醫(yī)學細胞生物學：第3章 細胞生物學的研究方法

1、第三章 細胞生物學的研究方法學習目的與要求掌握細胞生物學基本研究方法的原理和應用熟悉細胞生物學基本研究方法的技術(shù)特點了解細胞生物學基本研究方法的進展第一節(jié) 顯微鏡技術(shù)一、 光學顯微鏡二、 電子顯微鏡三、 納米顯微鏡普通光學顯微鏡熒光顯微鏡相差顯微鏡暗視野顯微鏡共聚焦激光掃描顯微鏡一、 光學顯微鏡技術(shù)（一）普通光學顯微鏡-分辨率極限是0.25um放大率：最終成像的大小與原物體 大小的比值。分辨率與放大率組織切片的制備蘇木精：核酸伊紅： 細胞質(zhì)蘇丹染料：脂肪切片與觀察肝癌組織切片圖像（二)熒光顯微鏡-呈現(xiàn)強反差的彩色圖像1.熒光和熒光染料 某些物質(zhì)在短波長光波(激發(fā)光）照射下，吸收光能，受到激發(fā)并

2、釋放出一種能量降級的較長的可見光波（藍、綠、黃或紅光，波長400800nm，發(fā)射光），這種光稱熒光。 熒光分子可使樣品呈現(xiàn)不同的染色，因此也稱為熒光染料（如吖啶橙、異硫氰酸熒光素等） 2.熒光顯微鏡的原理和應用特點：照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上 ；光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡； 有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。應用：定性、定位和定量的研究組織與細胞內(nèi)的熒光標記物質(zhì)。醫(yī)學實驗研究及疾病診斷方面的用途日益廣泛。 （三）相差顯微鏡-常用于活細胞觀察培養(yǎng)中的肝癌細胞（四）暗視野顯微鏡-通過散射光成像原理：利用

3、散射光與衍射光成像特點：照明光線不直接進入物鏡，視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的 應用：主要觀察的是物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細構(gòu)造，適合于觀察活細胞內(nèi)的細胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細菌和霉菌等。 （五）共聚焦激光掃描顯微鏡 -提供高清晰度彩色三維圖像工作原理光學切片與三維圖像激光共聚焦顯微鏡圖像 成骨肉瘤細胞中npm蛋白的分布二 電子顯微鏡（Electron Microscope）透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 掃描電子顯微鏡（ Scanning electron microscope, SEM ）（一）透射電子顯微鏡（TEM）

4、透射電子顯微鏡(TEM)與光學顯微鏡(LM)的基本區(qū)別 顯微分辨本領(lǐng)光源透鏡真空 成像原理LM200nm可見光（400-700）玻璃透鏡不要求真空 利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化100nm紫外光（約200nm）玻璃透鏡不要求真空TEM0.1nm電子束（0.01-0.9）電磁透鏡真空1.33x10-51.33x10-3P 利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差透射電子顯微鏡標本制備過程（二）掃描電子顯微鏡（SEM)缺點：分辨率低（3-10nm）掃描電鏡工作原理人成骨肉瘤MG-63細胞的電鏡圖像 TEM SEM（三）透射電鏡借助金屬投影、冰凍斷裂和冰凍蝕刻技術(shù)可獲取三維圖像1.金屬投影與

5、復型原理：以一定角度向樣品表面噴重金屬，樣品表面三維結(jié)構(gòu)可顯示投影效果。應用：蛋白、核酸大分子、病毒顆粒及細胞壁觀察2.冰凍斷裂復型樣品制備：冷凍樣品（液氮-196度）冰刀切割暴露膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)金屬投影法應用：觀察細胞膜性結(jié)構(gòu)的內(nèi)部構(gòu)造 葉綠體內(nèi)膜冰凍斷裂復型，顯示內(nèi)膜上大量膜蛋白3.冰凍蝕刻樣品制備：冷凍組織（液態(tài)氦-269度）冰刀切割真空升華暴露膜及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)金屬復型應用：觀察細胞內(nèi)部構(gòu)造冰凍蝕刻顯示昆蟲肌肉細胞中的蛋白質(zhì)纖維三、納米顯微技術(shù)納米尺度：1nm100nm 掃描隧道顯微鏡原子力顯微鏡 1.掃描隧道顯微鏡（Scanning tunneling microscope，STM)2.原子

6、力顯微鏡（atomic force microscope，AFM)首次觀察到分子的照片原子力顯微技術(shù)的優(yōu)缺點 優(yōu)點：提供真正的三維表面圖；AFM不需要對樣品的任何特殊處理，不會對樣品會造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害；常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作；用來研究生物宏觀分子，甚至活的生物組織；缺點： 成像范圍太小,速度慢，受探頭的影響太大。第二節(jié) 細胞的分離和培養(yǎng)一 、不同類型細胞的分離細胞分離過程需遵循以下原則：分離體系溶液必須是等滲的，具有緩沖性的離子強度。低溫。無菌操作。細胞的分離方法主要有以下幾種：差速離心或密度梯度離心流式細胞技術(shù)免疫磁珠法激光捕獲顯微切割技術(shù)（一）差速離心或密度梯度離心 根據(jù)細

