激光掃描共聚焦顯微..GHX

1、 杲海霞河北醫(yī)科大學藥理教研室 采用激光作為光源，在傳統(tǒng)光學顯微鏡基礎(chǔ)上，使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針，采用共軛聚焦原理和裝置，從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像，在亞細胞水平上觀察生理信號及細胞形態(tài)的變化，并利用計算機對所觀察的對象進行數(shù)字圖象處理的一套集觀察、分析和輸出為一體系統(tǒng)。它把光學成像的分辨率提高了30%40%，成為形態(tài)學，分子生物學，神經(jīng)科學，藥理學，遺傳學等領(lǐng)域中新一代的研究工具。Hippocampus neurons expressing GFP熒光顯微鏡LSCM激光掃描共聚焦顯微鏡熒光顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡中常見的激光器Leica DM IRBE 倒置熒光顯微鏡L

2、SCM物鏡的重要參數(shù) NA 數(shù)值孔徑又叫做鏡口率，簡寫為N.A。是物鏡的主要技術(shù)參數(shù)，是判斷物鏡性能高低的重要標志。 N.A=n*sin a/2 n：物體與物鏡間媒質(zhì)的折射率 a2：物鏡孔徑角的一半 溴萘折射率1.66，香柏油1.515，玻璃1.52，水的為1.3，空氣為1。香柏油與玻璃折射率相似，故光折射少，透光率高，成像清楚。 N.A. 越大：放大倍數(shù)越大，分辨率越高， N.A. 越大：視場寬度與工作距離越小 4x 20 x 10 x 40 x 60 x 100 x 分析軟件控制軟件+圖1. 共聚焦顯微鏡簡化原理圖 用于激發(fā)熒光的激光束用于激發(fā)熒光的激光束(Laser)透過入射小孔透過入射

3、小孔(light source pinhole)被二向色鏡被二向色鏡(Dichroic mirror)反射，通過顯微物鏡反射，通過顯微物鏡(Objective lens)匯聚后入射于待觀察的標本匯聚后入射于待觀察的標本(specimen)內(nèi)部焦點內(nèi)部焦點(focal point)處。激光照射所產(chǎn)生的熒光處。激光照射所產(chǎn)生的熒光(fluorescence light)和少和少量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于量反射激光一起，被物鏡重新收集后送往二向色鏡。其中攜帶圖像信息的熒光由于波長比較長，直接通過二向色鏡并透過出射小孔波長比較長，直接通過二向色鏡并透過出射

4、小孔(Detection pinhole)到達光電探測到達光電探測器器(Detector)（通常是光電倍增管（通常是光電倍增管（PMT）或是雪崩光電二極管（）或是雪崩光電二極管（APD），變成），變成電信號后送入計算機。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，電信號后送入計算機。而由于二向色鏡的分光作用，殘余的激光則被二向色鏡反射，不會被探測到。不會被探測到。共軛ZXYXY平面Optical sections collected simultaneously at three different excitation wavelengths (488, 568, and 647

5、nanometers). The specimen is the fruit fly third instar wing imaginal disk. XYXY平面XYXY平面timeTime-lapse imaging of a living fruit fly embryo injected with calcium green is presented in Figure 2. The series of images shows the change in distribution of the fluorescent probe over time. 0 s10 s20 s30 sP

6、eripheral nervous system of a fruit fly embryo ZXYXY平面觀察活細胞、活組織：在不損傷細胞的前提下,對活組織、活細胞進行觀察和測量，這不僅省去了繁瑣的樣品前期處理過程(如脫水、脫蠟、染色等);而且觀察過的樣品還可以繼續(xù)用于其他的研究。這種功能對于細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因研究尤為重要。這可以說是最大的優(yōu)勢。6 生化成分精確定位觀察配合專用的分子探針,對于要檢測的成分不僅可以定位到細胞水平,還可以定位到亞細胞水平和分子水平。7 動態(tài)觀察在同一樣品平面上隨時間進行連續(xù)掃描,就可分析細胞結(jié)構(gòu)、內(nèi)含、和標記等動力學變化。目前在這方面做得最多的是使用觀察心肌或平滑

7、肌細胞內(nèi)游離鈣、鈉、鉀離子濃度或的動態(tài)變化。8 定量測量：首先應用專一的熒光探針對樣品進行染色,樣品的熒光強度和所測成分的含量呈正比,如果其余條件固定,通過對比各組樣品之間的熒光強度值,可得出特定成分的含量比。合適的熒光探針是有效地進行實驗并獲取理想實合適的熒光探針是有效地進行實驗并獲取理想實驗結(jié)果的保障。驗結(jié)果的保障。(1)現(xiàn)有儀器所采用的激光器現(xiàn)有儀器所采用的激光器(2)熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性(3)熒光的定性或定量熒光的定性或定量 定性定性:單波長激發(fā)探針單波長激發(fā)探針 定量定量:雙波長激發(fā)比率探針雙波長激發(fā)比率探針(4)熒光探針的特異性和毒性。熒光探針的

8、特異性和毒性。(5)熒光探針適用的熒光探針適用的pH * 不同的不同的熒光探針熒光探針在不同在不同標本標本的效果常有差的效果常有差異，故除綜合考慮以上因素以外，有條件者應進異，故除綜合考慮以上因素以外，有條件者應進行染料的行染料的篩選篩選，以找出最適的熒光探針。，以找出最適的熒光探針。* 許多熒光探針是許多熒光探針是疏水性疏水性的，很難或不能進的，很難或不能進入細胞，需使熒光探針與入細胞，需使熒光探針與AM（乙酰羥甲基酯）（乙酰羥甲基酯）結(jié)合后變成不帶電荷的結(jié)合后變成不帶電荷的親脂性化合物親脂性化合物方易于通過方易于通過質(zhì)膜進入細胞，在質(zhì)膜進入細胞，在細胞內(nèi)細胞內(nèi)熒光探針上的熒光探針上的AM被非被非特異性特異性酯酶水解酯酶水解，去掉，去掉AM后的熒光探針不僅可后的熒光探針不僅可與細胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，與細胞內(nèi)的靶結(jié)構(gòu)或靶分子結(jié)合且不易透出質(zhì)膜，從而能有效的發(fā)揮作用。從而能有效的發(fā)揮作用。Xenopus oocytesCalcium green用細胞內(nèi)液稀釋Calcium green導入微注射器以20nL/oocyte注射卵母細胞18C避光放置40分鐘共聚焦顯微鏡觀察HEK293 cells expressing PLC-PH-GFPPLC-PH-