病理生理學(xué)ppt課件-第二十一章--病毒感染的檢查與防治

1、第二十一章 病毒感染的檢查與防治病原生物學(xué)學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握：病毒感染性標(biāo)本的采集與送檢；人工主動免疫與人工被動免疫的應(yīng)用。熟悉：病毒的血清學(xué)檢查方法。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法一、標(biāo)本的采集與送檢病毒標(biāo)本的采集與送檢原則基本與細(xì)菌相似。但還要特別注意下列原則：1. 用于分離病毒或檢測病毒及其核酸的標(biāo)本應(yīng)采集患者急性期標(biāo)本。2. 對本身帶有其他微生物（如咽拭子、糞便）或易受污染的標(biāo)本，進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時，應(yīng)使用抗生素以抑制標(biāo)本中的細(xì)菌或真菌等生長繁殖。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法一、標(biāo)本的采集與送檢病毒標(biāo)本的采集與送檢原則基本與細(xì)菌相似。但還要特別注意下列原則：3. 因病毒在室溫中易失去活性，故標(biāo)本應(yīng)

2、低溫保存并盡快送檢，如需較長時間運送，應(yīng)將標(biāo)本置于裝有冰塊或維持低溫的材料（如固態(tài)二氧化碳、低溫凝膠袋等）的保溫容器內(nèi)冷藏。病變組織可置于含抗生素的50%甘油緩沖鹽水中低溫保存。不能立即檢查的標(biāo)本，應(yīng)置于70保存。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法一、標(biāo)本的采集與送檢病毒標(biāo)本的采集與送檢原則基本與細(xì)菌相似。但還要特別注意下列原則：4. 血清學(xué)診斷標(biāo)本的采集應(yīng)在發(fā)病初期和恢復(fù)期各取一份血清，以便對比雙份血清中抗體效價。通常恢復(fù)期血清的抗體效價比急性期增高4倍以上才有診斷意義。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法二、病毒的分離與鑒定（一）病毒的分離培養(yǎng)1. 動物接種 是最早的病毒分離方法，目前用的不多?？筛鶕?jù)病毒的

3、親嗜性選擇敏感動物及其適宜的接種部位，觀察動物的發(fā)病情況、進(jìn)行血清學(xué)檢測、測定ID50和LD50等。該方法簡便，實驗結(jié)果易觀察，對某些尚無敏感的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的病毒，該方法仍在沿用。但動物對許多人類病毒不敏感，或感染后癥狀不明顯，而且動物體內(nèi)常帶有潛在病毒，應(yīng)防止將這些潛在病毒誤作接種的病原體。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（一）病毒的分離培養(yǎng)2. 雞胚培養(yǎng) 雞胚對多種病毒敏感，通常選用孵化914天的雞胚，按病毒接種部位分：絨毛尿囊膜接種，用于培養(yǎng)天花病毒、痘苗病毒及人類皰疹病毒等；尿囊腔接種，用于培養(yǎng)流感病毒及腮腺炎病毒等；羊膜腔接種，用于流感病毒的初次分離培養(yǎng)；卵黃囊接種，用于某些嗜神經(jīng)病毒的培

4、養(yǎng)。因雞胚對流感病毒最敏感，故目前除分離流感病毒還繼續(xù)選用外，其他病毒的分離基本已被細(xì)胞培養(yǎng)所取代。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（一）病毒的分離培養(yǎng)3. 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)法為病毒分離鑒定中最常用的方法?？筛鶕?jù)細(xì)胞生長的方式分為單層細(xì)胞培養(yǎng)(monolayer cell culture)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)(suspended cell culture)。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（一）病毒的分離培養(yǎng)3. 細(xì)胞培養(yǎng) 從細(xì)胞的來源、染色體特征及傳代次數(shù)等可分為：原代細(xì)胞，來源于動物、雞胚或引產(chǎn)人胚組織的細(xì)胞（如人胚腎細(xì)胞等），對多種病毒敏感性高，但來源困難；二倍體細(xì)胞，指細(xì)胞在體外分裂50100代后仍保

