生物化學(xué)與分子生物學(xué)：DNA的生物合成-1

1、第三篇 基因信息的傳遞Genetic Information Transfer1基因的定義基因 (gene) 合成有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA所必需的全部核苷酸序列。一般是DNA序列（或RNA病毒中的RNA）。2一個典型的真核基因：結(jié)構(gòu)基因：外顯子（編碼序列）、內(nèi)含子（非編碼序列）及5-端和3-端非翻譯區(qū)(UTR) 調(diào)控序列：通常位于轉(zhuǎn)錄起始點上游基因 結(jié)構(gòu)基因 調(diào)控序列3基因組(genome)是指一種生物體中的整套遺傳信息，一般為一個受精卵或一個體細胞的細胞核中所有DNA分子的總和。特定生物體的整套(單倍體)遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M的大小用全部DNA的堿基對總數(shù)表示。人的基因組的大小： 310

2、9bp4人類基因組特點20000 25000 蛋白編碼基因及大量非編碼的RNA基因，基因的分布不均勻 重復(fù)序列 40%蛋白編碼區(qū)及非編碼區(qū)均存在大量高度保守序列存在許多segmental duplications存在幾百萬個單核苷酸多態(tài)性（SNPs)位點，已發(fā)現(xiàn) 300萬 500萬個 SNPs56DNA的生物合成DNA復(fù)制的基本規(guī)律DNA復(fù)制的酶學(xué)DNA復(fù)制的一般過程逆轉(zhuǎn)錄和其他復(fù)制方式DNA損傷與修復(fù)7是指遺傳物質(zhì)的傳代，以母鏈DNA為模板合成子鏈DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNADNA復(fù)制(DNA replication)81 DNA復(fù)制的基本規(guī)律半保留復(fù)制是DNA復(fù)制的基本特征雙向復(fù)

3、制復(fù)制具有半不連續(xù)性DNA合成起始時需要引物復(fù)制具有高保真性91.1 半保留復(fù)制10平衡密度梯度離心Matthew Meselson & Franklin Stahl The Replication of DNA in Escherichia coli . Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1958 , 44: 671-68211 DNA生物合成時，母鏈DNA解開為兩股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過來，另一股單鏈則完全從

4、新合成。兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制的概念121.2 雙向復(fù)制原核生物復(fù)制時，DNA從起始點(origin)向兩個方向解鏈，形成兩個延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。 證明雙向復(fù)制的同位素標(biāo)記試驗13復(fù)制子(replicon)：從一個復(fù)制起始點開始的DNA復(fù)制區(qū)域。14真核染色體DNA復(fù)制時有多個復(fù)制起始點，形成多個復(fù)制子15(領(lǐng)頭鏈）leading strand - continuous （滯后鏈）lagging strand. . . discontinuous 1.3 半不連續(xù)復(fù)制1617順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，

5、這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因為復(fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazaki fragment)。 領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。 引物（Primer）：一段與模板鏈互補的短的核酸序列,通常是RNA ，其作用在于提供一個自由的 3-OH 與新?lián)饺氲拿撗鹾塑杖姿岬?磷酸基團反應(yīng)生成新的磷酸二酯鍵。 1.4 DNA復(fù)制起始時需要引物18Nucleotides are added at the 3-end of the strand191.5 復(fù)制具有高保真性復(fù)制高保真性的原因：遵守嚴(yán)格的堿

6、基配對規(guī)律；復(fù)制出錯時有即時的校讀功能；DNA損傷修復(fù)機制；復(fù)制終止時RNA引物的切除及填補。Erroneous rate: 10-8 to 10-10 per base pair per round of replication202 DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化 DNA復(fù)制需要多種物質(zhì)：底物：dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)模板(template): 解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer): 提供3-OH依賴DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, 簡寫為DNA-pol 或 DDDP)其他酶和蛋白質(zhì)因子212.1 核苷酸

