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1、會(huì)計(jì)學(xué)1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)入門1.1.培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒 培養(yǎng)室培養(yǎng)室 無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或無(wú)菌培養(yǎng)室每天都要用速消凈或0.20.2的的新潔而滅(苯扎溴銨)拖洗地面一次(拖布要新潔而滅(苯扎溴銨)拖洗地面一次(拖布要專用),紫外線照射消毒專用),紫外線照射消毒303050min50min。 濕熱消毒:一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行濕熱消毒:一般使用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消毒,要求是:消毒,要求是: 不能裝太滿,保持消毒器內(nèi)氣體流通。不能裝太滿,保持消毒器內(nèi)氣體流通。 在加熱升壓之前,打開排氣閥門,使加在加熱升壓之前,打開排氣閥門,使加熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出
2、。熱后消毒器內(nèi)的殘留冷空氣排出。 關(guān)閉排氣關(guān)閉排氣閥門,開始升壓,待達(dá)到所需要的壓力時(shí),開閥門,開始升壓,待達(dá)到所需要的壓力時(shí),開始記錄時(shí)間,并控制壓力恒定。始記錄時(shí)間,并控制壓力恒定。 4.4.細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基(液)細(xì)胞培養(yǎng)用液及培養(yǎng)基(液): : (1 1)水:)水:雙蒸水、三蒸水,可高壓除菌。雙蒸水、三蒸水,可高壓除菌。 (2 2)平衡鹽溶液()平衡鹽溶液(PBS)PBS):PHPH為為7.27.27.47.4,不,不含鈣鎂離子含鈣鎂離子 ,可高壓除菌。,可高壓除菌。(3 3)消化液)消化液 : 胰蛋白酶液:胰蛋白酶液:常用胰蛋白酶的濃度為常用胰蛋白酶的濃度為0 025 25 ,pH
3、pH值值7.27.2左右。需過(guò)濾除菌。左右。需過(guò)濾除菌。(4 4)l640l640培養(yǎng)液培養(yǎng)液( (常用常用) )(5 5)DMEMDMEM、F12F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液 (6 6)HamHam培養(yǎng)液培養(yǎng)液 ( (無(wú)血清培養(yǎng)中常用的無(wú)血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基) )(7 7)HepesHepes:具有較強(qiáng)的緩沖能力,能具有較強(qiáng)的緩沖能力,能常時(shí)間恒定緩沖液的常時(shí)間恒定緩沖液的PHPH值。使用濃度可根值。使用濃度可根據(jù)緩沖要求而定。據(jù)緩沖要求而定。3737培養(yǎng)箱(或培養(yǎng)箱(或5%CO5%CO2 2培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)2424小時(shí)后換液小時(shí)后換液去處對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒物質(zhì),如去處對(duì)細(xì)胞生
4、長(zhǎng)有毒物質(zhì),如DMSODMSO、細(xì)胞組織殘?jiān)?、?xì)胞代謝產(chǎn)物、細(xì)胞組織殘?jiān)?、?xì)胞代謝產(chǎn)物 貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞直接去掉上清液直接去掉上清液 離心去掉上清液,必要時(shí)做細(xì)胞飼離心去掉上清液,必要時(shí)做細(xì)胞飼養(yǎng)層以凈化細(xì)胞養(yǎng)層以凈化細(xì)胞 傳代傳代 細(xì)胞生長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)8080以上覆蓋培養(yǎng)瓶底,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同而異,以上覆蓋培養(yǎng)瓶底,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同而異, 2 23 3天或天或1 1周左右一代周左右一代 貼壁細(xì)胞貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞. .消化法,用胰酶消化法,用胰酶EDTANa2EDTANa2消化,消化, 直接吹打或離心法、自然沉淀法直接吹打或離心法、自然沉淀法, 時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定
5、時(shí)間根據(jù)細(xì)胞而定 吸一半液到另一瓶吸一半液到另一瓶 凍存凍存四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn):四、細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn): 1.1.要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于10104 4個(gè)個(gè)/ml/ml,如,如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中;液中; 2.2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否則要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好,否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。 3.3.取樣計(jì)數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其取樣計(jì)數(shù)前,應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液,尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻,以時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更意每次取樣都要混勻,以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確;求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確; PC-3ECVLNCaPLNCaPCHO80以上sp20sp20HL-60 HL-60442 2 3h3h冰箱冰箱棄上清棄上清混勻混勻HeLa4(4 4)l640l640培養(yǎng)液培養(yǎng)液( (常用常用) )(5 5)DMEMDMEM、F12F12培養(yǎng)液培養(yǎng)液 (6 6)HamHam培養(yǎng)液培養(yǎng)液 ( (無(wú)血清培養(yǎng)中常用的無(wú)血清培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基) )(7 7)Hepe
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