動物疫病監(jiān)測(診斷)基礎理論知識和方法原理

1、動物疫病監(jiān)測（診斷）基礎理動物疫病監(jiān)測（診斷）基礎理論知識和方法原理論知識和方法原理 臨床癥狀病理變化觸片染色鏡檢培養(yǎng)特性生化特性血清學試驗初步診斷初步診斷動物回歸試驗確診確診流行病學調查細菌感染的診斷病毒感染的診斷電鏡技術電鏡技術血清學試驗血清學試驗分子生物學技術分子生物學技術病毒的分離鑒定病毒的分離鑒定標本采集與送檢標本采集與送檢病毒的分離病毒的分離 動物接種動物接種 是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒是最原始的病毒培養(yǎng)方法，根據(jù)病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜部位，如嗜 神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）神經(jīng)性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內，痘病毒可接種

2、于可接種于小鼠腦內，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內。家兔角膜或皮內。 雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng) 雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵化化9-14天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，天的雞胚，根據(jù)病毒種類不同，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有羊膜腔、最常用的雞胚接種部位有羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。病毒的分離病毒的分離 組織培養(yǎng)法或細胞培養(yǎng)法組織培養(yǎng)法或細胞培養(yǎng)法 是將離體活組織塊或分散的組織細胞是將離體活組織塊或分散的組織細胞加以培養(yǎng)的技術總稱，為病毒分離鑒加以培養(yǎng)的技術總稱，為病毒分離鑒定中的

3、最常用的基本方法。定中的最常用的基本方法。病毒的分離病毒的分離形態(tài)學檢查形態(tài)學檢查電鏡和免疫電鏡檢查電鏡和免疫電鏡檢查 普通光學顯微鏡檢查普通光學顯微鏡檢查 有些病毒在宿主細胞內增殖后，在細胞 的一定部位(胞核、胞漿或兩者兼有)出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性的結構，即包涵體。包涵體對病毒感染的診斷有一定價值。 病毒感染的血清學診斷病毒感染的血清學診斷是用已知病毒抗原來檢測病畜血清中有無相應抗體，故須待病畜感染后體內產(chǎn)生抗體時才能檢出。在采取臨床標本及病人血清應注意病程，必須采取患畜急性期血清與恢復期血清 (雙份血清) 進行血清學試驗。若第二次血清抗體滴度比第一次高出4倍以上時，才

4、有診斷意義。n現(xiàn)代免疫的概念：現(xiàn)代免疫的概念：是機體識別是機體識別“自身自身”與與“非己非己”抗原，對抗原，對“非己非己”抗原產(chǎn)生排斥抗原產(chǎn)生排斥作用，對自身抗原形成天然耐受的一種生作用，對自身抗原形成天然耐受的一種生理功能。理功能。 免疫的定義免疫的定義免疫的基本特性免疫的基本特性1 識別自身和非自身識別自身和非自身 這是免疫應答的基礎這是免疫應答的基礎n免疫細胞膜表面的抗原受體免疫細胞膜表面的抗原受體+外來抗原的表位外來抗原的表位n識別很精細，包括異種之間，同種不同個體之間識別很精細，包括異種之間，同種不同個體之間2 特異性特異性n即免疫具有很強的針對性即免疫具有很強的針對性3 免疫記憶免

5、疫記憶n對相同抗原物質的再次進入具有記憶，會產(chǎn)生更對相同抗原物質的再次進入具有記憶，會產(chǎn)生更快、更強的免疫應答?？臁⒏鼜姷拿庖邞?。免疫的基本功能免疫的基本功能1. 抵抗感染抵抗感染n指動物機體抵御病原微生物感染和侵襲的能力。指動物機體抵御病原微生物感染和侵襲的能力。n免疫功能亢進免疫功能亢進 變態(tài)反應變態(tài)反應n免疫功能低下或缺陷免疫功能低下或缺陷 機會感染機會感染2. 自身穩(wěn)定自身穩(wěn)定n清除機體產(chǎn)生的大量衰老死亡細胞清除機體產(chǎn)生的大量衰老死亡細胞n功能異常功能異常 自身免疫病自身免疫病3. 免疫監(jiān)視免疫監(jiān)視n腫瘤細胞的發(fā)現(xiàn)和清除腫瘤細胞的發(fā)現(xiàn)和清除n功能低下或失調功能低下或失調 腫瘤發(fā)生腫瘤

