結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化以及新診斷技術(shù)進(jìn)展

1、結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化以及新診斷技術(shù)進(jìn)展強(qiáng)化結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)化的必要性1、全球結(jié)核病控制的三大挑戰(zhàn)：耐藥結(jié)核病、HIV/艾滋病合并結(jié)核病、移民（流動(dòng)人口）2、我國(guó)結(jié)核病疫情依然嚴(yán)重3、目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的不足分類結(jié)核分枝桿菌屬原核生物界、厚壁菌門、裂植菌綱、放線菌目、分枝桿菌科的分枝桿菌屬，分枝桿菌屬種類甚多，目前已命名的有200多種，一般可分為緩慢生長(zhǎng)和快速生長(zhǎng)兩大類。結(jié)核分枝桿菌特點(diǎn)結(jié)核菌生長(zhǎng)緩慢，在一般培養(yǎng)基上分裂一代需要10-20小時(shí)細(xì)胞壁厚度為1035nm，較一般細(xì)菌的細(xì)胞壁厚，含有大量脂類，具有堅(jiān)韌性和疏水性?？顾嵝允欠种U菌的重要特征。結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查的重要作用細(xì)菌學(xué)

2、檢查是結(jié)核病最客觀、最科學(xué)和最重要診斷方法和流行病學(xué)研究工具。因此結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)仍然面臨著較多的問題。細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)存在的問題不易于標(biāo)準(zhǔn)化操作誤差較大（可達(dá)到30%） 1、個(gè)人操作誤差 2、標(biāo)本性狀 3、標(biāo)本來源對(duì)結(jié)果的理解差異可影響檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床治療的參考或指導(dǎo)意義。主要的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)1、痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)2、分枝桿菌分離培養(yǎng)技術(shù)3、分枝桿菌快速培養(yǎng)技術(shù)4、藥物敏感性實(shí)驗(yàn)技術(shù)5、分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的痰涂片抗酸染色、鏡檢技術(shù)標(biāo)本的收集，特別是痰標(biāo)本的采集、保存制片和染色過程的標(biāo)準(zhǔn)化讀片操作的熟練程度和標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)結(jié)果的理解痰標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)送膿樣、干酪樣或膿性粘液樣痰為合格標(biāo)本，

3、痰量應(yīng)為3-5毫升。難以獲得合格標(biāo)本時(shí)，也應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢查，但應(yīng)注明標(biāo)本性狀，以供分析結(jié)果時(shí)參考。容器上應(yīng)注明與檢驗(yàn)單一致的病人姓名、編號(hào)及日期。不能及時(shí)檢驗(yàn)的痰標(biāo)本應(yīng)置4C冰箱保存，如需轉(zhuǎn)運(yùn)，外送前要認(rèn)真核對(duì)檢驗(yàn)單與痰瓶上標(biāo)注，放在專用的轉(zhuǎn)運(yùn)箱內(nèi)運(yùn)送。標(biāo)本的采集 標(biāo)本留取方法痰標(biāo)本的留取應(yīng)在醫(yī)護(hù)人員的指導(dǎo)下進(jìn)行。醫(yī)護(hù)人員應(yīng)告知病人如何咳痰，合格的痰標(biāo)本是深呼吸后，由肺部深處咳出的分泌物，并說明唾液檢出的可能性很小。檢驗(yàn)人員檢查痰標(biāo)本的性狀，并在登記本和檢驗(yàn)報(bào)告單上注明（按干酪痰、血痰、黏液痰和唾液分類登記）。如何正確留痰 查痰對(duì)于結(jié)核病的診斷是非常重要的，通過痰檢可以知道您是否痰中帶菌。如果

4、痰中帶有結(jié)核菌說明您患有肺結(jié)核，具有傳染性，應(yīng)該及時(shí)遵醫(yī)囑治療。 送檢痰標(biāo)本的質(zhì)量直接影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。請(qǐng)您一定按照下列要求和方法留取合格的痰標(biāo)本。每個(gè)痰盒應(yīng)分別留取12口痰，請(qǐng)不要將1口痰分開放到2或3個(gè)痰盒中。正確的咳痰方法： 1、咳嗽前應(yīng)緩慢地深吸氣，吸氣后稍屏氣片刻。 2、軀干略向前傾，兩側(cè)手臂屈曲，平放在兩側(cè)胸壁下部，內(nèi)收并稍加力。 3、咳嗽時(shí)腹肌用力快速收縮，使腹壁內(nèi)陷。一次深吸氣，可連續(xù)咳嗽三聲。 4、停止咳嗽后，收縮腹肌將剩余的氣體盡量呼盡。 5、重復(fù)緩慢吸氣動(dòng)作或平靜呼吸片刻，準(zhǔn)備再次咳嗽的動(dòng)作。* 注意：部分人如果忽然深吸氣容易誘發(fā)咳嗽，您可以嘗試緩慢或分幾次吸氣，爭(zhēng)取

