《轉(zhuǎn)基因食品》-第二章-生物技術(shù)

1、1 基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)2 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物3 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物第二章 轉(zhuǎn)基因食品生物技術(shù)主要內(nèi)容怎樣制造出轉(zhuǎn)基因食品？怎樣制造出轉(zhuǎn)基因食品？怎樣獲得轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)原料？怎樣獲得轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)原料？ 轉(zhuǎn)基因食品轉(zhuǎn)基因食品豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮豆科植物的根瘤能夠固定空氣中的氮資料一：資料一：目前，全球的目前，全球的氮肥生產(chǎn)耗費氮肥生產(chǎn)耗費世界總電力的世界總電力的3%-4%3%-4%，但農(nóng)作，但農(nóng)作物只能吸收氮物只能吸收氮肥的肥的1/101/10，造，造成了大面積土成了大面積土壤和水質(zhì)的污壤和水質(zhì)的污染。染。資料分析引入資料分析引入蜘蛛能夠吐出蛛絲蜘蛛能夠吐出蛛絲資料二：資料二：蛛絲

2、是自然界最奇蛛絲是自然界最奇特的物質(zhì)之一，其特的物質(zhì)之一，其韌度是同樣直徑鋼韌度是同樣直徑鋼材的好幾倍。但蜘材的好幾倍。但蜘蛛不能家養(yǎng)，因為蛛不能家養(yǎng)，因為它們會互相吞食，它們會互相吞食，所以不可能建立人所以不可能建立人工飼養(yǎng)蜘蛛的農(nóng)場。工飼養(yǎng)蜘蛛的農(nóng)場。30多年來，科學(xué)家多年來，科學(xué)家們一直試圖找到利們一直試圖找到利用其他生物體來制用其他生物體來制造蛛絲的辦法。造蛛絲的辦法。 資料三：資料三： 以往，治療糖尿以往，治療糖尿病的胰島素是從動病的胰島素是從動物胰腺中提取的，物胰腺中提取的，從從100千克豬、牛千克豬、牛等動物的胰腺只能等動物的胰腺只能提取提取34克胰島素，克胰島素，治療一個患者需

3、宰治療一個患者需宰殺殺4050頭牛，頭牛，這種藥物的造價昂這種藥物的造價昂貴。貴。 微生物可以有分泌產(chǎn)物，且微微生物可以有分泌產(chǎn)物，且微生物繁殖速率快生物繁殖速率快經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于經(jīng)過多年的努力，科學(xué)家于20世紀世紀70年代創(chuàng)年代創(chuàng)立了可以立了可以定向定向改造生物的新技術(shù)改造生物的新技術(shù)基因工程基因工程。基因工程：按照基因工程：按照預(yù)定設(shè)計預(yù)定設(shè)計，在體外對不同來源，在體外對不同來源DNADNA分子分子進行人工切割、連接，插入進行人工切割、連接，插入載體載體DNADNA分子，使遺傳分子，使遺傳物質(zhì)物質(zhì)重新組合、改造重新組合、改造，經(jīng)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)入到，經(jīng)轉(zhuǎn)移、導(dǎo)入到受體細胞受體細胞，使，使之

4、持續(xù)穩(wěn)定繁殖、目的基因擴增、表達，獲得之持續(xù)穩(wěn)定繁殖、目的基因擴增、表達，獲得所需產(chǎn)所需產(chǎn)品品的工程。的工程。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細胞里，生物的細胞里，定向定向地改造生物的地改造生物的遺傳性狀遺傳性狀（從而獲（從而獲得新生物、新產(chǎn)品）。得新生物、新產(chǎn)品）。基因工程基本流程圖基因工程基本流程圖基本原理：操作水平：目 的：基因重組DNA分子水平定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的新物種或產(chǎn)品?；驹?供體、載體和受體上游技術(shù)：基

5、因重組、克隆和表達的設(shè)計與構(gòu)建（即DNA重組技術(shù)）。下游技術(shù)：基因工程菌（細胞）的大規(guī)模培養(yǎng)、外源基因表達產(chǎn)物的分離純化過程。DNADNA重組技術(shù)基因拼接技術(shù)對基因工程原理的學(xué)習(xí)，其實質(zhì)就是要對基因工程原理的學(xué)習(xí)，其實質(zhì)就是要求了解求了解/ /理解理解/ /掌握基因工程操作過程中所涉掌握基因工程操作過程中所涉及的步驟及運用的技術(shù)。及的步驟及運用的技術(shù)。基因工程的主要操作步驟基因工程的主要操作步驟獲得獲得目的基因目的基因與與選擇選擇載體載體1將目的基因與載體將目的基因與載體結(jié)合結(jié)合2將目的基因?qū)⒛康幕驅(qū)雽?dǎo)入受體細胞受體細胞3目的基因的目的基因的表達表達和和檢測檢測4有了目的基因，才能賦有了目

6、的基因，才能賦予一種生物以另一種生予一種生物以另一種生物的遺傳特性。物的遺傳特性。使目的基因在受體細胞使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用。遺傳、表達和發(fā)揮作用。 表達載體進入受體細胞表達載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化。生物中的轉(zhuǎn)化。 才能確定目的基因是否才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達。遺傳和正確表達。SS u分子水平操作階段分子水平操作階段 獲得含目的基因的重組體分子獲得含目的基因的重組體分子 第一環(huán)節(jié)第一環(huán)節(jié) 分離：提取、分離

