生化與分子生物學技術原理

1、 一.基本的化學組成 經不同程度水解可獲得核酸各種組成部分 核苷酸核苷酸 nucleotide Nt 核苷核苷 nucleoside Ns 堿基堿基 嘌呤 purine Pu 嘧啶 pyrimidine Py 堿基三字符號 Ade Cyt Gua Thy Ura Ns單字符號 (d) A C G T U Ns, Nt, oligoNts 中均為D-戊糖 堿基可異構化 異構平衡僅 H 原子位置變化UV,NMR分析 生理 pH 條件下, 5種堿基 99.99% 以氨基與酮式存在。酮式酮式烯醇式烯醇式氨基氨基亞胺亞胺 N-糖苷鍵 C1 與嘧啶 N1 連接 C1 與嘌呤 N9 連接 oligo 表示法

2、 poly U 均聚物 poly (dA-dT) 交替排列 poly (dAdT) 隨機排列 poly A2poly U 按1:2結合成復合物 (三鏈) 二. 糖環(huán)的折疊形式 構型構型(configuration)(configuration)共價化合物中,各個原子在空間的相對排列關系。 構型的改變涉及到共價鍵破壞 核酸中核糖僅一種構型 ： - D型 構象構象(conformation) (conformation) 化合物內可以自由轉動的單鍵上的原子或基團,繞單鍵旋轉或隨單鍵扭轉,產生幾種不同的空間排列形式。 構象的改變并不伴隨共價鍵的破壞 核酸中的核糖有多種構象 核糖的五員環(huán)不處于一個平面

3、，C1，O，和 C4 三個原子在一個平面上，C2 或/和 C3 偏離此平面，使核糖產生不同的構象。 內式構象內式構象(endo)偏離平面的方向和 C5同向 外式構象外式構象(exo) 偏離平面的方向和 C5反向1. 信封式 (Envelope, E ) 糖環(huán)的 C 2或 C 3 1個原子偏離平面的折疊 C2-endo ( 2E ) C3-endo ( 3E ) C2-exo ( E2 ) C3-exo ( E3 ) 內式內式外式外式2. 扭轉式 ( Twist, T ) 糖環(huán)的 C2 和 C3 兩個原子都偏離糖平面,而且取方向相反的折疊。 兩個原子偏離糖平面的程度可以相等或不等 C2-endo

4、-C3-exo C2-exo-C3-endo 存在 溶液 : Nt , Ns C2-endo C3-endo DNA : B-DNA C2-endo A-DNA(RNA) C3-endo Z-DNA 胞苷(C) C2-endo ( 反式） 鳥苷(G) C3-endo（順式 ）(B-form double DNA)(A-form double DNA)三. 核苷的順反構象( syn-anti 構象) 核糖和堿基以N-糖苷鍵連接成核苷，核苷中堿基平面繞糖苷鍵旋轉形成核苷的順反構象。 扭轉角決定核苷的構象 存在 溶液: 順反式可互換 結晶: 順反式不可互換 C2-endoC3-endo四. 核酸的修

5、飾成分及甲基化 1948年 小牛胸腺DNA分離 m5dC 特點: 原有成分的衍生物 含量少(百分之幾萬分之幾) 主要化學鍵不變 1.修飾堿基 60余種 Ura Ade Gua Cyt ThyUra Ade Gua Cyt Thy 25 17 12 6 2 堿基上原子被其他基團取代 m p om AA衍生物 Base-CO-NH-AA 糖衍生物 Base-CH2OH-糖(6C) 非嘌呤,嘧啶衍生物 ( tRNA )W異丙烯 GuatRNA anticodon 3鄰位Q 7-去N-GuatRNA anticodon 擺動位2.修飾核糖 RNA C2-OH 甲基化 ( Nm ) 抗水解 (Rnase

6、 , OH ) 二聚體 NmpNp3. 糖苷鍵不同 假尿苷 (tRNA rRNA) C5-C1 糖苷鍵4. 修飾符號 m1A m7G Cm m m2G m3 G22.2.75. 分布 a. RNA 70 mRNA ( hnRNA mRNA ) 5-Cap: m7G Nm 分子內: m6A m5C rRNA 原核 m5C 真核 Nm mN 高度修飾成分( m1ncp3 ) Hela cell 28S rRNA 65Nm ( 70 ) 18S rRNA 40Nm 6mN tRNA 60余種分布在環(huán)區(qū) anticodon loop 高度修飾 Q W SnRNA uRNA 5-end Cap m3 G