5、肺泡內(nèi)充分充氣，以增加咳嗽的效率。在這一過程中，要注意動(dòng)作的連貫性，一氣呵成。同時(shí)，也可以叩擊前胸，或由家屬協(xié)助叩擊后背胸壁。這樣震動(dòng)支氣管內(nèi)的分泌物，能夠增加咳嗽排痰的力度。直接痰涂片檢查法 萋爾-尼爾遜氏（ZiehlNeelsen）抗酸染色法 （熱染法）細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法操作流程涂痰膜自然干燥復(fù)紅加熱初染5分鐘自然干燥鏡檢流水沖洗美蘭復(fù)染30秒鹽酸酒精脫色流水沖洗流水沖洗載玻片（一）新載玻片必須經(jīng)95%乙醇脫脂，檢查無劃痕后 方可使用。（二）一張載玻片只能涂抹1份痰標(biāo)本。（三）載玻片只允許一次性使用，嚴(yán)禁清洗后重復(fù)用于AFB檢查。（四）載玻片正面一側(cè)1/3處標(biāo)注實(shí)驗(yàn)室序號(hào)(如使用的

6、載玻片一端無磨砂面，必須使用玻璃刻刀注明編號(hào)；如使用的載玻片一端有磨砂面，可使用2B鉛筆在磨砂面上直接書寫)。（五）載玻片正面另一側(cè)2/3中央處均勻涂抹成面積為1020 mm的卵圓形痰膜。 染色（一）嚴(yán)格按照操作規(guī)范完成染色程序。（二）染色后的痰膜應(yīng)呈均勻亮藍(lán)色，無紅色斑塊。（三）將染色后的玻片放置在報(bào)紙上，如果透過痰膜不能分辨報(bào)紙上的文字，則表明該玻片涂抹過厚，或染色過程有誤。（四）染色后的痰膜脫落部分應(yīng)小于整個(gè)涂抹面積的10%。 （一）為防止抗酸桿菌的交叉污染，嚴(yán)禁油鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。（二）仔細(xì)觀察300以上的視野。（三）每個(gè)工作日，一名鏡檢人員的玻片閱讀量一般不應(yīng)超過25張。（四

7、）連續(xù)閱讀1012張玻片后，應(yīng)休息20分鐘左右。鏡檢讀片痰涂片抗酸菌濃度與陽(yáng)性結(jié)果機(jī)率 檢出菌數(shù) 每毫升標(biāo)本估算菌數(shù) 陽(yáng)性結(jié)果機(jī)率0/100或更多視野 1000 101-2/300視野 5000 - 10000 501-9/100視野 約30000 801-9/10視野 約50000 90（cv）1-9/每視野 約（cv）10或更多/每視野 約（cv）查痰次數(shù)與陽(yáng)性機(jī)率關(guān)系為什么診斷前強(qiáng)調(diào)三涂?jī)膳啵?S 2C） 1 2 3 4 5細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法顯微鏡檢報(bào)告方式：0條/300視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陰性1-8條/300視野：實(shí)報(bào)菌數(shù)3-9條/100視野：萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（+）1-

8、9條/10視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（2+）1-9條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（3+）10條/1視野： 萋-尼氏抗酸桿菌陽(yáng)性（4+）細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法注意事項(xiàng)：選擇痰標(biāo)本中膿性、血樣、干酪樣的部分涂片陽(yáng)性率較高；一張玻片只涂一份標(biāo)本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打開痰盒、涂抹痰膜時(shí)容易產(chǎn)生氣溶膠，應(yīng)注意正確操作和自身防護(hù)；石炭酸復(fù)紅初染時(shí)必須加溫。細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法優(yōu)點(diǎn)：是直接發(fā)現(xiàn)原菌的檢查方法，適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標(biāo)本，有重要的臨床診斷價(jià)值。是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的重要途徑，是考核和評(píng)價(jià)療效的重要指標(biāo)，有重要的流行病學(xué)意義；操作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉，適于各級(jí)

