浙液相色譜講義五：液相色譜的實(shí)用技術(shù),色譜柱的保養(yǎng)、樣品前處理匯編

1、液相色譜實(shí)用技術(shù)色譜柱的使用及保養(yǎng)良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時，先測柱效保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄條件定期檢測柱效定期檢測儀器的譜帶展寬色譜柱的使用及操作流動相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱樣品及溶劑的要求色譜柱的保養(yǎng)（一）樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出 了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用色譜柱的保養(yǎng)（二）流動相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配

2、溶劑中的雜質(zhì)含量流動相對樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例在線的保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線過濾器In-Line Filter，部件號 WAT084560防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效在需要高柱效的分析時中常用（如：氨基酸分析）可更換的消耗品更換濾芯，部件號 WAT005139 (5/pkgs)更換墊圈，部件號 WAT084567 (10/pkgs)保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個色譜柱的柱效，特別是在用微柱時保護(hù)柱的種類普通自裝填料的保護(hù)柱Waters的部件號，WA

3、T084550，用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱Waters的部件號，WAT088141有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，也引起柱效降低可換芯式保護(hù)柱新型的保護(hù)柱 Sentry Guard適應(yīng)的用戶類型非常臟, 非常復(fù)雜的樣品本底生化樣品, 溶液環(huán)境樣品食品不想作太多的固相萃取不想降低柱效新型的保護(hù)柱 Sentry GuardSentry Guard 的特點(diǎn)特點(diǎn)高質(zhì)量, 高效填料 - 不損失柱效增加分析柱效 - 增加適應(yīng)范圍20mm柱長 - 臟樣品載荷能力大，能延長保護(hù)柱壽命手可擰緊接頭，安裝時不需要工具通用柱套 - 適用于所有的HP

4、LC柱及內(nèi)徑)整體式（對Waters柱）- 使用方便，容易各種不同填料配合Waters柱Sentry Guard 的規(guī)格產(chǎn)品描述20mm柱長適應(yīng)任何色譜柱，不需工具即可安裝及更換可換柱芯式設(shè)計，提供各種填料:BondaPak: C18, phenyl, CN, NH2, SilicaNova-Pak: C18, C8, phenyl, CN, SilicaResolve: C18, C8, SilicaDelta-Pak: C18, C4Symmetry:C18, C8色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、

5、正庚烷100200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、鹽 合適的存放溶劑避免色譜柱床的干枯避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放的溫度色譜柱常見毛病柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低柱壓過高 為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機(jī)械震動造成固定相產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干枯

6、重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強(qiáng)或流動相過弱非特異性吸附色譜柱以外的因素（一）“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！儀器問題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大色譜柱與儀器的聯(lián)接除HP外，不同公司產(chǎn)品，其接頭不同。處理不當(dāng)時，會造成：色譜峰展寬（死體積）使柱效下降、或滲漏解決辦法：自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從Phase Separ

7、ations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭，可用在所有類型的色譜柱上的。Waters色譜柱的聯(lián)接Waters及Phase Separations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出不銹鋼管長度不同，其長度被稱為：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各種品牌的色譜柱用的是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth的長度為英寸Spherisorb品牌的色譜柱及Phase Separations公司其他品牌色譜柱用的是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其 stop-depth 為英寸不同的Stop-Depth長度色譜柱以外的因素（二）柱壓過高問題，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)

8、反壓問題阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯誤?色譜柱以外的因素（三）實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差梯度實(shí)驗(yàn)時平衡時間不足溫度波動流動相組成改變樣品溶劑不同樣品穩(wěn)定性不好方法的開發(fā)不好緩沖液的pH值不合適緩沖液的緩沖能力不足簡單的判別方法高的柱反壓是否伴隨著保留時間變化? 峰形變壞? 分辨率變壞? 測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬典型的分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于 100 微升如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng)測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬卸下色譜柱，用UNION代替之按測柱效方法，以1/10的樣品濃度進(jìn)樣，大約25微升用5 sigma方法測4.4%峰高處的峰寬：W儀器參數(shù)流速1.0 ml/min紙速