6、發(fā)生免疫的類型免疫的類型一、固有免疫：一、固有免疫：概念：出生時即有的天然免疫，經(jīng)遺傳獲得，非特概念：出生時即有的天然免疫，經(jīng)遺傳獲得，非特 異性，也稱非特異性異性，也稱非特異性/先天性免疫。先天性免疫。組成：屏障結構、吞噬細胞、某些體液因子。組成：屏障結構、吞噬細胞、某些體液因子。二、適應性免疫：二、適應性免疫：概念：出生后接觸特定抗原獲得的針對該物質概念：出生后接觸特定抗原獲得的針對該物質 的免疫，也稱獲得性的免疫，也稱獲得性/特異性免疫。特異性免疫。包括：體液免疫、細胞免疫。包括：體液免疫、細胞免疫。抗原抗原n抗原抗原（Antigen，Ag）：是指進入動物機體后，）：是指進入動物機體后，

7、能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫球蛋白或致敏淋巴能刺激機體產(chǎn)生特異性免疫球蛋白或致敏淋巴細胞，并能與其發(fā)生特異性反應的物質，也就細胞，并能與其發(fā)生特異性反應的物質，也就是說具有是說具有抗原性抗原性的物質稱抗原。的物質稱抗原?？乖钥乖园▋蓚€方面：包括兩個方面：1.免疫原性免疫原性：能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細：能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞的特性。胞的特性。2.反應原性反應原性：能與由其所誘導產(chǎn)生的抗體或致敏：能與由其所誘導產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生反應的特性。淋巴細胞發(fā)生反應的特性。n免疫球蛋白：免疫球蛋白：是指具有抗體活性或是指具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白?；瘜W結構與抗體相似

8、的球蛋白。n抗體：抗體：當動物機體受到抗原物質刺當動物機體受到抗原物質刺激后，由激后，由B淋巴細胞轉化為漿細胞產(chǎn)淋巴細胞轉化為漿細胞產(chǎn)生的能與相應抗原發(fā)生特異性結合生的能與相應抗原發(fā)生特異性結合反應的免疫球蛋白。反應的免疫球蛋白?？箍?體體nIgGIgG多為單體，占血清免疫球蛋白總量的多為單體，占血清免疫球蛋白總量的75%75%80%80%nIgG1IgG1、IgG2IgG2和和IgG3IgG3的的CH2CH2能通過經(jīng)典途徑激能通過經(jīng)典途徑激活補體活補體nIgGIgG是唯一能通過胎盤的抗體是唯一能通過胎盤的抗體n通過通過FcFc段與吞噬細胞表面段與吞噬細胞表面FcRFcR結合，發(fā)揮調結合，發(fā)揮

9、調理作用；與理作用；與K K細胞結合，發(fā)揮細胞結合，發(fā)揮ADCCADCC作用；與作用；與葡萄球菌葡萄球菌A A蛋白結合。蛋白結合。n具有抗菌、抗毒和抗病毒作用具有抗菌、抗毒和抗病毒作用n參與參與IIII、IIIIII型超敏反應型超敏反應IgGn為五聚體，是分子量最大的為五聚體，是分子量最大的IgIg。nIgMIgM激活補體能力比激活補體能力比IgGIgG強。強。nIgMIgM是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，故檢測是抗原刺激后出現(xiàn)最早的抗體，故檢測IgMIgM水平可用于傳染病的早期診斷。水平可用于傳染病的早期診斷。nIgMIgM是是B B細胞抗原受體的主要成分。細胞抗原受體的主要成分。n也可參與也可