9、實(shí)驗(yàn)室開展；快速，數(shù)小時(shí)可報(bào)告結(jié)果。細(xì)菌學(xué)常規(guī)檢查 直接涂片法缺點(diǎn)：敏感性低：通常每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽(yáng)性結(jié)果；特異性較低：只能報(bào)告“抗酸菌陽(yáng)性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng) 室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)本收集、染色液制備、涂片染色程序、顯微鏡鏡檢、顯微鏡的保養(yǎng)和維護(hù)、結(jié)果的報(bào)告和登記、痰片的分類保存等應(yīng)按照國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格進(jìn)行操作。復(fù)查方式：自查：試驗(yàn)員當(dāng)日對(duì)已查涂片抽樣復(fù)查?；ゲ椋河杀緦?shí)驗(yàn)室其他試驗(yàn)員抽查當(dāng)日10%涂片。涂片鏡檢質(zhì)量保證系統(tǒng)室間質(zhì)控以現(xiàn)場(chǎng)和非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)為主要方式。現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室人員赴被

10、質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室就實(shí)驗(yàn)室布局、安全防護(hù)、污染物處理、涂片染色操作、顯微鏡維護(hù)狀況、日常實(shí)驗(yàn)記錄等進(jìn)行考核和指導(dǎo)，并以盲法、按比例抽取涂片復(fù)查。非現(xiàn)場(chǎng)督導(dǎo)：防治人員依據(jù)盲法、按比例的原則抽取涂片交實(shí)驗(yàn)室復(fù)查。復(fù)檢玻片樣本量1.樣本量估算：盲法復(fù)檢的關(guān)鍵是復(fù)檢結(jié)果能否真正代表被督導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際水平。世界衛(wèi)生組織推薦80%靈敏度、100%特異性（針對(duì)陰性玻片）、誤差為0的可接受數(shù)量以及95%可信限樣本量表，可以極大地減少樣本量，保證了盲法復(fù)檢在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上可以代表被評(píng)估實(shí)驗(yàn)室的總體水平。復(fù)檢樣本量計(jì)算表上一年陰性玻片的總數(shù) 玻片陽(yáng)性率2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0%3001

11、85 129 101 80 67 59 50 400217 143 108 86 70 61 51 500243 154 114 89 71 62 52 700281 167 121 92 75 65 54 1000318 180 128 96 76 66 55 2000376 197 135 100 79 68 56 5000423 208 141 103 80 69 57 10000441 213 142 104 80 69 5720000450 215 143 104 82 69 57復(fù)檢樣本量計(jì)算表說明： a、玻片陽(yáng)性率：指所有檢測(cè)的玻片中陽(yáng)性玻片的比例（平均陽(yáng)性率）。b、上一年陰性玻

12、片總數(shù)：每年玻片的總數(shù)減去全年陽(yáng)性玻片數(shù)。c、抽樣時(shí)，當(dāng)上一年陰性玻片數(shù)量和玻片陽(yáng)性率不在選擇點(diǎn)，陰性玻片數(shù)值采用區(qū)間上限，玻片陽(yáng)性率采用區(qū)間下限。復(fù)檢結(jié)果評(píng)價(jià)盲法復(fù)檢的目的不是為了驗(yàn)證某個(gè)病人診斷正確與否,而是評(píng)價(jià)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室操作水平。評(píng)價(jià)的內(nèi)容除了玻片鏡檢結(jié)果存在的誤差之外，還包括檢查標(biāo)本的質(zhì)量（合格標(biāo)本與不合格標(biāo)本的比例）、涂抹的大小和厚度、染色質(zhì)量如何等,以便采取糾正措施，提高實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量。1.誤差分類：分為定性誤差和定量誤差（1）定性誤差包括高假陽(yáng)性和高假陰性高假陽(yáng)性（High False Positive HFP）：陰性片被錯(cuò)誤地判讀為2以上的陽(yáng)性。高假陰性（High False