7、含目的基因的分離：提取、分離含目的基因的DNADNA分子和載體分子和載體DNADNA分子，在分離提取過程中，注意分子，在分離提取過程中，注意質(zhì)、量，減少損傷。質(zhì)、量，減少損傷。第二環(huán)節(jié)第二環(huán)節(jié) 切割：選擇合適的切割：選擇合適的RERE工具酶，分別工具酶，分別對外源目的對外源目的DNADNA分子和載體分子和載體DNADNA分子進行酶解切割。分子進行酶解切割。 第三環(huán)節(jié)第三環(huán)節(jié) 連接：用連接：用DNADNA連接酶，將目的基因與連接酶，將目的基因與載體在體外連接為一個重組載體在體外連接為一個重組DNADNA分子，并進行鑒分子，并進行鑒定。定。 u細胞水平操作階段細胞水平操作階段 把含目的基因的重組體

8、導(dǎo)入受體細菌或受體細把含目的基因的重組體導(dǎo)入受體細菌或受體細胞，賦予其胞，賦予其“生命生命”讓其表達，獲得產(chǎn)品。讓其表達，獲得產(chǎn)品。第一環(huán)節(jié)第一環(huán)節(jié) 轉(zhuǎn)移：利用轉(zhuǎn)移：利用DNADNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，把構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移技術(shù)，把構(gòu)建的重組 體導(dǎo)入到受體菌或受體細胞中，獲得工程菌或工程細胞體導(dǎo)入到受體菌或受體細胞中，獲得工程菌或工程細胞。第二環(huán)節(jié)第二環(huán)節(jié) 篩選：利用核酸雜交，酶切分析、篩選：利用核酸雜交，酶切分析、PCRPCR和表和表型特征等技術(shù)，篩選出已克隆化的工程菌型特征等技術(shù)，篩選出已克隆化的工程菌/ /細胞。細胞。第三環(huán)節(jié)第三環(huán)節(jié) 表達：大量培養(yǎng)含重組體的工程菌表達：大量培養(yǎng)含重組體的工程菌/ /細

9、胞，細胞，誘導(dǎo)其表達，并對表達產(chǎn)物進行鑒定，提取和純化。誘導(dǎo)其表達，并對表達產(chǎn)物進行鑒定，提取和純化。 目的目的基因的分離獲取是基因工程研究中最主要基因的分離獲取是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分離是基因工程操作的關(guān)的要素，目的基因的成功分離是基因工程操作的關(guān)鍵。鍵。 由于每種基因，特別是單拷貝基因占整個生物由于每種基因，特別是單拷貝基因占整個生物基因組很小部分，且基因組很小部分，且DNADNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，都是由的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，都是由A A、T T、G G、C C四種堿基組成，具有極相似的理化性質(zhì)，四種堿基組成，具有極相似的理化性質(zhì)，這給分離特定的目的基因帶來很大困難。這給分離

10、特定的目的基因帶來很大困難。 基因分離的物理化學(xué)方法基因分離的物理化學(xué)方法鳥槍法分離基因鳥槍法分離基因cDNA文庫的建立與基因的分離文庫的建立與基因的分離直接從特定的直接從特定的mRNA分離基因分離基因基因組文庫的建立和基因的分離基因組文庫的建立和基因的分離從蛋白質(zhì)入手分離編碼此蛋白的基因從蛋白質(zhì)入手分離編碼此蛋白的基因基因的化學(xué)合成基因的化學(xué)合成利用利用PCR或或PT-PCR擴增分離基因擴增分離基因生物材料生物材料DNA目的基因的獲取目的基因的獲取mRNAcDNAPCR反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNA文庫文庫DNA一定大小一定大小范圍的范圍的DNADNA基因組文庫基因組文庫人工合成人工合成限制酶切限制酶

11、切基因分離的物理化學(xué)方法基因分離的物理化學(xué)方法根據(jù)根據(jù)DNADNA分子的兩條鏈存在著分子的兩條鏈存在著GCGC、A AT T堿基配對。堿基配對。當當DNADNA分子中某段的分子中某段的GCGC堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其熔解溫度（性就高，其熔解溫度（T Tm m）值就高。因此可以通過）值就高。因此可以通過控制熔解溫度使富含控制熔解溫度使富含A AT T區(qū)解鏈變性，而富含區(qū)解鏈變性，而富含GCGC區(qū)仍維持雙鏈，再利用單鏈核酸酶區(qū)仍維持雙鏈，再利用單鏈核酸酶S S1 1酶去除解開的酶去除解開的單鏈部分，得到富單鏈部分，得到富GCGC區(qū)的區(qū)的DNADNA片段。例如海膽片