7、2.2.7 稀有堿基的形成 酶催化 -CH3 堿基交換 Q tRNA鳥嘌呤鳥嘌呤 糖苷轉移酶糖苷轉移酶 G34 (tRNA) Q34 (tRNA) Q Gua N- 糖苷鍵打斷、重建 b. DNA 10 種 甲基化 形成 合成時om5dC參入 phage T 2.4.6 合成后甲基化 m5dC m6dA m4dC DNA 甲基化酶 S-腺苷甲硫氨酸（甲基供體） 6.甲基化與基因表達 a. 原核生物DNA甲基化 限制修飾系統(tǒng) DNA甲基化與復制 E. coli dam G *ATC dcm C *CA/TGG 完全甲基化 oriC 復制活性 半甲基化 oriC 抑制復制活性 oriC, dna

8、甲基化速度與復制循環(huán) 半甲基化 oriC 與膜結合抑制復制(抑制劑) * dam 半甲基化產物積累半甲基化產物積累 b.真核生物DNA甲基化 甲基化在兩條鏈上, 對稱分布 真核生物真核生物 5-mCpG-3 植物 5-mCNG-3 dC mdC 影響DNA-蛋白質相互作用 甲基化格式具有組織專一性 pattern of methylation 格式變化: 配子發(fā)生時期, 胚胎發(fā)育早 期,病毒感染 格式維持:DNA甲基化酶維持配子和體 細胞甲基化狀態(tài)甲基化格式的維持甲基化格式的維持C*CGGCCGGCCGG甲基化格式的限制性內切酶分析甲基化格式的限制性內切酶分析甲基化與基因表達 雞珠蛋白基因的組

9、織特異性分析(Mspl Hpall) CpG 表達 (紅細胞） mCpG 不表達（腎、腦) 肌動蛋白( actin gene)表達 高速率 轉錄 肌肉細胞 actin gene actin gene (CpG) (mCpG) 成纖維細胞 低速率 轉錄 Promoter -CpG- 甲基化與轉錄 -globin gene 200 +90 有甲基化基團 mCpG 轉錄受阻 除去部分 mCpG 轉錄受阻 除去所有 CpG 轉錄 5-氮胞苷抑制甲基化,瞬時去甲基化 5-NC 成纖維細胞 肌肉細胞 ( 多核 ,有條紋, 可收縮 ) 甲基化與小鼠胚胎發(fā)育 knock out 甲基轉移酶 gene C 胚胎

10、發(fā)育早期 甲基化格式變換,其后細胞內DNA維持特定的甲基化狀態(tài) 配子發(fā)生期,不同性別配子的甲基化格式是特定的。其區(qū)別使父母等位基因在胚胎中表達不同。 下一代配子保持相同格式 Igf2 gene IGF-胰島素-like生長 因子依賴于父本表達 Igf2R gene IGF-R胰島素-like生長 因子受體依賴于母本表達一條一條X-染色體的失活染色體的失活 甲基化格式的建立、維持和改變 從無到有(de novo)甲基化 雙鏈相對-CpG- -mCpG- 確立新格式 甲基化的維持 脫甲基 被動 復制后不再甲基化 主動 甲基轉移 堿基切除修復 CpG-rich islands 基因組中存在異常非甲基

11、化-CpG-順序簇 高含量 C+G 高頻率 CG dimer (10/100bp ) 分布不均, 長1-2 kb，間隔 100 kb 非甲基化 CpG 存在：housekeeping genes tissues specific genes 5- 啟動子轉錄區(qū) 腺嘌呤磷酸核糖腺嘌呤磷酸核糖轉移酶轉移酶CpG密度密度 1/100bpCpG密度密度 10/100bp 100 300 1. 1. 二氫葉酸還原酶基因二氫葉酸還原酶基因 2. 2. 次黃嘌呤轉磷酸核糖酶基因次黃嘌呤轉磷酸核糖酶基因 3. 3. 核糖體蛋白質基因核糖體蛋白質基因123 CG mCG抑制轉錄的蛋白質 MeCP-1 *CpG

