細(xì)胞粒徑。 攪拌轉(zhuǎn)速懸浮液進(jìn)料速率微球大小微球填充密度細(xì)胞濃度微球密度溫度攪拌槳設(shè)計(jì)破碎室的幾何形狀影響1、操作簡便穩(wěn)定，破碎率可控制，易放大2、在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模上已得到應(yīng)用3、適用于絕大多數(shù)微生物細(xì)胞破碎，特別對(duì)于有大量菌絲體的微生物和一些有亞細(xì)胞器質(zhì)地堅(jiān)硬的微生物細(xì)胞。缺點(diǎn)：破碎過程產(chǎn)生大量的熱能，有效能量利用率僅為1%，應(yīng)充分考慮換熱。優(yōu)點(diǎn)：3、撞擊破碎原理：將細(xì)胞冷凍可使其成為剛性球體，降低破碎的難度。如圖：細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)，形成粒徑小于50 m的微粒子。高 速載氣 (如氮?dú)?，流速約300m/s)。將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生

9、破碎。1、細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細(xì)胞破碎均勻，可防止細(xì)胞反復(fù)受力發(fā)生過度破碎的現(xiàn)象。2、細(xì)胞破碎程度可通過無級(jí)調(diào)節(jié)載氣壓力 (流速)控制，防止細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器 (如線粒體、葉綠體等)的回收。3、適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破碎，通常處理細(xì)胞懸浮液濃度為10%-20%。4、實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50-500cm3，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理在l0dm3/h以上.特點(diǎn)：4、超聲波破碎法(Ultrasonication)破碎機(jī)理：是與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)，即空穴作用產(chǎn)生的空穴泡由于又受到超聲波的沖擊而閉合，從而產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊力壓力，由

10、此而引起懸浮細(xì)胞上產(chǎn)生了剪切應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)液體產(chǎn)生流動(dòng)而使細(xì)胞破碎?？栈饔脵C(jī)械作用熱效應(yīng)1、處理少量樣品時(shí)操作方便，液體損傷量少，破碎率高。2、有效能量利率極低，操作時(shí)需在冰水中進(jìn)行或通入冷卻劑而增加本錢，不易放大；3、適用于大多數(shù)微生物的破碎，不適于大規(guī)模操作，主要用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎。影響：細(xì)胞種類、濃度、處理時(shí)間以及超聲波的聲頻特點(diǎn)：方法技術(shù)原理效果成本舉例機(jī)械法研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎適中便宜超聲波法用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎適中昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理勻漿法（孔型）須使細(xì)胞通過的小孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎劇烈適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理珠磨破碎法細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細(xì)胞懸浮

11、液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理細(xì)胞機(jī)械破碎法比較 3.4 CHEMICAL METHODS 化學(xué)方法1.堿處理 利用酸堿調(diào)節(jié)pH值，可提高目標(biāo)產(chǎn)物溶解度。堿處理 2030min可導(dǎo)致細(xì)胞溶解。缺點(diǎn)：pH=1111.5的堿濃度破壞了許多生物活性，使蛋白酶失活，常伴隨著蛋白的變性和降解。 優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格廉價(jià)，易適于任何規(guī)模的操作。2. 化學(xué)試劑法化學(xué)滲透取決于試劑的類型和細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)與形成。 1).EDTA螯合劑，對(duì)細(xì)胞的外層膜有破壞作用。如E-coli；原因：二價(jià)陽離子，尤其是Mg2對(duì)革蘭氏陰性菌細(xì)胞被膜以外層膜的穩(wěn)定作用是重要的，EDTA的螯合作用導(dǎo)致外層膜不穩(wěn)定或去除。 2).有機(jī)溶劑法可使細(xì)

12、胞膜外表發(fā)生變化，胞內(nèi)產(chǎn)物可以釋放出來，由于沒有整體破碎細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)選擇性釋放.如采用異丙醇處理酵母，釋放超氧化物歧化酶，處理后，超氧化物歧化酶釋放率達(dá)90，純化因子提高25。3).外表活性劑能夠作用細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁膜，膜結(jié)構(gòu)中的脂蛋白成分被或多或少地溶解，使細(xì)胞滲透作用有利于某些蛋白的通過。如：SDS等作用是溶解蛋白質(zhì)和擾亂蛋白脂界面。 化學(xué)滲透法的優(yōu)點(diǎn)：防止大量細(xì)胞碎片，核酸留在胞內(nèi)，處理后，溶液很容易澄清，簡化后處理步驟，簡單的攪拌容器代替了機(jī)械破碎設(shè)備。 缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，易污染產(chǎn)物，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物活性和最優(yōu)產(chǎn)量的不可逆損失。3. 生物法 酶溶法是利用酶反響分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵而到達(dá)破壁的

13、目的，以提高胞內(nèi)產(chǎn)物和通透性。 優(yōu)點(diǎn)：生物轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，操作條件溫和、能量低、可防止高剪切力，確保產(chǎn)物破壞最小。 缺點(diǎn)：費(fèi)用高，時(shí)間長，多用于原生質(zhì)體自溶作用是酶溶的另一種方式，通過調(diào)節(jié)溫度，PH或添加有機(jī)溶劑等激活劑，誘使細(xì)胞產(chǎn)生溶解自身的酶的方法，稱為自溶。1滲透壓沖擊法Osmotic Shock將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中如一定濃度的甘油或蔗糖溶液，到達(dá)平衡后，介質(zhì)被突然稀釋，或者將細(xì)胞轉(zhuǎn)入緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速通過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞壁和膜膨脹破裂，從而使細(xì)胞通透性增大。 4. 細(xì)胞物理破碎方法原理1、最溫和的一種方法2、選擇性高，釋放速度快，工藝簡單，易放大。3

14、、適用于易破碎的細(xì)胞，和細(xì)胞壁預(yù)先受到酶處理的細(xì)胞，及合成受抑制而強(qiáng)度減弱的細(xì)胞，如動(dòng)物細(xì)胞和革蘭氏陰性菌。特點(diǎn)：缺點(diǎn)：存在著高鹽濃度對(duì)產(chǎn)品污染問題。2) 冷凍融化法(Freczing an thawirg)破壞細(xì)胞膜的疏水鍵，增加其親水性和通透性，而且由于胞內(nèi)水結(jié)晶使胞內(nèi)外產(chǎn)生溶液濃度差，在滲透壓作用下引起細(xì)胞膨脹而破裂。本法對(duì)于存在于細(xì)胞質(zhì)周圍靠近細(xì)胞膜的胞內(nèi)產(chǎn)物釋放較為有效，但由于本法本錢高，只能進(jìn)行小規(guī)模應(yīng)用，且釋放速率慢、產(chǎn)量低，另外酶易失活也限制了它的更進(jìn)一步利用。通過水結(jié)晶的形成和隨后的融化而進(jìn)行細(xì)胞破碎。原理冷凍的目的缺點(diǎn)5. 胞內(nèi)產(chǎn)物的選擇性釋放 細(xì)胞完全破碎的缺點(diǎn)：所有胞內(nèi)的蛋白質(zhì)全部釋放出來，粘度增加，雜質(zhì)增加，給后面別離純化帶來困難。 1、目標(biāo)：細(xì)胞不完全破碎，選擇性釋放，其他物質(zhì)盡量少釋放，粗分。 生化集成：利用兩種以上的不同階段的別離過程同時(shí)進(jìn)行。2、原因：例如利用珠磨法破碎酵母細(xì)胞時(shí)，