10、參與IIII、IIIIII型超敏反應。型超敏反應。IgMn分為血清型和分泌型兩種，血清型分為血清型和分泌型兩種，血清型IgAIgA主要由腸系主要由腸系膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生。而分泌型膜淋巴組織中的漿細胞產(chǎn)生。而分泌型IgA(SIgAIgA(SIgA) )是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等處的固有層中漿細胞產(chǎn)生。中漿細胞產(chǎn)生。n主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化主要存在于初乳、唾液、淚液，以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。n分泌型分泌型IgAIgA的合成和主要作用部位在黏膜。的合成和主要作用部位在黏

11、膜。IgAu血清IgD含量極低。u膜性 IgD存在于成熟B細胞表面，因此，它是成熟B細胞的主要標志。它也是B細胞抗原受體（BCR）。IgD n血清中含量最低的抗體。血清中含量最低的抗體。n能與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面能與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的的IgE-FcIgE-Fc受體結合，介導受體結合，介導型超敏型超敏反應。反應。n與抗寄生蟲感染有關。與抗寄生蟲感染有關。IgEn單克隆抗體單克隆抗體由一個由一個B B細胞分化增值的細胞分化增值的子代細胞（漿細胞）產(chǎn)生的針對單一抗原子代細胞（漿細胞）產(chǎn)生的針對單一抗原決定簇（表位）的抗體決定簇（表位）的抗體。 n多克隆抗體多克隆抗體采用傳統(tǒng)的免疫方法

12、，將采用傳統(tǒng)的免疫方法，將抗原物質經(jīng)過不同途徑注入動物體內，經(jīng)抗原物質經(jīng)過不同途徑注入動物體內，經(jīng)數(shù)次免疫后采血所獲得的抗血清即為多克數(shù)次免疫后采血所獲得的抗血清即為多克隆抗體。隆抗體。人工制備抗體人工制備抗體免疫學試驗技術免疫學試驗技術 血清學試驗的類型血清學試驗的類型1. 特異性與交叉反應性特異性與交叉反應性 2. 可逆性：表面的結合，有可逆性可逆性：表面的結合，有可逆性 3. 適比性：比例合適，反應才可見適比性：比例合適，反應才可見4. 階段性：不可見階段性：不可見 可見反應可見反應 5. 條件依賴性：條件依賴性：pH，溫度，電解質，溫度，電解質p抗原抗體結合除了空間結構互補外，主抗原抗

13、體結合除了空間結構互補外，主要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水要以氫鍵、靜電引力、范德華力和疏水鍵等非共價結合。鍵等非共價結合。Ag+Ag+血清血清(Ab(Ab) ) Ag-AbAg-Ab復合物復合物pH 7.0 T 37pH 7.0 T 37pHpH3 T3 T6060n Ag和Ab結合需要適當?shù)谋壤?，Ag或Ab過多過少，都不能形成大的Ag-Ab復合物。Ab 過剩Ag 過剩比例適當，交聯(lián)成網(wǎng)絡網(wǎng)格學說網(wǎng)格學說適合比例性適合比例性r電解質：電解質：稀釋抗原、血清常用生理鹽水，但稀釋禽類血清時常用810%高滲鹽水。r酸堿度：酸堿度：稀釋抗原、血清的溶液pH6.08.0均可以，為了穩(wěn)定pH，在抗原

14、抗體反應中最好用pH7.07.2的磷酸緩沖液作抗原抗體稀釋液。r溫度：溫度：通常為37，適當提高反應溫度可增加Ag與Ab分子的碰撞機會，加速反應的出現(xiàn)凝集試驗定義：定義：細菌、紅細胞等顆粒性抗原，或吸附在膠乳、白陶土和紅細胞的抗原，與相立抗體結合，在有適當電解質存在下，經(jīng)過一定時間，形成肉眼可見的凝集團塊，稱為凝集試驗。凝集反應中的抗原稱為，抗體稱為。分類：分類：凝集試驗可根據(jù)抗原的性質、反應的方式分為直接凝集試驗 (簡稱凝集試驗)和間接凝集試驗。一、直接凝集試驗細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖?，在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現(xiàn)凝集。直接凝集試驗分為：玻板凝集試驗和試管凝集試驗。 玻板