13、 Negative HFN）：2以上的陽(yáng)性玻片被錯(cuò)誤地判讀為陰性。（2）定量誤差包括量化誤差、低假陽(yáng)性和低假陰性量化誤差（Quantification Error ，QE）：同一張陽(yáng)性玻片初檢者和復(fù)檢者陽(yáng)性判斷級(jí)別的差異。低假陽(yáng)性（Low False Positive ，LFP）：陰性玻片被錯(cuò)誤地判斷為1及以下的陽(yáng)性。低假陰性（Low False Negative， LFN）：1及以下玻片被錯(cuò)誤地判斷為陰性。常見“誤差”原因誤差類型 可能原因 建議 假陽(yáng)性（FP） 1)例如染料沉渣或結(jié)晶等被誤識(shí)為抗酸桿菌2)原始報(bào)告后著色的抗酸桿菌退色1）對(duì)技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)。2）對(duì)假陽(yáng)性玻片重新染色并復(fù)檢。 假陰

14、性（FN） 1）觀察玻片的視野數(shù)量不足2）鏡檢技術(shù)能力差3）染色操作不規(guī)范（抗酸桿菌顏色暗淡、背景對(duì)比不足或過高）4）顯微鏡存在問題5）染液質(zhì)量差 1、2、3）對(duì)技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場(chǎng)檢查顯微鏡工作狀態(tài)5）重新購(gòu)置質(zhì)量合格的染料并重新配制染液 量化誤差（QE） 1）觀察玻片視野數(shù)量不足2）陽(yáng)性玻片的分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)掌握差3）鏡檢技術(shù)能力差4）顯微鏡存在問題 1.2.3）對(duì)技術(shù)人員復(fù)訓(xùn)4）現(xiàn)場(chǎng)檢查顯微鏡工作狀態(tài) 實(shí)驗(yàn)室診斷的新進(jìn)展1、擴(kuò)大開展液體培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)2、引入現(xiàn)代分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)3、引入現(xiàn)代免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)1、現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)主要技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè) ( Lo

15、op mediated isothermal amplification， LAMP)分子線性探針（Hain 技術(shù)） (2008WHO推薦)基因芯片技術(shù)GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術(shù)（）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） PCR誕生于1985年，由美國(guó) Muliis等發(fā)明。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制原理而設(shè)計(jì)的體外DNA或核糖核酸（RNA）擴(kuò)增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，經(jīng)過n個(gè)周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子，使DNA特定區(qū)段大量擴(kuò)增。此檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速，但也存在假陰性、假陽(yáng)性、污染等方面的問題，研究人員對(duì)其進(jìn)行

16、了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反應(yīng)體系加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)，在靶擴(kuò)增的同時(shí)可獲得定量的結(jié)果.即在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)完成擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè),從而省去了靶擴(kuò)增后復(fù)雜的定量檢測(cè)工作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于其擴(kuò)增產(chǎn)物的自動(dòng)和實(shí)時(shí)檢測(cè),減少了常規(guī)產(chǎn)物檢測(cè)步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時(shí)工作效率大大提高。研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通有所提高。與Southern雜交和酶促

17、化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。（）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè) ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP)檢測(cè)是連續(xù)等溫進(jìn)行的。擴(kuò)增效率十分高，反應(yīng)靈敏。采用4條引物，識(shí)別6個(gè)位點(diǎn)，特異性強(qiáng)。不需要特殊的試劑與儀器，總費(fèi)用很低。反應(yīng)不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測(cè)。利用Bst酶的鏈置換功能進(jìn)行反應(yīng)。加入反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成的一步法檢測(cè)。Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE)LAMP 方法PURE 方法等溫反應(yīng)高擴(kuò)增效率高特異性實(shí)驗(yàn)周期短(幾乎一個(gè)小時(shí))簡(jiǎn)單去除核酸擴(kuò)增抑

18、制因子縮短處理時(shí)間Pre-treatment kitLAMP testSampleLysisMixtureFilterDNALAMP 檢測(cè)陰性陽(yáng)性不需要離心, 等溫, 快速 (整個(gè)過程只需一個(gè)小時(shí))；DNA與SYBR Green結(jié)合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個(gè)小時(shí)內(nèi)可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500-100拷貝/毫升）的DNA 或RNA擴(kuò)增到10微克左右。 LAMP 敏感度101001000NCcopies/reaction模板: 純化的 TB 基因組DNA反應(yīng)條件: 67, 40minLAMP結(jié)果分析儀器特點(diǎn)：檢測(cè)專用，每隔6秒測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的濁度2.可以設(shè)定相應(yīng)的反應(yīng)