7、與核苷酸之間生成磷酸二酯鍵是復(fù)制的基本化學(xué)反應(yīng)222.2 DNA聚合酶催化核苷酸之間聚合DNA聚合酶的一般特征：需要引物 需要模板以四種 dNTP為底物5到3聚合活性（合成的新鏈與模板鏈反向互補 ）232.2.1 DNA 聚合酶(DNA pol)1958年由Arthur Kornberg首先發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶，又稱Kornberg酶。245 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?能切除突變的 DNA片段。辨認(rèn)錯配的堿基對，并將其水解

8、。該活性為即時校讀（proofreading)功能所必需 DNA-pol還具有核酸外切酶活性 25DNA-pol的主要功能： 去除引物，填補引物消除后的空隙；對復(fù)制中的錯誤進行校讀，填補修復(fù)中出現(xiàn)的空隙。262.2.2 DNA聚合酶1970年發(fā)現(xiàn)活性只有DNA-pol的5%此酶缺陷的大腸桿菌突變株的DNA復(fù)制都正常?？赡茉贒NA的損傷修復(fù)中該酶起到一定的作用。272.2.3 DNA聚合酶III全酶（ polymerase III holoenzyme ）282.2.3 DNA聚合酶III全酶29“在伯格獲獎十年之后，人們才知道，他所發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶并非細菌真正用于復(fù)制DNA的酶，在細胞內(nèi)執(zhí)行

9、這個任務(wù)的是另一種新發(fā)現(xiàn)的酶DNA聚合酶III。伯格的酶（被命名為DNA聚合酶I）只是在DNA復(fù)制中起修補作用（不過，這種酶后來在分子生物學(xué)研究和遺傳工程中發(fā)揮了巨大的作用）。值得伯格欣慰的是，新的酶是他的二兒子托馬斯科恩伯格在哥倫比亞大學(xué)讀書時發(fā)現(xiàn)的。托馬斯現(xiàn)在是加州大學(xué)舊金山分校的生物化學(xué)教授。 ”（方舟子博客：上陣父子兵）這一家人共發(fā)現(xiàn)了30多種酶。 伯格1975年寫了一本書 “For the love of enzymes” （中譯本：酶的情人：一位生物化學(xué)家的奧德賽）他的大兒子：Roger Kornberg won 2006 Nobel Prize in Chemistry for

10、his work in genetic research.302.2.4 真核生物的DNA聚合酶 統(tǒng)一采用希臘字母命名DNA-pol ：合成引物DNA-pol ：線粒體內(nèi)DNA-pol ：負(fù)責(zé)后續(xù)鏈的合成DNA-pol ：修復(fù)核內(nèi)DNADNA-pol ：負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的合成31ThumbFingersPalm32解鏈過程中正超螺旋的形成2.3 復(fù)制中的解鏈伴有DNA分子拓?fù)鋵W(xué)變化33DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶類型 底物例 子I A型單鏈DNA大腸桿菌拓?fù)涿窱和III， 酵母和人類拓?fù)涿窱II，古細菌反向促旋酶I B型單鏈DNA真核生物拓?fù)涿?III型雙鏈DNA大腸桿菌拓?fù)涿窱I（DNA促旋酶）和IV；真核生

11、物拓?fù)涿?IV34I型拓?fù)洚悩?gòu)酶（Type I topoisomerase ） 切斷DNA單鏈后再重新連接，不需ATP。II型拓?fù)洚悩?gòu)酶（Type II topoisomerase ）切斷DNA雙鏈后再重新連接，需ATP DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶352.4 解螺旋酶解開DNA雙鏈?zhǔn)钩蓡捂溄饴菪?Helicase）即DnaB ，又稱rep蛋白與復(fù)制相關(guān)的基因定名為dnaA, dnaB, dnaCdnaX。相應(yīng)的蛋白質(zhì)命名為DnaA, DnaB, DnaX等。362.5 單鏈DNA結(jié)合蛋白( Single-strand DNA-binding protein， SSB)372.6 引物合成酶 (Prim