12、段。例如海膽rDNArDNA基因的分離?；虻姆蛛x。這是基因工程在初始階段所用的方法，目前已不這是基因工程在初始階段所用的方法，目前已不用。用。鳥槍法分離基因鳥槍法分離基因用限制性內(nèi)切酶將基因組用限制性內(nèi)切酶將基因組DNADNA進行切割，得到很多進行切割，得到很多在長度上和一般基因大小相當?shù)脑陂L度上和一般基因大小相當?shù)腄NADNA片段片段相對分子相對分子質(zhì)量（質(zhì)量（0.80.89 9）10106 6。將這些片段混合物隨機地。將這些片段混合物隨機地重組入適當?shù)妮d體重組入適當?shù)妮d體, ,轉(zhuǎn)化后在受體菌中進行擴散，再轉(zhuǎn)化后在受體菌中進行擴散，再用適當?shù)姆椒êY選出你所要的基因。用適當?shù)姆椒êY選出你所要

13、的基因。篩選方法要簡單，如利用特定基因缺陷型（如營篩選方法要簡單，如利用特定基因缺陷型（如營養(yǎng)缺陷型等）的受體菌，或特定的寡核苷酸或養(yǎng)缺陷型等）的受體菌，或特定的寡核苷酸或DNADNA片片段探針以及特定基因產(chǎn)物的抗體，可通過對表型的段探針以及特定基因產(chǎn)物的抗體，可通過對表型的篩選或用分子雜交技術(shù)、免疫篩選技術(shù)檢出你所要篩選或用分子雜交技術(shù)、免疫篩選技術(shù)檢出你所要的基因。的基因。cDNA文庫的建立與基因的分離文庫的建立與基因的分離cDNA是指與是指與mRNA序列互補的序列互補的DNA序列。序列。cDNA文文庫最關(guān)鍵的特征是，它只包括在特定的組織或細胞庫最關(guān)鍵的特征是，它只包括在特定的組織或細胞類

14、型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成mRNA那些基因序列。那些基因序列。由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特由于不同的細胞類型、發(fā)育階段以及細胞所處的特定狀態(tài)是由特定基因的表達所決定的，因此各自的定狀態(tài)是由特定基因的表達所決定的，因此各自的mRNA種類就不同，由此而產(chǎn)生獨特的種類就不同，由此而產(chǎn)生獨特的cDNA文庫。文庫。在建立在建立cDNA文庫時，如果選擇的細胞或組織類型文庫時，如果選擇的細胞或組織類型得當，就容易從得當，就容易從cDNA文庫中篩選出所需要的基因文庫中篩選出所需要的基因序列。序列。cDNA文庫建立的步驟文庫建立的步驟分離表達分離表達目的基因的目的基因的組織或細胞組織或細

15、胞從組織或從組織或細胞中制備細胞中制備總體總體RNARNA或或mRNAmRNAcDNAcDNA的的甲基化和甲基化和接頭的加入接頭的加入雙鏈雙鏈cDNAcDNA同載體的同載體的連接連接第二條第二條cDNAcDNA鏈鏈的合成的合成第一條第一條cDNAcDNA鏈鏈的合成的合成12345直接從特定的直接從特定的mRNA分離基因分離基因 如果細胞中特定如果細胞中特定mRNA含量非常高，如哺乳動含量非常高，如哺乳動物的網(wǎng)織紅血細胞中，珠蛋白物的網(wǎng)織紅血細胞中，珠蛋白mRNA的比例占總的比例占總mRNA量的量的90%以上，這樣就可以通過以上，這樣就可以通過mRNA cDNA dscDNA （雙鏈（雙鏈cDN

16、A）的途徑而繞過建）的途徑而繞過建立立cDNA文庫這一步，直接得到基因。文庫這一步，直接得到基因。基因組文庫的建立和基因的分離基因組文庫的建立和基因的分離基因組文庫：基因組文庫：是指將基因組是指將基因組DNADNA通過限制性內(nèi)切酶通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后，所產(chǎn)生的基因組部分酶解后，所產(chǎn)生的基因組DNADNA片段隨機地同相應(yīng)片段隨機地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組組DNADNA的所有序列。的所有序列?；蚪M基因組DNADNA文庫的用途：文庫的用途：分析、分離特定的基因分析、分離特定的基因片段；片段；通過通過染色體步查染色體步查研

17、究基因的組織結(jié)構(gòu)；研究基因的組織結(jié)構(gòu)；用于基因表達調(diào)控研究；用于基因表達調(diào)控研究；用于人類及動、植物基用于人類及動、植物基因組工程的研究等。因組工程的研究等。從真核基因組從真核基因組DNADNA所分離得到的基因序列包含有內(nèi)所分離得到的基因序列包含有內(nèi)含子序列，因此不能直接在原核細胞中進行表達。含子序列，因此不能直接在原核細胞中進行表達。從蛋白質(zhì)入手分離基因從蛋白質(zhì)入手分離基因如果有足夠量可產(chǎn)生抗體的來源于真核細胞的蛋如果有足夠量可產(chǎn)生抗體的來源于真核細胞的蛋白質(zhì)，可以通過白質(zhì)，可以通過雙抗體免疫法雙抗體免疫法分離出此蛋白質(zhì)的基分離出此蛋白質(zhì)的基因。因?；驹恚夯驹恚汉颂求w沿核糖體沿mRN