15、凝集試驗y為一種試驗方法： 將含有已知抗體的診斷血清 (適當稀釋)與待檢菌懸液各一滴在玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽性反應。此法簡便、快速，常用于菌種鑒定或ABO血型鑒定。 也可用已知的診斷抗原懸液，檢測待檢血清中是否存在相應抗體，如布氏桿菌的玻板凝集反應和雞白痢全血平板凝集試驗。、試管凝集試驗y為一種試驗方法： 常用已知抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合，保溫后觀察每管內抗原凝集程度。以產(chǎn)生50%凝集的最高稀釋度作為血清中抗體的效價（亦稱為凝集價或滴度）。 二、間接凝集試驗n將可溶性抗原 (或抗體)先吸附于一種與免疫無關的、一定大小的不溶性顆粒 (統(tǒng)稱為載體顆粒)的表面，

16、然后與相應抗體 (或抗原)作用，在有電解質存在的適宜條件下，所出現(xiàn)的特異性凝集反應稱為間接凝集反應。根據(jù)所用載體分：根據(jù)所用載體分：. 乳膠凝集試驗 . 炭素凝集試驗 . 間接血凝試驗根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應的方式分：根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應的方式分：正向間接凝集反應反向間接凝集反應間接凝集抑制反應協(xié)同凝集反應正向間接凝集反應正向間接凝集反應用抗原致敏載體以檢測標本中的相應抗體可溶性抗原載體顆?？贵w（凝集素）反向間接凝集反應反向間接凝集反應用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應抗原?？贵w可溶性抗原載體顆粒間接凝集抑制反應間接凝集抑制反應診斷試劑為抗原致敏的顆粒載

17、體及相應的抗體，用于檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。也可用抗體致敏的載體及相應的抗原作為診斷試劑，以檢測標本中的抗體，此稱反向間接凝集抑制反應。協(xié)同凝集反應協(xié)同凝集反應與間接凝集反應的原理相似，只是所用載體既非天然的紅細胞，也非人工合成的聚合物顆粒，而是一種金黃色葡萄球菌。 它的菌體細胞壁中含有它的菌體細胞壁中含有A A蛋白蛋白(SPA)(SPA) SPASPA具有與具有與IgGIgG的的FcFc段結合的特性段結合的特性因此當這種葡萄球菌與IgG抗體連接時，就成為抗體致敏的顆粒載體；如與相應抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接凝集反應。適用于細菌和病毒等的直接檢測。許多病毒表面具血凝素，具有凝許多

18、病毒表面具血凝素，具有凝集某些動物或人紅細胞的特性，稱為血凝現(xiàn)集某些動物或人紅細胞的特性，稱為血凝現(xiàn)象，可用于鑒定病毒。血凝現(xiàn)象可以被特異象，可用于鑒定病毒。血凝現(xiàn)象可以被特異性抗體所抑制，稱為血凝抑制現(xiàn)象，利用這性抗體所抑制，稱為血凝抑制現(xiàn)象，利用這種特性可進行血清學試驗，稱為血凝抑制試種特性可進行血清學試驗，稱為血凝抑制試驗。驗。病毒的血凝與血凝抑制試驗病毒的血凝與血凝抑制試驗病毒病毒 + 雞雞RBC = 凝集（血凝試驗）凝集（血凝試驗）病毒病毒 + 特異性抗體特異性抗體 +雞雞RBC = 不凝集（血凝抑制試驗）不凝集（血凝抑制試驗）沉淀試驗定義：定義：可溶性抗原 (如細菌的外毒素、內毒素

19、、病毒的可溶性抗原、血清、組織浸出液等)與相應抗體結合，在適量電解質存在下，形成肉眼可見的白色沉淀，稱為沉淀試驗 。參與沉淀試驗的抗原稱，抗體稱為。分類：分類：沉淀反應可在液體中進行，也可在半固體瓊脂凝膠中進行。液相內沉淀反應液相內沉淀反應絮狀沉淀反應絮狀沉淀反應環(huán)狀沉淀反應環(huán)狀沉淀反應+抗血清抗血清抗原抗原+抗原抗原抗體抗體凝膠內沉淀反應凝膠內沉淀反應免疫擴散技術免疫擴散技術免疫電泳技術免疫電泳技術單向擴散試驗單向擴散試驗雙向擴散試驗雙向擴散試驗火箭電泳火箭電泳對流電泳對流電泳免疫電泳免疫電泳瓊擴試驗(Agar gel precipitation test, AGP)瓊脂凝膠呈多孔結構，孔內