7、胞的大小和細胞密度不同進行分離（二）流式細胞技術(shù)（三）免疫磁珠法（四）激光捕獲顯微切割技術(shù)二、細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)技術(shù)（cell culture）就是在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體中取出的細胞，并使之生長和生存的技術(shù)。（一）細胞培養(yǎng)條件（二）細胞培養(yǎng)基本設(shè)備（三）原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的概念： 原代培養(yǎng)指的是從動物機體取出的進行培養(yǎng)的細胞群。原代培養(yǎng)的細胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數(shù)后（一般10代以內(nèi)）停止生長，需要從更換培養(yǎng)基。將細胞從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另外一個培養(yǎng)瓶即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)的細胞通常表現(xiàn)出來源組織的分化特征。（四）細胞系（五）細胞融合（六）胚胎干細胞

8、（ES)的培養(yǎng)條件胚胎干細胞： 具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和 多向分化的特性 。特殊的培養(yǎng)要求：維持ES細胞處于未分化狀態(tài)。飼養(yǎng)層細胞：分泌成纖維細胞生長因子，促進ES細胞的增殖；分泌白血病抑制因子，抑制ES細胞分化。第三節(jié) 細胞組分的分離與純化技術(shù)一、細胞組分的分級離心二、層析法分離蛋白質(zhì)三、蛋白質(zhì)電泳一、細胞組分的分級離心 離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體，以及各種大分子基本手段。 高速離心機：轉(zhuǎn)速為1025Kr/min；超速離心機：轉(zhuǎn)速超過25Kr/min，離心力大于89K。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100Kr/min，離心力超過500Kg。（一）差速離心（dif

9、ferential centrifugation）在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。 （二）密度梯度離心（density gradient centrifugation） 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。包括速度沉降與平衡沉降兩種方法。介質(zhì)為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。分離活細胞的介質(zhì)要求： 1.能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2.PH中性或易調(diào)為中性； 3

10、.濃度大時滲透壓不大； 4.對細胞無毒。 （三）密度梯度離心-速度沉降與平衡沉降二、層析法分離蛋白質(zhì)（一）層析法原理（二）柱層析的分類三、蛋白質(zhì)電泳 蛋白質(zhì)帶有電荷，具有不同的形狀、大小以及凈電荷的蛋白質(zhì)分子在電場中具有不同的遷移速率，進而被分離。（一）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS)支持介質(zhì)：聚丙烯酰胺凝膠樣品處理：還原劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT)SDS ：多肽鏈帶上負電荷分離原理： 按照分子量的不同分離多肽。（二）等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF) （三）雙向電泳第四節(jié) 細胞化學和細胞內(nèi)分子示蹤技術(shù)一、酶細胞化學技術(shù)二、免疫細胞化學技術(shù)三、放射自顯影技

11、術(shù)四、活細胞內(nèi)分子示蹤一、酶細胞化學技術(shù)二、免疫細胞化學技術(shù)（一）熒光素標記蛋白質(zhì)細胞中的分布PHB（紅色,CY5）和P53（綠色,FITC）蛋白在MG-63細胞中的分布（二）膠體金標記抗體顯示PHB在細胞核基質(zhì)中的分布（三）辣根過氧化物酶反應顯示不同蛋白在細胞中的分布三、放射自顯影技術(shù)四、活細胞內(nèi)分子示蹤（一）離子探針汞離子（二）綠色熒光蛋白融合蛋白GFP-NPM在EC9706細胞中（A）經(jīng)姜黃素誘導凋亡后發(fā)生了顯著的定位變化（B），以及在MG-63細胞中的定位（C）和HMBA誘導分化后細胞中在定位變化（D）。EC9706MG-63（三）熒光共振能量轉(zhuǎn)移第五節(jié) 細胞功能基因組學研究技術(shù)一、基因的基本研究技術(shù)二、RNA干擾技術(shù)三、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)四、生物芯片技術(shù)五、蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)一、基因的基本研究技術(shù)（四）熒光定量PCR技術(shù)（五）DNA測序技術(shù)（六）高通量測序（深度測序技術(shù)）PHB蛋白質(zhì)在原核細胞中的表達PHB基因的RT-PCR PHB基因與pGEX-4T-2載體構(gòu)建GST-PHB融合蛋白的表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌GST-PHB25 0.3 mM IPTG誘導后 GST-PHB大量表達Western確證GST-PHB的融合蛋白在在大腸桿菌BL21中的表達(以MG-63細胞蛋白作為PHB的陽性對照）表達的PHB經(jīng)質(zhì)譜鑒定后確認