18、AmRNA進行多肽鏈合成時形成進行多肽鏈合成時形成多聚核糖體蛋白多聚核糖體蛋白，而具有不同長度的新生肽鏈在核，而具有不同長度的新生肽鏈在核糖體上不斷延伸。把從細胞勻漿液制備的多聚核糖糖體上不斷延伸。把從細胞勻漿液制備的多聚核糖體蛋白同體蛋白同特定抗體特定抗體一起保溫，形成二者的復(fù)合體，一起保溫，形成二者的復(fù)合體，然而這種復(fù)合體不足以從細胞總多聚核蛋白體中沉然而這種復(fù)合體不足以從細胞總多聚核蛋白體中沉淀出來。淀出來。基因的化學(xué)合成基因的化學(xué)合成基因片段的全化學(xué)合成基因片段的全化學(xué)合成首先合成組成一個基因的所有片段，相鄰的片段首先合成組成一個基因的所有片段，相鄰的片段間有間有4 46 6個堿基的重

19、疊互補，在適當條件下（主要個堿基的重疊互補，在適當條件下（主要是溫度條件）經(jīng)退火后，再用是溫度條件）經(jīng)退火后，再用T T4 4DNADNA連接酶將各片段連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的形式連接成一個完整的基因。以磷酸二酯鍵的形式連接成一個完整的基因。因化學(xué)合成的基因在純化后其因化學(xué)合成的基因在純化后其55和和33端都為羥端都為羥基，所以在組建基因之前要將基，所以在組建基因之前要將DNADNA片段的片段的55端磷酸端磷酸化?；?。基因的化學(xué)合成及克隆圖解基因的化學(xué)合成及克隆圖解355353退退火火DNA連連接酶接酶T4DNA連連接酶接酶退退火火合成的合成的DNA全全基因基因EcoRBamHAmpTet

20、AmpBamHEcoRBamHBamHEcoREcoR合成的基因轉(zhuǎn)化Amp r Tet rAmp r Tet s基因的化學(xué)基因的化學(xué)酶促合成酶促合成不需要組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是不需要組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相鄰的合成其中一些片段，相鄰的33末端有一短的順序相末端有一短的順序相互補，在適當條件下通過退火形成模板互補，在適當條件下通過退火形成模板- -引物復(fù)合體，引物復(fù)合體，然后在存在四種然后在存在四種dNTPdNTP的條件下，用的條件下，用E.coliE.coli的的DNADNA聚合聚合酶酶大片段（大片段（KlenowKlenow片段）去填補互補片段之

21、間的片段）去填補互補片段之間的缺口，最后用缺口，最后用T T4 4DNADNA連接酶連接，再用適當?shù)南拗菩赃B接酶連接，再用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體。內(nèi)切酶切割后重組入載體?；虻幕瘜W(xué)基因的化學(xué)-酶促合成圖解酶促合成圖解分子克分子克隆隆磷酸磷酸化化退退火火DNA聚合酶聚合酶Klenow片片段段dNTPs連接酶連接酶利用利用PCR或或RT-PCR分離基因分離基因主要用于基因的分離和改造。特別是對原核基因主要用于基因的分離和改造。特別是對原核基因的分離，只要知道基因的核苷酸序列，就可以設(shè)的分離，只要知道基因的核苷酸序列，就可以設(shè)計適當?shù)囊飶娜旧w計適當?shù)囊飶娜旧wDNA上將所要的基因擴

22、增上將所要的基因擴增出來。出來。反轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)-PCR（RT-PCR）是指從）是指從mRNA入手，通過反入手，通過反轉(zhuǎn)錄得到轉(zhuǎn)錄得到cDNA，在適當?shù)囊锎嬖谙?，再通過，在適當?shù)囊锎嬖谙拢偻ㄟ^PCR將基因擴增出來。將基因擴增出來。 1.2 重要工具酶重要工具酶1 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別是識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點或其周并在識別位點或其周圍切割雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。限制酶有三類（限制酶有三類（型、型、型、型、型），在型），在DNADNA重組中使用的主要是重組中使用的主要是型限制

23、酶。型限制酶。限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的的作用過程作用過程2 基因的針線基因的針線DNADNA連接酶連接酶DNA連接酶（連接酶（DNA ligase）是通過催化兩段或數(shù)）是通過催化兩段或數(shù)段段DNA片段的片段的5磷酸基與磷酸基與3羥基之間形成磷酸二酯鍵羥基之間形成磷酸二酯鍵而將其拼接起來的酶。而將其拼接起來的酶。常用的常用的DNA連接酶是連接酶是T4DNA連接酶。連接酶。DNA連接酶的作用過程連接酶的作用過程連接酶連接酶的的作用過程作用過程DNA連接酶拼接連接酶拼接G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C

24、 GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶切割用同種限制酶切割DNA連接酶連接連接酶連接的是的是DNA骨架上骨架上的缺口，的缺口，不是不是堿堿基間的氫鍵基間的氫鍵 1.2 基因的運輸工具基因的運輸工具載體載體要使外源要使外源DNA片段能在宿主細胞內(nèi)復(fù)制、表達，必片段能在宿主細胞內(nèi)復(fù)制、表達，必須有特殊的須有特殊的“載體載體”。具有一個或多個限制酶的酶切位點，以便于與具有一個或多個限制酶的酶切位點，以便于與外源目的基因片段連接，形成重組子。外源目的基因片段連接，形成重組子。形成重組子后的運載體進入受體細胞后能穩(wěn)定形成重組子后的運載