5、持2倍染色體數(shù)目的單層細(xì)胞。但經(jīng)多次傳代也會出現(xiàn)細(xì)胞老化，以致停止分裂。常用的2倍體細(xì)胞株有來自人胚肺的WI-26與WI-38株等，用于人類病毒的分離或病毒疫苗生產(chǎn)；傳代細(xì)胞系，由腫瘤細(xì)胞或2倍體細(xì)胞突變而來，能在體外持續(xù)傳代，對病毒的敏感性穩(wěn)定，因而被廣泛應(yīng)用。但不能用來源于腫瘤的傳代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指征：（1）細(xì)胞病變(cytopathy)：部分病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖時可引起特有的細(xì)胞病變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。CPE在未固定、未染色時，用低倍顯微鏡即可觀察到，據(jù)此可作病毒增殖的指標(biāo)。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法病毒在培養(yǎng)細(xì)胞中增殖的指征：（

6、1）細(xì)胞病變(cytopathy)：常見的病變有細(xì)胞變圓、胞質(zhì)顆粒增多、聚集、融合、壞死、溶解或脫落，形成包涵體等，不同病毒的CPE特征不同，如腺病毒可引起細(xì)胞圓縮、團(tuán)聚或呈葡萄串狀；副粘病毒、巨細(xì)胞病毒、呼吸道合胞病毒等可引起細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞或稱融合細(xì)胞等。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（二）紅細(xì)胞吸附（hemadsorption）：帶有血凝素的病毒（如流感病毒）感染細(xì)胞后，細(xì)胞膜上可出現(xiàn)血凝素，能與加入的脊椎動物（豚鼠、雞、候等）紅細(xì)胞結(jié)合，此現(xiàn)象稱為紅細(xì)胞吸附，常用作含有血凝素的粘病毒與副粘病毒等的增殖指標(biāo)。若有相應(yīng)的抗血清，則能中和細(xì)胞膜上的血凝素，阻斷紅細(xì)胞吸附的形成，稱紅細(xì)胞吸

7、附抑制試驗。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（二） 病毒的鑒定1. 病毒形態(tài)學(xué)鑒定 可通過電子顯微鏡和免疫電鏡檢查進(jìn)行形態(tài)觀察和大小的測定。2. 病毒血清學(xué)鑒定 即用已知抗體對病毒進(jìn)行種、型和亞型的血清學(xué)鑒定。方法除常用的免疫標(biāo)記法外，還有血凝抑制試驗等。3. 病毒分子生物學(xué)鑒定 其方法主要包括核酸擴增、核酸雜交、基因芯片、基因測序等分子生物學(xué)技術(shù)。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（三）病毒感染的血清學(xué)診斷應(yīng)用血清學(xué)方法輔助診斷病毒性疾病，其原理是用已知病毒抗原來檢測患者血清中有無相應(yīng)抗體，須待患者感染后體內(nèi)產(chǎn)生抗體時才能檢出。這顯然不能進(jìn)行早期診斷，故對臨床幫助不大。但遇下列情況時仍需做血清學(xué)診斷：采取

8、標(biāo)本分離病毒為時已晚；目前尚無分離此病毒的方法或難以分離的病毒；為證實所分離的病毒的臨床意義；進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查等。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法1中和試驗(neutralization test) 病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗。常用于檢測患者血清中抗體的消長情況，也可用來鑒定未知病毒或?qū)Σ《具M(jìn)行半定量。用系列稀釋的患者血清與等量的已知病毒懸液（100 TCID50或100 ID50）混合，在適溫下作用一定時間后接種敏感細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)孔不產(chǎn)生CPE的血清最高稀釋度作為終點效價。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法1中和試驗(neutralization tes

9、t) 中和抗體(neutralizing antibodies，NTAb)是作用于病毒表面抗原（衣殼或包膜）的抗體，同種不同型病毒間一般無交叉，特異性高，而且抗體在體內(nèi)維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前的隱性感染所致。因此，中和試驗適用于人群免疫情況的調(diào)查，較少用于臨床診斷。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法2血凝抑制試驗(hemagglutination inhibition test) 具有血凝素的病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細(xì)胞，稱血凝現(xiàn)象?，F(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制，稱血凝抑制試驗。其原理是相應(yīng)抗體與病毒結(jié)合后，阻抑了病毒表面的血凝素與紅細(xì)胞的結(jié)合。本試驗簡易、經(jīng)濟、特異性高