20、充滿水分，l%瓊脂凝膠的孔徑約為85nm，因此可允許各種抗原抗體在瓊脂凝膠中自由擴散。 Ag和Ab在瓊脂凝膠中相遇，在最適比例處結合成Ag-Ab復合物，此復合物因顆粒較大而不能擴散，故形成沉淀帶。中和試驗(病毒、毒素中和試驗)原理：原理：病毒與抗血清中抗體特異結合后失去感染易感 動物、易感雞胚或鴨胚、易感細胞的活性。用途：用途：.用已知血清檢測病毒鑒定病毒，診斷病毒病。.用已知病毒檢測血清抗體診斷病毒感染，測定病毒免疫血清效價（中和價）。補體結合試驗1. 定義：定義：有補體參與，以綿羊紅細胞和溶血素作指示系統(tǒng)的抗原抗體反應。2. 組成：組成：有2個系統(tǒng)共5種成分 1) 檢測系統(tǒng)：檢測系統(tǒng)：包括

21、已知抗原(或抗體)和待測抗體(或抗原) 2) 指示系統(tǒng)：指示系統(tǒng)：包括綿羊紅細胞和溶血素(綿羊紅細胞的特異性抗體) 3) 補體：補體：取自豚鼠的新鮮血清3. 補體結合反應的基本原理補體結合反應的基本原理 1) 補體可與任何抗原抗體復合物相結合； 2) 指示系統(tǒng)遇補體后就出現(xiàn)明顯的溶血反應。AgAb紅細胞紅細胞溶血素溶血素補體補體AbAg紅細胞紅細胞補體補體溶血素溶血素溶血溶血 （-）不溶血不溶血 （+）補體結合反應補體結合反應 標記免疫技術標記免疫技術 免疫酶技術 免疫熒光技術 放射免疫測定 免疫膠體金技術 化學發(fā)光免疫測定二、按標記物分類：二、按標記物分類：一、按測定用途分類：一、按測定用途

22、分類：免疫組化技術：用于組織切片或其他標本中Ag或Ab的定位。免疫測定技術：用于液體標本中Ag或Ab的測定。免疫酶技術免疫酶技術將酶分子與將酶分子與AbAb或或AgAg分子連接分子連接形成穩(wěn)定的結合物形成穩(wěn)定的結合物（酶標抗體酶標抗體或或酶標抗原酶標抗原）不影響：不影響： Ab Ab或或AgAg的免疫活性的免疫活性 酶的活性酶的活性1.1. Ag-Ab Ag-Ab反應的特異性和敏感性反應的特異性和敏感性2.2. 酶促反應的高效催化性和敏感性酶促反應的高效催化性和敏感性 原理原理常用的酶與底物常用酶常用酶常用底物常用底物反應顏色反應顏色辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶(HRP)(HRP)H H2 2

23、O O2 2不溶性供氫體：不溶性供氫體：3,33,3二氨基聯(lián)苯胺二氨基聯(lián)苯胺（DABDAB）黃褐色黃褐色可溶性供氫體：可溶性供氫體：鄰苯二胺（鄰苯二胺（OPDOPD）橙黃色橙黃色堿性磷酸酶堿性磷酸酶(AP)(AP)硝基苯磷酸鹽（硝基苯磷酸鹽（p-NPPp-NPP）黃色黃色葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶與與HRPHRP類似類似棕色棕色DH2+H2O2 D+2H20HRP酶聯(lián)免疫吸附測定一、基本原理一、基本原理、使、使Ag或或Ab吸附吸附到固相載體表面，并保持其免疫活性。到固相載體表面，并保持其免疫活性。、使、使Ag或或Ab與某種酶連接成與某種酶連接成酶標酶標Ag或或Ab，酶標，酶標Ag或或Ab既保既保