25、體進入受體細胞后能穩(wěn)定存在并進行復(fù)制、表達。存在并進行復(fù)制、表達。載體載體DNA應(yīng)具有能夠觀察的表型特征，便于目應(yīng)具有能夠觀察的表型特征，便于目的基因在受體細胞內(nèi)擴增后的篩選。的基因在受體細胞內(nèi)擴增后的篩選。在原核生物的在原核生物的DNA重組中常用的載體是重組中常用的載體是質(zhì)粒質(zhì)粒與與噬噬菌體菌體。酵母酵母和和動物病毒動物病毒等常用作真核生物克隆的載體。等常用作真核生物克隆的載體。1 質(zhì)粒質(zhì)粒標記基標記基因，便因，便于進行于進行檢測。檢測。 質(zhì)粒存在于許多細菌質(zhì)粒存在于許多細菌和酵母菌等生物中和酵母菌等生物中, ,是細是細胞染色體外能夠自主復(fù)制胞染色體外能夠自主復(fù)制的很小的雙鏈環(huán)狀的很小的雙鏈

26、環(huán)狀DNADNA分分子。子。質(zhì)粒通過質(zhì)粒通過“轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化”進入進入受體細胞內(nèi)受體細胞內(nèi)細胞吸收外來細胞吸收外來DNADNA而獲而獲得可遺傳性狀的過程得可遺傳性狀的過程重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr載體特征：載體特征： 松弛型復(fù)制；松弛型復(fù)制； 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 5050100 100 /cell/cell； 有多個單一限制性有多個單一限制性核酸內(nèi)切酶位點；核酸內(nèi)切酶位點；

27、 許多酶切位點位于許多酶切位點位于抗性基因內(nèi)部，插抗性基因內(nèi)部，插入外源基因都會使入外源基因都會使抗性基因失活；抗性基因失活； 用于基因克隆。用于基因克隆。 pUCpUC質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體載體特征：載體特征：(1)(1)來自來自pBR322pBR322質(zhì)粒的質(zhì)粒的復(fù)復(fù)制起點制起點(ori)(ori)；(2)(2)氨卞青霉素氨卞青霉素抗性基因抗性基因(Ampr)(Ampr) ；(3)(3)大腸桿菌大腸桿菌-半乳糖苷半乳糖苷酶酶( (lac lac Z)Z)的啟動子及其的啟動子及其編碼該基因氨基端編碼該基因氨基端-肽肽鏈的鏈的DNADNA序列序列, ,此結(jié)構(gòu)特稱此結(jié)構(gòu)特稱為為laclacZZ基因；基

28、因；(4)(4)多克隆位點多克隆位點(MCS)(MCS)區(qū)段區(qū)段。 2 噬菌體噬菌體噬菌體是感染細菌、噬菌體是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體真菌、放線菌或螺旋體等微生物的等微生物的細菌病毒細菌病毒的的總稱?？偡Q。噬菌體通過噬菌體通過“侵染侵染”將攜將攜帶的重組帶的重組DNADNA分子分子“注入注入”受體細胞內(nèi)受體細胞內(nèi)重要的重要的噬菌體基因組結(jié)構(gòu)噬菌體基因組結(jié)構(gòu)載體特征：載體特征：(1)(1)噬菌體顆粒中的噬菌體顆粒中的DNA是是線性環(huán)狀的，約線性環(huán)狀的，約1/3是溶菌生是溶菌生長非必需的，可用外來長非必需的，可用外來DNA替換替換；(2)(2)可以通過可以通過“體外包裝體外包裝”，形成攜帶有

29、重組形成攜帶有重組DNADNA分子的新分子的新噬菌體顆粒噬菌體顆粒 ；(3)(3)噬菌體侵染受體細胞后，噬菌體侵染受體細胞后，可以在宿主細胞內(nèi)增殖可以在宿主細胞內(nèi)增殖?！叭芫緩饺芫緩健被蚧颉叭茉赐緩饺茉赐緩健? 動物病毒動物病毒質(zhì)粒和噬菌體雖然是很好的基因載體，但質(zhì)粒和噬菌體雖然是很好的基因載體，但只適用于原核生物。只適用于原核生物。某些真核生物病毒能在寄主染色體上整合，某些真核生物病毒能在寄主染色體上整合，可用作真核細胞可用作真核細胞DNA克隆的載體?？寺〉妮d體。反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒和和腺病毒腺病毒已經(jīng)被改造成能把外源已經(jīng)被改造成能把外源DNA導(dǎo)入哺乳導(dǎo)入哺乳動物細胞的動物細胞的“病毒載

30、體病毒載體”。4 農(nóng)桿菌（農(nóng)桿菌（Ti質(zhì)粒）質(zhì)粒）農(nóng)桿菌是生活在植物根的表面依靠由根組織滲透出來的營養(yǎng)物質(zhì)生存的一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細菌。根癌農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將其Ti質(zhì)粒上的一段T-DNA插入到植物基因組中。將目的基因插入到經(jīng)過改造的將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物的轉(zhuǎn)移和整合，農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物的轉(zhuǎn)移和整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，得到轉(zhuǎn)基因植物。然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，得到轉(zhuǎn)基因植物。 Ti-PlasmidT-DNALeft BorderRight BorderTumourformatio