10、，常用于粘病毒、乙型腦炎病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)調(diào)查，也可鑒定病毒的型與亞型。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法3補體結(jié)合試驗(complement fixation test) 用已知病毒可溶性補體抗原檢測患者血清中相應(yīng)的補體抗體。補體抗原是病毒的內(nèi)部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和試驗低。但補體抗體出現(xiàn)較早，消失較快，可作為近期感染的指標(biāo)。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（四）病毒感染的快速診斷快速診斷主要是指不分離培養(yǎng)病毒，而直接觀察標(biāo)本中的病毒顆粒，直接檢測病毒成分（抗原或核酸）和IgM抗體等，以作出快速（常在數(shù)小時內(nèi)）和早期診斷。1.形態(tài)學(xué)檢查2.病毒成分檢測3.早期抗體檢測第一節(jié) 病

11、毒感染的檢查方法1.形態(tài)學(xué)檢查（1）電鏡和免疫電鏡檢查 含有高濃度病毒顆粒（107顆粒ml）的樣品，可直接應(yīng)用電鏡技術(shù)進(jìn)行觀察。對那些含低濃度病毒的樣本，可用免疫電鏡技術(shù)觀查。即先將標(biāo)本與特異抗血清混合，使病毒顆粒凝聚，這樣更便于在電鏡下觀察，可提高病毒的檢出率和特異性。 第一節(jié) 病毒感染的檢查方法1.形態(tài)學(xué)檢查（2）光學(xué)顯微鏡檢查 有些病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)增殖后，于細(xì)胞的一定部位（胞核、胞質(zhì)或兩者兼有）出現(xiàn)嗜酸性或嗜堿性包涵體，可在光學(xué)顯微鏡檢查下觀察到，對病毒感染的診斷有一定價值，如取可疑病犬的大腦海馬回制成染色標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有內(nèi)基小體便可確診為狂犬，被咬者則需接種狂犬病疫苗。第一節(jié) 病毒

12、感染的檢查方法 2.病毒成分檢測（1）病毒蛋白抗原檢測 可采用免疫學(xué)標(biāo)記技術(shù)直接檢測標(biāo)本中的病毒抗原進(jìn)行早期診斷。目前常用酶免疫測定(EIA)和熒光免疫測定(FIA)，較少用有放射性污染的放射免疫測定(RIA)，取而代之的是非放射性標(biāo)記物（如地高辛等）技術(shù)。這些技術(shù)操作簡單、特異性強、敏感性高。特別是用標(biāo)記質(zhì)量高的單克隆抗體可檢測到ng(10-9 g)至pg（10-12 g）水平的抗原或半抗原。應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)(Western blot)檢測病毒抗原，具有確診意義。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（2）病毒核酸檢測核酸擴增技術(shù)：選擇病毒特異并保守區(qū)的片段作為擴增的靶基因，用特異引物序列擴增病毒特異序

13、列，以診斷病毒性感染；也可選擇病毒變異區(qū)的片段作為靶基因，結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性分析( RFLP)、測序等分子生物學(xué)技術(shù)可對病毒進(jìn)行分型和突變的研究。目前PCR技術(shù)（包括RT-PCR技術(shù)）已發(fā)展到既能定性又能定量的水平，應(yīng)用較多的是定量實時熒光PCR(real-time PCR)。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法（2）病毒核酸檢測核酸雜交技術(shù)：常用于病毒檢測的核酸雜交技術(shù)有：斑點雜交(dot blot hybridization)、原位雜交(in situ hybridization)、DNA印跡雜交( Southern blot)、RNA印跡雜交(Northern blot)等。 需要說明的是，

14、病毒核酸檢測陽性，并不代表標(biāo)本中或病變部位一定有活病毒。對未知基因序列的病毒及新病毒不能采用這些方法。第一節(jié) 病毒感染的檢查方法3.早期抗體檢測檢測病毒特異性IgM抗體可輔助診斷急性病毒感染，特別是對證實孕婦感染風(fēng)疹病毒尤為重要，但應(yīng)注意類風(fēng)濕因子（IgM）的干擾。另外，檢測早期抗原的抗體是快速診斷的另一途徑，如檢測針對EBV的早期抗原(EA)、核心抗原(EANA)和農(nóng)殼抗原(VCA)等的抗體，可以區(qū)別急性或慢性EBV感染。第二節(jié) 病毒感染的防治原則病毒感染的特異性預(yù)防是應(yīng)用獲得性免疫的原理，以某病毒抗原刺激機體，或給予抗某種病毒特異性免疫產(chǎn)物（如抗體、細(xì)胞因子等），使機體主動產(chǎn)生或被動獲得抗