9、20 cm/min (用記錄儀時，接檢測器10mV檔)檢測器靈敏度0.5-1.0AUFS (用記錄儀時)檢測器時間常數(shù)小于譜帶展寬（ml）=1000W（cm）/20（記錄儀）=1000W（min） （工作站）流動相及樣品的預(yù)處理液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）液相色譜對流動相的要求除色譜柱對流動相對的要求外，還有與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動相脫氣的方法加熱簡

10、單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù)樣品的預(yù)處理重要性占樣品分析時間的比例樣品預(yù)處理所用時間遠(yuǎn)大于色譜分離的時間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生

11、反應(yīng)液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak樣品處理小柱其他樣品預(yù)處理的過程去除微粒過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g超濾機(jī)理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，過氯酸鹽50% 硫酸銨10% TCA樣品衍生提高檢測的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測的靈敏度增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測器改變分離

12、的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子氨基酸分析樣品衍生氨基酸分析AccQ-Tag 衍生法濃縮樣品濃縮樣品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色譜法 液固抽提/Sep-Pak小柱固相萃?。⊿PE）技術(shù)固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性實(shí)驗(yàn)室中6080%的成本及工作量在樣品制備上加速樣品的制備時間降低樣品前處理的成本提高分析的準(zhǔn)確性及回收率更容易自動化減少樣品處理步驟降低對不穩(wěn)定樣品的影響提高安全性Waters的Sep-Pak小柱Waters專門開發(fā)了固相萃取技術(shù)（SPE）Sep-Pak小柱

13、的應(yīng)用領(lǐng)域除去雜質(zhì)及干擾組份把樣品分成不同極性的組分析富集微量的組份Sep-Pak小柱的主要種類反相正相離子交換Sep-Pak的種類根據(jù)Sep-Pak及樣品的性質(zhì)，選洗脫強(qiáng)度不同的溶劑把樣品分開讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用 讓所感興趣的樣品通過小柱，雜質(zhì)留在柱上 讓雜質(zhì)留在柱上，所感興趣的樣品通過小柱各種Sep-Pek小柱（一）正相包括Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina可先用6到10倍柱體積的非極性（通常是樣品溶液）平衡加入樣品用非極性溶劑洗脫不想要的組份用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更強(qiáng)的溶劑洗脫剩下的

14、感興趣的組份在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如NH2 / CN確認(rèn)回收率各種Sep-Pek小柱（二）反相包括C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CN可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了樣品溶解在強(qiáng)一些極性的溶劑中加入樣品用強(qiáng)極性溶劑洗脫不想要的組份用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份確認(rèn)回收率各種Sep-Pek小柱(三)離子交換包括Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液

15、平衡，樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中加入樣品用弱緩沖液洗脫不想要的組份用強(qiáng)一些緩沖液（改變pH或離子強(qiáng)度）洗脫第一組感興趣的組份用更強(qiáng)的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份確認(rèn)回收率Sep-Pak小柱的方法開發(fā)SPE方法開發(fā)的幾個關(guān)鍵因素文獻(xiàn)查閱Waters有專門Sep-Pak應(yīng)用資料的數(shù)據(jù)庫（P/N = 88286）查閱Waters的網(wǎng)頁（）流速控制同色譜理論：以10ml/min潤濕小柱，15ml/min加載樣品離子交換填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加載樣品以15ml/min流速洗脫樣品注意樣品本底的不同注意載荷量及加樣方式用Sep-Pak C18除去雜質(zhì)使極性的雜質(zhì)先流出中等極性樣品流出，保留并分析小柱及其非極性雜質(zhì)丟棄舉例：多肽混合物脫鹽小柱先要用甲醇活化，然后用水平衡。把樣品載入小柱鹽等極性物先流出。用更強(qiáng)(極性更弱)的流動相洗出極性較弱的多肽