31、nVirulenceRegionReplicationOpineCatabolism農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒圖譜根癌根癌致病區(qū)致病區(qū)根癌的分根癌的分解代謝區(qū)解代謝區(qū)復(fù)制區(qū)復(fù)制區(qū)用與提取目的基因用與提取目的基因相同的限制酶切割載體相同的限制酶切割載體（基因）使之出現(xiàn)一個（基因）使之出現(xiàn)一個切口，將目的基因插入切口，將目的基因插入切口處，讓目的基因的切口處，讓目的基因的黏性末端與切口上的黏黏性末端與切口上的黏性末端互補配對后，在性末端互補配對后，在DNADNA連接酶的作用下連連接酶的作用下連接形成重組接形成重組DNADNA分子。分子。2 目的基因與運載體的結(jié)合目的基因與運載體的結(jié)合基因重組體的

32、鑒定與篩選基因重組體的鑒定與篩選1重組質(zhì)粒的快速鑒定重組質(zhì)粒的快速鑒定2重組質(zhì)粒的限制酶解分析重組質(zhì)粒的限制酶解分析3通過通過互補是菌落產(chǎn)生顏色反應(yīng)來篩選重組體互補是菌落產(chǎn)生顏色反應(yīng)來篩選重組體4外源外源DNADNA片段插入失活片段插入失活5分子雜交篩選法分子雜交篩選法6表達文庫的免疫學(xué)篩選表達文庫的免疫學(xué)篩選7利用利用PCRPCR方法來確定基因重組體方法來確定基因重組體8DNADNA的序列分析的序列分析 重組基因的高效表達與所用的受體細胞關(guān)系密切。從原核細胞到真核細胞，從簡單的真核細胞如酵母菌到高等的動、植物細胞，都可以作為基因工程的受體細胞。選擇適當?shù)氖荏w細胞與適當?shù)闹亟M基因?qū)敕椒ㄊ侵亟M

33、基因高效擴增和表達的前提。1受體細胞的選擇受體細胞的選擇2重組重組DNADNA導(dǎo)入受體細胞導(dǎo)入受體細胞 導(dǎo)入導(dǎo)入擴增擴增3.1 受體細胞選擇的原則受體細胞選擇的原則表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因型要匹表達載體所含的選擇性標記與受體細胞基因型要匹配，易于對重組體進行篩選；配，易于對重組體進行篩選；受體的遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大發(fā)酵（或培受體的遺傳穩(wěn)定性高，易于進行擴大發(fā)酵（或培養(yǎng)），易于進行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表養(yǎng)），易于進行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達效率；達效率；受體細胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量受體細胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量要低，利于外源蛋白表

34、達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累；要低，利于外源蛋白表達產(chǎn)物在細胞內(nèi)積累；受體細胞應(yīng)能使外源基因高效分泌表達；受體細胞應(yīng)能使外源基因高效分泌表達；受體細胞對培養(yǎng)的適應(yīng)性強，可以進行貼壁或懸受體細胞對培養(yǎng)的適應(yīng)性強，可以進行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（針對動浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)（針對動物細胞）；物細胞）；受體細胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性；受體細胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性；受體細胞無致病性；受體細胞無致病性；具有好的轉(zhuǎn)譯后加工機制等。具有好的轉(zhuǎn)譯后加工機制等。3.2 重組基因?qū)胧荏w細胞的方法重組基因?qū)胧荏w細胞的方法裸裸DNADNA直接注射法直接注射法微粒轟擊

35、法微粒轟擊法電穿孔法電穿孔法顯微注射法顯微注射法物理物理方法方法化學(xué)方法化學(xué)方法磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣或磷酸鈣或DEAE-DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 生物方法生物方法質(zhì)粒載體介導(dǎo)法質(zhì)粒載體介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)法花粉管通道法花粉管通道法葉綠體基因組轉(zhuǎn)移法葉綠體基因組轉(zhuǎn)移法 裸裸DNADNA直接注射到受精卵中直接注射到受精卵中DNA直接注射到受精卵中直接注射到受精卵中。微粒轟擊（微粒轟擊（particle bombardment）基因槍基因槍電穿孔電穿孔(electroperation) 該方法利用脈沖該方法利用脈沖電場提高細胞膜的電場提高細胞膜的通

36、透性，使細胞膜通透性，使細胞膜上形成納米大小的上形成納米大小的微孔，可將微孔，可將DNADNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到細胞中。該方移到細胞中。該方法簡便，且有較穩(wěn)法簡便，且有較穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效率，可定的轉(zhuǎn)染效率，可廣泛運用于培養(yǎng)細廣泛運用于培養(yǎng)細胞的基因轉(zhuǎn)移。胞的基因轉(zhuǎn)移。顯微注射顯微注射指在顯微鏡下，將指在顯微鏡下，將DNADNA用玻璃針直接注入細胞。可用玻璃針直接注入細胞?？梢詫⒁詫NADNA直接注入核內(nèi)而減少溶酶體對外源直接注入核內(nèi)而減少溶酶體對外源DNADNA的的降解，有助于基因的整合與表達。降解，有助于基因的整合與表達。適用于多種貼壁生長細胞及懸浮生長細胞，包括適用于多種貼壁生長細胞及懸浮生長細胞，包

