百日咳菌苗原液免疫力試驗方法

1、百日咳菌苗原液免疫力試驗方法1免疫1.1動物選用體重1012g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。將動物隨機(jī)分為三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，為保證攻擊后有16只或20只小白鼠，可適當(dāng)多免疫幾只小白鼠），同時飼養(yǎng)健康小白鼠55只，備做對照用。1.2免疫原稀釋將百日咳原液用生理鹽水或pH7.30.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然后再稀釋7.5、37.5、187.5，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然后再稀釋成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。1.3免疫方法將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每只

2、小白鼠各腹腔注射0.5ml。2攻擊菌及攻擊菌液的制備2.1菌種小白鼠腦內(nèi)攻擊用58030（18323）菌株。2.2培養(yǎng)基可用包-姜氏培養(yǎng)基（含羊血20%30%）或其他適宜的培養(yǎng)基。2.3培養(yǎng)溫度及時間放3537培育，第一代不超過72小時，攻擊時菌種的培育時間為2024小時。原代菌種放28可保存2周。2.4攻擊菌液的制備將培育2024小時的菌苔經(jīng)肉眼檢查為純菌后，刮入生理鹽水或pH7.30.1緩沖生理鹽水，用滅菌脫脂棉過濾，測定濃度，然后用pH7.07.2水解酷素、蛋白胨水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬，作為試驗組的攻擊菌液，然后再連續(xù)稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個

3、菌，以上5個不同稀釋度的菌液，作為對照組的攻擊菌液。2.5工作起止時間自攻擊菌液制備（開始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超過2.5小時。2.6活菌計數(shù)在攻擊前后，可將0.03ml含8個菌的攻擊菌液，接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中，每個平皿0.2ml，每次不得少于2個平皿，其菌落形成單位約為濁度測定的1/4。3攻擊動物免疫后14天，每只小白鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml菌液（含8萬個菌），用0.25ml注射器，4號針頭。在試驗組攻擊后再進(jìn)行對照組毒力測定，對照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。4記錄結(jié)果動物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天，將試驗組動物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動物并記錄死亡數(shù)，最初3天死亡的動物不作統(tǒng)計，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動物按死亡計算。5結(jié)果計算5.1按Wilson-Worcester氏法計算參考菌苗及待檢菌苗的ED50SD%，每個ED50標(biāo)準(zhǔn)差的范圍一般應(yīng)為64%156%。5.2按Reed-Muench氏法計算對照組LD50，1個LD50的菌數(shù)應(yīng)不高于800個菌。5.3計算均質(zhì)性因子“”。5.4IU計算待檢原液每ml應(yīng)含IU=參考菌苗ED50/待檢原