19、條件與檢測(cè)要求3.測(cè)定結(jié)果可直接輸入電腦進(jìn)行實(shí)時(shí)分析 4.檢測(cè)結(jié)果（圖像等）可以打印5.可同時(shí)檢測(cè)32個(gè)樣本，聯(lián)管適用（）、分子線性探針（Hain 技術(shù)） 原理：基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)方法。擴(kuò)增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應(yīng)判斷結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復(fù)合群、快速檢測(cè)RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性 GenoType 分支桿菌試劑盒系列GenoType MTBC （來自于培養(yǎng)標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種間的鑒定）GenoType Mycobacteria Direct（來自于病人標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定）GenoT

20、ype Mycobacterium CM（來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType Mycobacterium AS（來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定）GenoType MTBDRplus （結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測(cè)）GenoType MTBDRsl （結(jié)核分枝桿菌乙胺丁醇、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性檢測(cè)）技術(shù)設(shè)備TwinCubator 手工雜交儀自動(dòng)操作-全自動(dòng)雜交儀GT-Blot48 或 GT-Blot 20GenoType MTBDRplus結(jié)果MTBC及其對(duì)利福平和/或異煙肼的耐藥性 適用于培養(yǎng)物和痰液。 檢測(cè)快速，對(duì)于直接采集的樣本或

21、陽(yáng)性培養(yǎng)物在數(shù)小時(shí)后內(nèi)即可完成檢測(cè)； 檢測(cè)INH單耐藥型TB、MDR和XDR； 符合WHO推薦的線性探針分析標(biāo)準(zhǔn)。GenoType MTBDRplus/sl 優(yōu)點(diǎn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)產(chǎn)品目的材料靶點(diǎn)敏感性 專屬性 對(duì)照方法 *GenoType Mycobacterium CM普通分支桿菌的鑒定陽(yáng)性的固體/液體培養(yǎng)物DNA97 %93,5 %測(cè)序；生化技術(shù)GenoType Mycobacterium AS其他菌種的鑒定陽(yáng)性的固體/液體培養(yǎng)物DNA96 %94 %測(cè)序；生化技術(shù)GenoType MTBC結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的菌種區(qū)分陽(yáng)性的固體/液體培養(yǎng)物DNA100 %100 % 生化技術(shù)；分子遺傳學(xué)方法Gen

22、oType MTBDRplus結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對(duì)利福平和/或異煙肼的耐藥性直接采集的標(biāo)本（顯微鏡檢查陽(yáng)性，經(jīng)過純化）；陽(yáng)性的固體/液體培養(yǎng)物DNA直接采集的標(biāo)本RMP: 96,8 %INH: 90,2 %固體/液體培養(yǎng)物RMP: 98,7 %INH: 92 %直接采集的標(biāo)本RMP: 95%INH: 100 %固體/液體培養(yǎng)物RMP: 100 %INH: 100 %傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn) (DST)GenoType MTBDRsl結(jié)核分支桿菌復(fù)合群的鑒定及其對(duì)氟喹諾酮類和/或氨基糖苷類/環(huán)肽和/或乙胺丁醇的耐藥性直接采集的標(biāo)本（顯微鏡檢查陽(yáng)性，經(jīng)過純化）；陽(yáng)性的固體/液體培養(yǎng)物DNA 直接采

23、集的標(biāo)本氧氟沙星： 88,9 %阿米卡星/卷曲霉素： 75 %乙胺丁醇： 38,5 %固體/液體培養(yǎng)物*氧氟沙星： 90,6 %阿米卡星/卷曲霉素： 84,8 %乙胺丁醇： 69,2 %直接采集的標(biāo)本氧氟沙星： 100 %阿米卡星/卷曲霉素： 100 %乙胺丁醇： 100 %固體/液體培養(yǎng)物氧氟沙星： 100 %阿米卡星/卷曲霉素： 100 %乙胺丁醇： 100 %傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn) (DST)GenoType Mycobacteria Direct結(jié)核分支桿菌復(fù)合群鳥分支桿菌M. avium、胞內(nèi)分支桿菌M. intracellulare、堪薩斯分支桿菌M. kansasii、瑪爾摩分支桿菌M.