37、括原代及傳代細胞、胚胎細胞等。原代及傳代細胞、胚胎細胞等。磷酸鈣共沉淀法磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體載體包埋法脂質(zhì)體載體包埋法載體介導(dǎo)法載體介導(dǎo)法煙草原生質(zhì)體與煙草原生質(zhì)體與Ti質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移培養(yǎng)法質(zhì)粒共轉(zhuǎn)移培養(yǎng)法花粉管通道法花粉管通道法4 目的基因的表達和檢測目的基因的表達和檢測 處理的受體細胞中是否真正導(dǎo)入了目的基因，處理的受體細胞中是否真正導(dǎo)入了目的基因，導(dǎo)入了多少目的基因，需進行檢測導(dǎo)入了多少目的基因，需進行檢測針對目的基因。針對目的基因。 目的基因能否在受體內(nèi)進行表達（復(fù)制、翻譯），目的基因能否在受體內(nèi)進行表達（復(fù)制、翻譯），需進行檢測需進行檢測針對表達產(chǎn)物。針對表達產(chǎn)物。 表達產(chǎn)物的進一步的代

38、謝是否產(chǎn)生最終目標產(chǎn)物，表達產(chǎn)物的進一步的代謝是否產(chǎn)生最終目標產(chǎn)物，需檢測需檢測針對最終轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的性狀。針對最終轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的性狀。4.1 進行檢測的原因進行檢測的原因F染色體基因水平：染色體基因水平： 是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。是否整合了外源基因以及整合的位點和拷貝數(shù)。F轉(zhuǎn)錄水平：轉(zhuǎn)錄水平： 轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因的 mRNA 的存在與否以及表達水平。的存在與否以及表達水平。F翻譯水平：翻譯水平： 轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達以及功能檢測。轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)的表達以及功能檢測。F個體水平：個體水平： 抗蟲能力、抗病能力、產(chǎn)物活性等?？瓜x能力、抗病能力、產(chǎn)物活性等。4.2 進行檢測分析的策略進行檢

39、測分析的策略核酸（核酸（DNA），），位于細胞核位于細胞核Nucleus蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 功能產(chǎn)物功能產(chǎn)物mRNA（信使信使RNA）由由DNA轉(zhuǎn)錄而來轉(zhuǎn)錄而來外源基因表達產(chǎn)物檢測的過程就是對特異性外源基因表達產(chǎn)物檢測的過程就是對特異性mRNA或蛋或蛋白質(zhì)的檢測。白質(zhì)的檢測。檢測特異性檢測特異性mRNA的方法的方法Northern雜交法雜交法檢測特異性蛋白質(zhì)的方法檢測特異性蛋白質(zhì)的方法生化反應(yīng)檢測法生化反應(yīng)檢測法免疫學(xué)檢測法免疫學(xué)檢測法生物學(xué)活性檢測法生物學(xué)活性檢測法當轉(zhuǎn)化的外源目的基因表達產(chǎn)物沒有可供直接檢測的性質(zhì)當轉(zhuǎn)化的外源目的基因表達產(chǎn)物沒有可供直接檢測的性質(zhì)時，可把外源基因與標記基因或報告基

40、因一起構(gòu)成嵌合基因，時，可把外源基因與標記基因或報告基因一起構(gòu)成嵌合基因，通過檢測嵌合基因中的標記基因或報告基因間接確定外源目通過檢測嵌合基因中的標記基因或報告基因間接確定外源目的基因的存在和表達。的基因的存在和表達。PT-PCR法法4.3 檢測分析的技術(shù)方法檢測分析的技術(shù)方法免疫學(xué)檢測免疫學(xué)檢測免疫沉淀法免疫沉淀法酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法Western沉淀法沉淀法固相放射免疫法固相放射免疫法表達產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測表達產(chǎn)物生物學(xué)活性檢測當外源基因的表達產(chǎn)物是一種酶蛋白時，可根據(jù)酶的催化當外源基因的表達產(chǎn)物是一種酶蛋白時，可根據(jù)酶的催化反應(yīng)來確定外源基因表達與否和表達的程度。反應(yīng)來確定外源基

41、因表達與否和表達的程度。該方法簡便且易于操作，在反應(yīng)體系中加入特定的底物和該方法簡便且易于操作，在反應(yīng)體系中加入特定的底物和基因表達產(chǎn)物的抽提物就可根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象進行定性和定量的分基因表達產(chǎn)物的抽提物就可根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象進行定性和定量的分析。析?；虮磉_產(chǎn)物的分離純化基因表達產(chǎn)物的分離純化基因表達產(chǎn)物分離純化的步驟：基因表達產(chǎn)物分離純化的步驟：細胞破碎細胞破碎離心分離離心分離柱層析柱層析電泳電泳細胞的破碎細胞的破碎對于進行分泌型表達的細胞來說，這一步可以省略。對對于進行分泌型表達的細胞來說，這一步可以省略。對于非分泌型表達的細胞可采用不同的細胞破碎方法。于非分泌型表達的細胞可采用不同的細胞破碎方法。

