CH2 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)(2011)

1、第二章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)1主要內(nèi)容 一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史 二、蛋白質(zhì)組的特征 三、蛋白質(zhì)組與基因組的關(guān)系 四、蛋白質(zhì)組的研究技術(shù)和研究策略第二章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)2 1、蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams 和 Wilkins于1994年首先提出。 “Proteome”源于蛋白質(zhì)(Protein)和基因組(genome)兩個(gè)詞的結(jié)合，用于表示一種細(xì)胞、組織或生物個(gè)體所能表達(dá)出來的所有蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)組是一個(gè)基因組所能表達(dá)出來的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同。 一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷

2、史3 蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究蛋白質(zhì)組成及其功能網(wǎng)絡(luò)的科學(xué)。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)組或應(yīng)用大規(guī)模蛋白質(zhì)分離和識別技術(shù)研究蛋白質(zhì)組的一門學(xué)科，是對基因組所表達(dá)的整套蛋白質(zhì)的分析。 Proteomics 通過對細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成種類、豐度、功能變化及與細(xì)胞或生物個(gè)體機(jī)能變化相互聯(lián)系的分析，揭示細(xì)胞或生物生命活動規(guī)律。主要研究內(nèi)容： 表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué) 特定的細(xì)胞、組織或器官合成的蛋白質(zhì)種類、豐度及功能，關(guān)鍵技術(shù) 2-D電泳等。 一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史4一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)的序列和高級結(jié)構(gòu)，X- 射線單晶衍射分析（晶體結(jié)構(gòu)分析）、多維核磁共振波

3、譜分析、電鏡二維晶體三維重構(gòu)術(shù)（電子晶體學(xué)）。 細(xì)胞圖譜蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)的胞內(nèi)分布及移位，確定蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的位置，通過純化細(xì)胞器或用質(zhì)譜儀鑒定蛋白復(fù)合物組成等。 功能蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白質(zhì)的功能模式，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其與其他分子的相互作用。5 2、蛋白質(zhì)組研究簡況 1975年，首先由OFarrell等創(chuàng)立Two-dimensional electrophoresis。 1997 年 Wilkins, M. and Williams 提出了蛋白質(zhì)組的概念。 1997年召開了第一次國際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會議。 1999年1月在英國倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會議。 我國也于1998年啟動了蛋白質(zhì)組學(xué)研

4、究，在中科院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會。 一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史6 2003年成立了中國人類蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO）。 2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開了中國蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會。 2004年10月在中國北京召開了第三屆國際蛋白質(zhì)組學(xué)會議。 科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金委員會也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展。一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史7 3. Why is proteomics necessa

5、ry Displaying and studying the products of genes directly is an attractive way of studying disease and complex problem in biology The study of gene expression can also be attempted at the level of mRNA (microarray.) However (1)You can have a protein in the cell when its mRNA is no longer present; (2

6、)You can have lots of mRNA without translation of the message to protein; 一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史8 (3)No good correlation between mRNA abudence and protein amout in a cell at a given time; (4)Protein post-translational modification; (5) Protein subcellular location. Proteomics directly contributes to Annotat

7、ion of genome .一、蛋白質(zhì)組的基本概念和歷史9 蛋白質(zhì)的“四維”研究 特定的時(shí)間：合成與降解 特定的空間：區(qū)域性與運(yùn)動性 Dynamic Proteomics (動態(tài)蛋白質(zhì)組學(xué)) 動態(tài)表達(dá)、動態(tài)組成、動態(tài)定位、動態(tài)關(guān)系 動態(tài)表達(dá)：通過對疾病發(fā)生,發(fā)展,預(yù)后過程中的蛋白質(zhì)差異譜構(gòu)建,跟蹤關(guān)鍵蛋白質(zhì)在疾病不同時(shí)期動態(tài)表達(dá)。 蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異是功能變化的基礎(chǔ)之一。 二、蛋白質(zhì)組的特征10 動態(tài)組成：蛋白質(zhì)翻譯后修飾, 如磷酸化，糖基化,乙?；鹊拇笠?guī)模分析和監(jiān)測。 蛋白質(zhì)翻譯后修飾增加蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，信號傳遞的方式。 動態(tài)定位：亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析及定位，與功能相關(guān)的蛋白質(zhì)空間動態(tài)變化

8、分析。 定位變化導(dǎo)致相互作用的改變，蛋白質(zhì)群功能改變。 動態(tài)關(guān)系：蛋白質(zhì)功能復(fù)合物，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)與小分子配體相互作用分析。 不同的蛋白質(zhì)群及其結(jié)構(gòu)發(fā)揮不同的功能。二、蛋白質(zhì)組的特征11 蛋白質(zhì)組的確定？ 1，蛋白質(zhì)組的完整性： 基因組內(nèi)基因（或ORF）數(shù)量？ 基因表達(dá)？ 2，蛋白質(zhì)組的測定： 修飾蛋白質(zhì)的判據(jù)？ 蛋白質(zhì)的動態(tài)變化（降解或轉(zhuǎn)運(yùn)）？二、蛋白質(zhì)組的特征12Relational Query ToolsSequence databasesGenomeWhat could happenGene ExpressiondatabasesTranscriptome+What w