24、 malmoense的鑒定經(jīng)純化后的直接采集的標(biāo)本RNA涂片陽(yáng)性樣本97,5% 涂片陰性樣本83,3 %涂片陽(yáng)性樣本99 %培養(yǎng)結(jié)論DNA-Strip技術(shù)系列涵蓋了分枝桿菌菌種鑒定、TB-復(fù)合群的區(qū)分和藥敏試驗(yàn)。所有檢測(cè)都采用通用試劑盒和相同的方案進(jìn)行擴(kuò)增和雜交。 所有檢測(cè)均可在4-5小時(shí)內(nèi)完成。本法適用于大樣本量的檢測(cè)（每天檢測(cè)數(shù)百份樣品）。（）、基因芯片技術(shù)科學(xué)的發(fā)展人類的進(jìn)步要求進(jìn)行大規(guī)?；蛐畔⒌慕馕?鑒于基因芯片的多種用途和其遠(yuǎn)大的發(fā)展前景，不少生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)和生物技術(shù)公司都先后參與了這項(xiàng)技術(shù)的研究。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)目前僅國(guó)內(nèi)就有十多家單位從事該技術(shù)的研究與開發(fā)工作，全世界估計(jì)至少有二

25、三十家。它已象半導(dǎo)體技術(shù)一樣成為一個(gè)重要的產(chǎn)業(yè)方向。當(dāng)前已正被廣泛地應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，包括生物醫(yī)學(xué)、臨床診斷學(xué)和基因組學(xué)研究。什么是基因芯片基因芯片指對(duì)數(shù)以千記的DNA片段同時(shí)進(jìn)行處理分析的技術(shù)，諸如基因組DNA突變譜和mRNA表達(dá)譜的檢測(cè)等（Trends in Biotechnology)。 該技術(shù)系指將大量探針分子固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息?；蛐酒夹g(shù)的主要特點(diǎn)技術(shù)操作簡(jiǎn)單 自動(dòng)化程高 序列數(shù)量大 檢測(cè)效率高 應(yīng)用范圍廣 成本相對(duì)低博奧 分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(DNA微陣列芯片法)主要分為樣品制備、芯片反應(yīng)和

26、結(jié)果判讀三部分。首先，將檢測(cè)菌的DNA從培養(yǎng)、分離純化的菌株或者直接從臨床樣品中提取出來；然后，對(duì)樣品中的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記；接著，將擴(kuò)增并熒光標(biāo)記的基因序列與芯片上的探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；最后芯片掃描成像，用配套軟件進(jìn)行判讀。芯片掃描結(jié)果 1 臨床驗(yàn)證（）GeneXpert MTB/RIF快速診斷技術(shù)Cepheid MTB/RIF: 可直接檢測(cè)痰液，檢測(cè)結(jié)核分支桿菌的同時(shí)，鑒定是否有利福平耐藥性， 2小時(shí)出結(jié)果。GeneXpert檢測(cè)平臺(tái)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)原理。所有檢測(cè)均無需提取核酸，手工操作時(shí)間不超過2分鐘。GeneXpert 最大程度簡(jiǎn)化TB檢測(cè)！將痰液加入處理瓶，放置15分鐘

27、；將處理后的樣品加入樣品反應(yīng)盒；將該盒子放置在GeneXpert中，輕松按下“開始”鍵；得到結(jié)果（2小時(shí)）：檢測(cè)是否含有結(jié)核分支桿菌的同時(shí)，可對(duì)利福平耐藥性進(jìn)行判讀。Xpert MTB/RIF檢測(cè)操作步驟1、痰液加入處理瓶， 放置15分鐘。2、取處理后的痰液 2mL加入Xpert反應(yīng) 試劑盒3、將反應(yīng)試劑盒放入 GeneXpert儀器， 點(diǎn)擊“開始”（手工操作至此結(jié)束?。?、自動(dòng)過濾洗滌樣品5、自動(dòng)超聲破碎，純化 樣品6、熒光定量PCR擴(kuò)增7、巢氏PCR擴(kuò)增8、自動(dòng)結(jié)果判讀 （MTB/RIF）“Sample in. Answer out.” 全自動(dòng)操作 完全封閉系統(tǒng) 污染可能性小 減少人為錯(cuò)誤