12、ase)由大腸桿菌的dnaG基因編碼的引物酶(primase)催化引物RNA分子的合成。382.7 DNA連接酶連接DNA雙鏈中的單鏈缺口連接酶的特點：要求一條DNA鏈有3自由羥基而另一條鏈的5端有磷酸基團；只能連接雙鏈DNA或DNA-RNA雜交雙鏈中的單鏈缺口，但不適于雙鏈RNA鏈中的單鏈缺口，也不適于單鏈DNA或RNA間的連接。39名稱 功能DNA聚合酶 聚合脫氧核苷酸拓?fù)洚悩?gòu)酶 理順DNA鏈解螺旋酶(DnaB蛋白，rep蛋白) 解開DNA雙鏈引物酶(DnaG蛋白) 催化RNA引物生成單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB） 穩(wěn)定解開的單鏈DNA連接酶 連接岡崎片段參與復(fù)制的各種酶和蛋白質(zhì)403 DN

13、A生物合成過程三個階段: 起始 (Initiation ）延伸（ Elongation ）終止（ Termination ）41參與復(fù)制起始的各種蛋白質(zhì)名稱 功能DnaA蛋白 辨認(rèn)起始點解螺旋酶(DnaB蛋白，rep蛋白) 解開DNA雙鏈DnaC蛋白 協(xié)助解螺旋酶引物酶(DnaG蛋白) 催化RNA引物生成單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB） 穩(wěn)定解開的單鏈拓?fù)洚悩?gòu)酶 理順DNA鏈42DNA復(fù)制起點雙鏈解開；引發(fā)體(primosome)的生成；RNA引物的生成；DNA聚合酶將第一個脫氧核苷酸加到引物RNA的3-OH末端。3.1 起始階段43大腸桿菌復(fù)制起始模型44 Dna A Dna B、 Dna CD

14、NA拓?fù)洚悩?gòu)酶引物酶SSB3535引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。 45464748復(fù)制過程簡圖49DNA聚合酶 I催化切除岡崎片段上的RNA引物，并催化岡崎片段繼續(xù)延長填補其缺口DNA連接酶將相鄰的兩個DNA片段連接起來，形成完整的DNA鏈終止區(qū)（terminus region） 核心序列：GTGTGGTGT復(fù)制的終止哺乳動物的細胞周期DNA合成期G1G2SM3.4.真核生物的DNA生物合成 細胞能否分裂，決定于進入S期及M期這兩個關(guān)鍵點。G1S及G2M的調(diào)節(jié)，與蛋白激酶活性有關(guān)。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復(fù)制因子而實施調(diào)控作用

15、。 50起始、延伸和終止三個階段多個復(fù)制子，復(fù)制起始點富含AT堿基復(fù)制中多種蛋白的作用類似原核DNA復(fù)制所需蛋白，但機制更為復(fù)雜復(fù)制過程涉及核小體的解體和重新生成，后續(xù)鏈中岡崎片段的長度就是一個核小體所含的DNA片段長度 真核生物DNA復(fù)制概況51 Pol （或Pol ） 填補岡崎片段之間的空隙 DNA連接酶 封閉缺口 RPA 穩(wěn)定解旋后的單鏈DNA 解旋酶 復(fù)制叉的形成和移動必不可少拓?fù)洚悩?gòu)酶 釋放復(fù)制叉前進時產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力真核生物復(fù)制過程中的酶及功能52線性DNA分子如何避免每復(fù)制一次末端就縮短一次？53The Nobel Prize in Physiology or Medicine 200954真核生物的端粒和端粒酶端粒(telomere)： 真核生物染色體線性DNA末端結(jié)構(gòu)，含DNA串聯(lián)重復(fù)序列，與染色體的穩(wěn)定有關(guān)。55端 ?！岸肆Ｖ谌旧w，好像鞋帶兩頭兒的小塑料套和一根美麗鞋帶的關(guān)系。如果沒有小塑料套，由幾股繩編起來的鞋帶兒就要散架（下圖）；同理，如果沒有端粒，你的染色體就劈叉兒、磨禿。你說這么重要的東西值不值一個諾貝爾獎？”-摘自 “端粒，好好看住別丟了！”（/archives/21095.h