42、常見的細胞破碎方式常見的細胞破碎方式變性劑裂解法變性劑裂解法超聲波破碎法超聲波破碎法機械破碎法機械破碎法酶裂解法酶裂解法第二節(jié)第二節(jié) 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物一、轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展一、轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展 將將外源基因外源基因?qū)雽?dǎo)入植物細胞植物細胞，經(jīng)，經(jīng)組織培組織培養(yǎng)養(yǎng)，獲得能夠，獲得能夠表達外源基因表達外源基因的植物。的植物。1983年，轉(zhuǎn)基因煙草、胡蘿卜問世年，轉(zhuǎn)基因煙草、胡蘿卜問世 1987年，轉(zhuǎn)基因油菜、棉花產(chǎn)生年，轉(zhuǎn)基因油菜、棉花產(chǎn)生1988年，轉(zhuǎn)基因水稻、玉米誕生年，轉(zhuǎn)基因水稻、玉米誕生 1992年，培育出轉(zhuǎn)基因小麥年，培育出轉(zhuǎn)基因小麥 1994年，培育出轉(zhuǎn)基因大麥年，培育出轉(zhuǎn)基因大麥預(yù)

43、測：預(yù)測：2020年世界上年世界上80 -90的農(nóng)作物將是轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)作物將是轉(zhuǎn)基因植物 與傳統(tǒng)的常規(guī)育種有何區(qū)別？與傳統(tǒng)的常規(guī)育種有何區(qū)別？ 轉(zhuǎn)基因植物通常轉(zhuǎn)基因植物通常至少含有一種非近源物種的遺傳基因。至少含有一種非近源物種的遺傳基因。植物轉(zhuǎn)基因的基本技術(shù)路線植物轉(zhuǎn)基因的基本技術(shù)路線二、植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)二、植物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)蘇云金桿菌蘇云金桿菌毒蛋白基因毒蛋白基因質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌棉花棉花棉花細胞棉花細胞侵染轉(zhuǎn)移侵染轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)基因棉花抗蟲棉的構(gòu)建抗蟲棉的構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng)植物轉(zhuǎn)基因的受體系統(tǒng) 組織受體系統(tǒng)組織受體系統(tǒng)（如：受傷的細胞容易受到病毒

44、（如：受傷的細胞容易受到病毒或質(zhì)粒的感染，并形成愈傷組織，可誘導(dǎo)分化出完或質(zhì)粒的感染，并形成愈傷組織，可誘導(dǎo)分化出完整植株）整植株） 原生質(zhì)體系統(tǒng)原生質(zhì)體系統(tǒng)（便于體外細胞和遺傳操作）（便于體外細胞和遺傳操作） 生殖細胞受體系統(tǒng)生殖細胞受體系統(tǒng)（1、單倍體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷、單倍體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織、轉(zhuǎn)化；組織、轉(zhuǎn)化；2、利用花粉和卵細胞的受精過程轉(zhuǎn)、利用花粉和卵細胞的受精過程轉(zhuǎn)化：類似轉(zhuǎn)基因動物？）化：類似轉(zhuǎn)基因動物？） 葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)葉綠體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（能直接表達原核基因）（能直接表達原核基因）外源基因?qū)胫参锸荏w的方法外源基因?qū)胫参锸荏w的方法 直接轉(zhuǎn)化法直接轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

45、（19741974年）年） 基因槍法基因槍法（19871987年）年） 植物病毒介導(dǎo)法植物病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因植物的類型轉(zhuǎn)基因植物的類型三、轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)實踐三、轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)實踐1 抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植物（最早進入田間生產(chǎn)，目前栽培面積最大）如 Monsanto 的抗除草劑草甘膦大豆2 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲轉(zhuǎn)基因植物 如 Syngenta的Bt 176抗蟲玉米3 抗病轉(zhuǎn)基因植物抗病轉(zhuǎn)基因植物 （抗病毒，抗真菌，抗細菌）4 抗環(huán)境脅迫轉(zhuǎn)基因作物抗環(huán)境脅迫轉(zhuǎn)基因作物 （溫度、水分、化學(xué)物）5 植物發(fā)育調(diào)節(jié)基因工程植物發(fā)育調(diào)節(jié)基因工程 （控制果實成熟，雄性不育，改良植物品質(zhì)）6 醫(yī)藥領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)基因植物醫(yī)藥領(lǐng)域中的轉(zhuǎn)基因植物（利用植物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)藥用蛋白、食用疫苗等）轉(zhuǎn)基因水稻與小麥2022-6-27金大米金大米 轉(zhuǎn)SCK基因水稻與對照 彩色玉米 抗蟲的Bt轉(zhuǎn)基因玉米2022-6-27轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)基因大豆 抗抗CMV病毒轉(zhuǎn)基因番茄病毒轉(zhuǎn)基因番茄抗抗CMV病毒轉(zhuǎn)基因甜椒病毒轉(zhuǎn)基因甜椒抗除草劑大豆抗除草劑大豆脂肪含量高脂肪含量高含含-胡蘿卜素胡蘿卜素轉(zhuǎn)基因向日葵2022-6-27轉(zhuǎn)基因棉花也許有一天