28、 結(jié)果精確度高 檢測(cè)時(shí)間短無需專業(yè)技術(shù)人員和特殊實(shí)驗(yàn)室研究人數(shù) 1,700 Patients 秘魯、南非、阿塞拜疆、印度 涂片陽(yáng)性樣品： 靈敏性98.2%,特異性99.2% 涂片陰性, 培養(yǎng)陽(yáng)性樣品： 三次檢測(cè)靈敏性 90.2% 一次檢測(cè)靈敏性72.5% 對(duì)利福平耐藥性檢測(cè)： 靈敏性97.6%,特異性98.1%結(jié)論GeneXpert檢測(cè)Mtb簡(jiǎn)單、易于操作，對(duì)操作者技術(shù)要求不高：只需要把痰液、反應(yīng)液加入儀器即可得出診斷報(bào)告；GeneXpert檢測(cè)Mtb快速：整個(gè)過程大約2小時(shí)。GeneXpert檢測(cè)Mtb對(duì)操作人員安全：整個(gè)檢測(cè)過程全封閉、一次性完成。高靈敏性：BCG176 cfu/ml；H5

29、7Rv112 cfu/ml耐藥性診斷：可對(duì)利福平耐藥性進(jìn)行檢測(cè)現(xiàn)代免疫學(xué)診斷技術(shù)1、體液免疫診斷技術(shù)：是利用結(jié)核分枝桿菌或其提取物抗原檢測(cè)結(jié)核病患者血清抗體的方法。目前，通過檢測(cè)抗結(jié)核桿菌的抗體(IgG)診斷結(jié)核病的商品化試劑盒已較多。采用的方法包括：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)和免疫金標(biāo)記技術(shù)的免疫層析法和膠體金標(biāo)記的滲濾法等，采用的抗原也各不相同。體液免疫學(xué)診斷技術(shù)的意義在國(guó)內(nèi)應(yīng)用較廣泛，是結(jié)核病的輔助診斷方法之一,尤其對(duì)肺外結(jié)核、菌陰肺結(jié)核的診斷具有應(yīng)用價(jià)值。不足之處：?jiǎn)为?dú)使用時(shí)，其檢測(cè)的特異性和靈敏度都有些缺點(diǎn)。目前國(guó)際上反對(duì)使用該項(xiàng)技術(shù)的呼聲在增加。原因主要是特異性問題。 2、細(xì)胞

30、免疫學(xué)診斷技術(shù)細(xì)胞免疫診斷技術(shù)應(yīng)用較少，過去主要應(yīng)用PPD皮試技術(shù)，近年來英國(guó)和澳大利亞研制了ELISpot 、T-Spot技術(shù)和 QFT-Gold 。此項(xiàng)技術(shù)用于感染情況的檢測(cè)是一項(xiàng)特異性較強(qiáng)、靈敏度較高很有希望的新技術(shù)。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISpot)技術(shù) 是檢測(cè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的一種實(shí)驗(yàn)方法，采用可定量的夾心ELISA方法，利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 & CFP-10刺激和激活免疫活性細(xì)胞使其產(chǎn)生IFN-，并檢測(cè)IFN-的濃度變化進(jìn)行診斷的方法。通過ELISpot酶聯(lián)斑點(diǎn)分析系統(tǒng)對(duì)加底物后形成的斑點(diǎn)分析后得出結(jié)果。ELISpot具有較高的特異性和敏感性。ELISPOT技術(shù)原理細(xì)胞免疫主要由T淋巴細(xì)胞發(fā)動(dòng)，T淋巴細(xì)胞分成效應(yīng)T淋巴細(xì)胞和記憶T淋巴細(xì)胞。記憶T淋巴細(xì)胞在首次感染病原體后長(zhǎng)期存在免疫系統(tǒng)中。當(dāng)再次受到感染刺激后。這些記憶T淋巴細(xì)胞發(fā)出信號(hào)分子并增殖成為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，如 干擾素(INF- )。所以無論是否有臨床癥狀，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞在血中的水平可作為機(jī)體是否被感染的指標(biāo)。ELISPOT在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用在MTB潛伏感染診斷中的應(yīng)用早期診斷MT