24、 留其免疫活性，又保留酶的活性。留其免疫活性，又保留酶的活性。、測定時，把受檢標本、測定時，把受檢標本(測定其中的測定其中的Ab或或Ag)和酶標和酶標Ag(或或Ab)按不同的步驟與固相載體表面的按不同的步驟與固相載體表面的Ab (或或Ag)起反應。起反應。、通過、通過洗滌洗滌將固相載體上未結合的將固相載體上未結合的Ag或或Ab去除，最后結合在去除，最后結合在 固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。、加入、加入酶反應酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)榈牡孜锖?，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物有色產(chǎn)物。 產(chǎn)物的量與標本中受檢物質的量直接相關。產(chǎn)物

25、的量與標本中受檢物質的量直接相關。 可根據(jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析?？筛鶕?jù)顏色反應的深淺進行定性或定量分析。二、二、ELISAELISA方法的基本類型方法的基本類型雙抗體（原）夾心法：檢測抗原（體）的常見雙抗體（原）夾心法：檢測抗原（體）的常見方法方法間接法：檢測抗體的方法間接法：檢測抗體的方法競爭法：檢測抗原或小分子半抗原、抗體競爭法：檢測抗原或小分子半抗原、抗體根據(jù)檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法根據(jù)檢測目的和操作步驟不同有三種基本方法間接間接ELISAELISA n用于測定抗體。用抗原包被固相載體，然后加入待檢血清樣品，經(jīng)孵育一定時間后，若待檢血清中含有特異性的抗體，即與固相

26、載體表面的抗原結合形成抗原抗體復合物。洗滌除去其他成分，再加上酶標記的抗抗體，反應后洗滌，加入底物，在酶的催化作用下底物發(fā)生反應，產(chǎn)生有色物質。樣品中含抗體越多，出現(xiàn)顏色越快越深。獲得待分析物的未標定抗體獲得待分析物的未標定抗體將特異性抗體與固相將特異性抗體與固相載體連接形成固相抗體載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結合的洗滌除去未結合的抗體及雜質抗體及雜質 加入封閉蛋白溶液以封閉載體加入封閉蛋白溶液以封閉載體表面殘留的蛋白結合位點表面殘留的蛋白結合位點洗滌并除去未結合的封閉蛋白洗滌并除去未結合的封閉蛋白加受檢標本（抗原）形成加受檢標本（抗原）形成固相抗體抗原復合物固相抗體抗原復合物 洗滌除去其

27、他洗滌除去其他未結合的物質未結合的物質 加酶標抗體生成加酶標抗體生成抗體抗體待測抗原待測抗原酶標記抗體酶標記抗體的復合物的復合物 徹底洗滌徹底洗滌未結合的未結合的 酶標抗體酶標抗體 加底物進行加底物進行酶催化反應酶催化反應 根據(jù)顏色反應的根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原程度進行該抗原的定性或定量測定的定性或定量測定雙抗體夾心法雙抗體夾心法用已知特異性用已知特異性抗體包被抗體包被固相載體固相載體 測定管加待測抗原和測定管加待測抗原和一定量的酶標抗原使二者與一定量的酶標抗原使二者與固相抗體競爭結合固相抗體競爭結合 對照管只加一定量酶標抗原對照管只加一定量酶標抗原與固相抗體直接結合與固相抗體直接結合 分別洗滌分別洗滌除去未結合除去未結合的成分的成分 加底物顯色加底物顯色分別測定兩管的吸光度值，分別測定兩管的吸光度值，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比，根據(jù)對照管與測定管吸光度值之比， 計算標本中待測抗原含量計算標本中待測抗原含量競爭法 ELISAELISA問題解析問題解析、實驗室溫度太低；實驗室溫度太低；、洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液；洗滌液配制不正確或使用了錯誤的洗滌液；、洗滌系統(tǒng)有微生物污染或含有替代洗滌模式；洗滌系統(tǒng)有微生物污染或含有替代洗滌模式；、使用了過度的洗滌次數(shù)；使用了過度的洗滌次數(shù)；、孵育的時間太短；孵育的時間太短