9、ould happenProtein ExpressiondatabasesProteome+What is happening三、蛋白質(zhì)組與基因組的關(guān)系13 （一）蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的復(fù)雜性 具有比基因組學(xué)研究更高的復(fù)雜性： 20種化學(xué)和物理性質(zhì)不同的氨基酸。 蛋白質(zhì)量的動態(tài)差別（106 ）。 蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性。 蛋白質(zhì)修飾的多樣性和復(fù)雜性。四、蛋白質(zhì)組的研究技術(shù)和研究策略14（一）蛋白質(zhì)組研究技術(shù)的復(fù)雜性15 1、基于二維電泳-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究 2、基于液相色譜（電泳）-質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組研究 液相電泳-質(zhì)譜技術(shù) 液相色譜-質(zhì)聯(lián)用技術(shù) 同位素親和標(biāo)簽技術(shù) (isotope-coded

10、affinity tages,ICAT) 3、蛋白質(zhì)芯片（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法16 Two-dimensional Electrophoresis (2-DE) 1st dimension: isoelectric focusing (IEF) proteins are separated in a pH gradient until reach a stationary position where their net charge is zero. The pH at which a protein has zero net charge is called isoelectric

11、 point (pI). 2nd dimension: SDSProteins are separated according their molecular weight (Mr)（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法171980sThe introduction of immobilised pH gradient (IPG)eliminlated the problem of gradient instability and poor sample loading capacityImmobilised pH gradient (IPG)pH gradient ( ampholyte) is c

12、o-polymerised with the acrylamide gel matrix to form completely stable gradients.The commercial precast IPG stripes is available in various pH ranges (3-10,4-7.).（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法182-DE is the only method currently available which iscapable of simultaneously separating thousands of proteins（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要

13、研究方法19Cell cultureProtein extraction2-DESilver stainingImage analysisScanning（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法20+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10+pH 3pH 7.5pH 10The 1st D: Isoelectric Focusing（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法21+pH 3pH 7.5pH10pH 3.0pH 7.5pH10電荷分子量2-D 理論（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法22主機(jī)PROTEAN IEF Cell7cm, 11cm,17cm水化盤

14、各25個(gè),每個(gè)可做1-12個(gè)膠條礦物油7cm, 11cm,17cm高通量聚焦槽各一個(gè),每個(gè)聚焦槽可做1-12個(gè)膠條鑷子、小刷子另可加配備24cm聚焦槽和杯上樣聚焦槽（1-12個(gè)膠條）（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法23低通量（1-2塊膠）用于一般分析實(shí)驗(yàn)高通量（1-12塊膠）用于大規(guī)模蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)Mini PROTEAN3 (7cm) CriterionTM Cell (11cm)PROTEAN II XL Cell (17,18cm)Mini PROTEAN3 Dodeca(7cm) CriterionTM Dodeca Cell (11cm)PROTEAN Plus Dodeca(17,18

15、,24cm) 第二向SDS PAGE（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法242-D 膠分析分析軟件全自動點(diǎn)檢測和定量分析，可同時(shí)進(jìn)行100塊以上膠的分析，數(shù)據(jù)庫對膠的數(shù)目沒有限制，可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可對每組膠進(jìn)行差異表達(dá)分析，蛋白進(jìn)行注釋和索引。（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法25pIM.Wt.（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法26Differential AnalysisProteins fromcultured human cellsA = Derivative of B AB（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法27ABE. Coli grown at 30 CE. Coli grown at 42 CDif

16、ferential Expression （二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法28 熒光差異染色 利用兩種不同的熒光染料如Cy3（綠光）和Cy5（紅光）分別對從對照和處理材料提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記、混合、混合樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向電泳分離，分別以兩種不同的激光去激發(fā)掃描生成兩種不同的彩色圖像，然后再將兩者疊加，根據(jù)電泳斑點(diǎn)所形成的顏色判斷蛋白質(zhì)的代謝變化。 黃色：沒有差異 紅色：上調(diào) 綠色：下調(diào)（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法29（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法30 2-DE技術(shù)的缺點(diǎn)： 極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，分子量極大極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。 膠內(nèi)酶解過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難

17、于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動化。 液相色譜法(liquid chromatography，LC); 毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE); 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）.（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法31同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽方法 Aebersold 和其合作者建立的一種同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽試劑(isotopically coded affinity tag，ICAT)差異蛋白鑒定方法。 ICAT試劑的結(jié)構(gòu)包含一個(gè)生物素頭部、一個(gè)連接部分和一個(gè)碘激活的羰基基團(tuán)，其中羰基基團(tuán)能夠特異性地與肽鏈中的半胱氨酸側(cè)鏈反應(yīng)，借助于生物素親和標(biāo)記將其抽提出來。 重同位素的形態(tài)與輕同位