15、某種病毒的特異性免疫，從而達(dá)到預(yù)防和治療病毒感染性疾病的目的。第二節(jié) 病毒感染的防治原則（一）免疫學(xué)防治1.人工主動免疫常用生物制品（1）滅活疫苗 (inactivated vaccine)（2）活疫苗(living vaccine)（3）重組載體疫苗(recombinant carrier vaccine)（4）亞單位疫苗(subunit vaccine)2.人工被動免疫常用生物制品（1）免疫球蛋白 （2）細(xì)胞免疫制劑 第二節(jié) 病毒感染的防治原則1.人工主動免疫常用生物制品（1）滅活疫苗常用的有乙型腦炎、狂犬病、甲型肝炎、流感等滅活疫苗。（2）活疫苗亦稱減毒疫苗(attenuated vac

16、cine), 常用的有脊髓灰質(zhì)炎、流感、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、乙型腦炎、甲型肝炎等減毒活疫苗。第二節(jié) 病毒感染的防治原則1.人工主動免疫常用生物制品（3）重組載體疫苗痘苗病毒是常用的載體，已被用于甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、麻疹病毒、單純皰疹病毒等重組載體疫苗的研制。第二節(jié) 病毒感染的防治原則1.人工主動免疫常用生物制品（4）亞單位疫苗根據(jù)亞單位疫苗的制備方法不同，可將其分為： 化學(xué)提取或人工合成疫苗：如流感病毒血凝素18個氨基酸肽、型脊髓灰質(zhì)炎病毒、VP1結(jié)構(gòu)蛋白、HBsAg及狂犬病毒刺突糖蛋白等。 基因工程疫苗：又稱重組疫苗，如目前已廣泛使用的重組乙肝疫苗(rHBsAg)。第二節(jié) 病毒感染的

17、防治原則2.人工被動免疫常用生物制品（1）免疫球蛋白 有從正常人血漿中提取的血清丙種球蛋白，主要用于對某些病毒性疾?。ㄈ缏檎睢⒓仔透窝椎龋┑木o急預(yù)防。此外，還有專門針對一種特定病原微生物的高效價的特異性免疫球蛋白，如乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)。第二節(jié) 病毒感染的防治原則2.人工被動免疫常用生物制品（2）細(xì)胞免疫制劑 目前臨床用于治療的細(xì)胞因子包括a、干擾素( IFN-a、)、白細(xì)胞介素(II-2、IL-6、IL-12等)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF) 以及淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK細(xì)胞）。主要用于某些病毒性疾病和腫瘤的治療。第二節(jié) 病毒感染的防治原則（二）藥物和生物制

18、劑治療1. 抗病毒化學(xué)制劑 由于病毒只能在細(xì)胞內(nèi)增殖，故對病毒有效的化學(xué)制劑多數(shù)對機體細(xì)胞有一定損傷作用，因此尚不能廣泛應(yīng)用于臨床。目前療效較好，毒性較小的藥物有鹽酸金剛烷胺、阿糖腺苷、無環(huán)鳥苷、齊多夫定等。第二節(jié) 病毒感染的防治原則2. 干擾素和干擾素誘生劑（1）干擾素：干擾素具有廣譜抗病毒作用，毒性小，使用同種IFN無抗原性，主要用于甲、乙、丙型肝炎，人類皰疹病毒，乳頭瘤病毒和鼻病毒等感染的治療。目前臨床有反復(fù)應(yīng)用引起耐受的報道。IFN治療丙型肝炎效果更好，有效率可達(dá)40%。對HBeAg陽性的慢性肝炎，HBeAg的消失率可從7.3%升至25%。第二節(jié) 病毒感染的防治原則2. 干擾素和干擾素誘生劑（2）IFN誘生劑多聚肌苷酸和多聚胞啶酸(poly I：C)：為目前最受重視的IFN誘生劑。此干擾素誘生劑制備較易，作用