18、素的形態(tài)的差別相當(dāng)于在連接區(qū)部分的8個(gè)氫原子被8個(gè)氘原子取代。（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法32（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽方法33 （1）兩個(gè)蛋白質(zhì)樣品(細(xì)胞狀態(tài)I和細(xì)胞狀態(tài))分別單獨(dú)用d0ICAT和d8ICAT試劑標(biāo)記； （2）混合、胰蛋白酶水解； （3）肽混合物用生物素親和色譜柱分析，含半胱氨酸殘基肽被結(jié)合在柱上； （4）洗脫、串聯(lián)質(zhì)譜檢測定量。 一對不同標(biāo)記的肽幾乎在相同的時(shí)間洗脫，可以通過兩個(gè)距離為8 Da的質(zhì)譜信號識別出來。 參考文獻(xiàn)：同位素親和標(biāo)簽(ICAT)系列技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法34蛋白芯片(protein chip

19、)技術(shù)（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法35 （1）點(diǎn)樣：未經(jīng)處理的樣品(如血清，尿液等)直接點(diǎn)在芯片上，根據(jù)芯片表面不同的化學(xué)或生物特性結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)； （2）沖洗：洗去芯片上結(jié)合的非蛋白組份； （3）加上能量吸收分子溶液：在芯片表面形成含有分析物和大量能量吸收分子“晶體”； （4）激光解吸電離法(SELDI)：將保留在芯片上的蛋白質(zhì)洗脫下來； （5）質(zhì)譜分析：電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時(shí)間質(zhì)譜儀精確地測定它們的質(zhì)量。（二）蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究方法36High Vacuum SystemInletIon SourceMass FilterDetectorData SystemMass Spect

20、rometry（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用3738TOF-MS instrument with a single acceleration stageFEq F = ma a = Eq/m （三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用39（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用40 肽質(zhì)量紋鑒定法 Peptide Mass Fingerprinting (PMF）是目前蛋白質(zhì)組研究中較為常用的鑒定方法這一技術(shù)于1993年被多個(gè)研究小組分別獨(dú)立提出。 肽質(zhì)量指紋鑒定的依據(jù)：第一種蛋白質(zhì)都有特定的氨基酸序列，被特定的蛋白質(zhì)酶水解可以得到一套特定肽鏈片斷（肽片段質(zhì)量圖譜）。由于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列都不同，蛋白質(zhì)被酶水解

21、后，產(chǎn)生的肽片段序列也各不相同，肽片段質(zhì)量圖譜可用于蛋白質(zhì)的鑒定。（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用41 由于在ESI條件下待分析物可能帶上一個(gè)或多個(gè)電荷，而MALDI-TOF ( Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 )分析中的離子一般只帶一個(gè)電荷，比較容易計(jì)算。另外，由于MALDI-TOF質(zhì)譜儀產(chǎn)生的質(zhì)譜圖精度較高，而由ESI質(zhì)譜儀產(chǎn)生的質(zhì)譜圖精度相對較低。 目前一級質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的算法（肽質(zhì)量紋）主要用在MALDI-TOF產(chǎn)生的質(zhì)譜圖上。多肽

22、質(zhì)量紋一般都是在MALDI-TOF儀器的結(jié)果上進(jìn)行。（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用42Bovine Carbonic anhydraseand human Hsp70s protein （一級質(zhì)譜）（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用43（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用44 PMF中的問題 （1）質(zhì)量相近的多肽怎么處理？ 限制用來搜索的數(shù)據(jù)庫，如果做的試驗(yàn)用的是小白鼠的組織，那么你可以只在鼠類的數(shù)據(jù)庫中搜索；要求必須有多個(gè)多肽和數(shù)據(jù)庫相匹配，才做出最后的蛋白質(zhì)鑒定。 （2）一張質(zhì)譜圖中可能有多個(gè)蛋白存在？ 通常，MALDI-TOF是與雙向電泳連接使用。雙向電泳的一個(gè)電泳點(diǎn)上可能有2-3個(gè)蛋白。（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用45 肽氨基酸序列法 在一級質(zhì)譜圖中，選擇其中的一個(gè)峰，對其進(jìn)行CID（Collision-induced Dissociation），使其在特定的部位斷裂就得到一張二級質(zhì)譜圖。 這里的假設(shè)是一級質(zhì)譜中的一個(gè)峰就對應(yīng)了一個(gè)多肽，實(shí)際情況可能并不是這樣。 對于一張一級質(zhì)譜圖，可以選擇多個(gè)峰進(jìn)行二級質(zhì)譜的操作。這樣就可以適應(yīng)一張質(zhì)譜圖里有多個(gè)蛋白的情況。（三）質(zhì)譜在蛋白質(zhì)鑒定中的應(yīng)用4