12、成簇 MeCP-2 *CpGDNA甲基化有助于基因關閉甲基化有助于基因關閉五. 核酸及其化學組分的化學反應 1.水解反應 磷酸二酯鍵, 磷酸單酯鍵, N-糖苷鍵 a. 酶水解 b. 酸堿水解 磷酸二酯鍵 酸 熱強酸 dA,dG 0.1NHCl 30mi （100C) rA,rG 1M HCl 60min rC, rU 12M HClO4 60min 堿 DNA 不作用 RNA 鄰接基團參與效應,生成磷酸 基轉移中間物,水解。 N-糖苷鍵 堿穩(wěn)定 酸不穩(wěn)定 DNA RNA dNs Ns 嘌呤Ns 嘧啶Ns 酸堿作用比較酸堿作用比較 DNA RNA 堿堿 / 2 or 3-Nt產物產物 酸酸 Pu

13、, Py, Pu, PyNt, 多聚核糖-P碎片 碎片 磷酸二酯鍵 嘧啶糖苷鍵穩(wěn)穩(wěn) 大大 定定 嘧啶糖苷鍵 磷酸二酯鍵 性性 小小 嘌呤糖苷鍵 嘌呤糖苷鍵2. -消除反應 連接磷酸基團的 -C 原子上有強的吸電子基團存在時, 引起 -C 原子和 O 原子間的鍵斷裂。 OH R P O CH2 CH2 Z (CHO, C=O , HC=N A-N1 C-N3 T-N3 DMS作用于dsDNA A-N3(Me) , 阻止DNA pol. 強(Hard) 烷化劑 N-甲基-N-亞硝基脲(MNU) N-乙基-N-亞硝基脲(ENU) Me N , O 核酸 50% 磷酸酯烷化 烷化劑直接致癌 DMS G

14、-O6 : G-N7 = 0.004 : 1 MNU G-O6 : G-N7 = 0.08 : 1 ( 肝 ) G-O6 : G-N7 = 0.15 : 1 ( 腦 ) G-N7(Me)不改變G:C配對 G-O6(Me)不影響 DNA pol,但改變堿基對, G T b. 鹵化反應 嘧啶 5 位 5-FU 抗癌藥 鹵素分子 嘌呤 8 位 8-BrPu 標記 c. 與醛類反應 堿基的環(huán)外環(huán)外 NH2AMP: N6-NH2GMP: N2-NH2 甲醛是DNA不可逆變性劑 鑒定 ssDNA or dsDNA 破壞RNA高級結構，消除結構對電泳遷移 率的影響 d. 核糖上的反應 核糖的氧化反應 核糖的

15、2，3-順二醇順二醇被高碘酸( HIO4)氧化成順二醛順二醛，胺催化 -消除反應消除反應，同時堿基脫落, 生成磷酸，堿基和糖碎片。 5-Nt 定量測定 RNA 序列測定 核糖的脫水反應 酸性條件下，核糖或脫氧核糖脫水產物與試劑反應生成有色物質?？捎枚ㄌ欠ū壬珳y定 DNA or RNA 含量。 苔黑酚法測RNA 核糖 糠醛 二苯胺法測 DNA 脫氧核糖 - 羥基 - 酮基戊醛-3H2O-2H2O六. 核酸組分的分離鑒定 1. 分離 a. 電泳分離 Nt and dNt Nt (dNt ) 的解離及pK值 pH3.5 ， Nts 間凈電荷 差異最大. ADP質子化狀態(tài)質子化狀態(tài) b. 層析 離子交

16、換層析 高效液相層析 ( HPLC ) 稀有成分纖維素薄板雙向層析 靈敏, 快速, 穩(wěn)定。 20種 3- Nt, 22種 5- Nt, 40種 Ns, 14種抗水 解 NmNp dimer. AmGp GmAp CmUp UmCp2. 鑒定 a. 標準品對照(電泳,層析) UV吸收檢出 吸收 UV藍紫色斑點, G藍色熒光, D無吸收。 b. 紫外光譜鑒定 溶液樣品在 220-290nm 波長內掃描, 確定 max and min , 對照參數(shù)(特定pH )。 例: pH 6-7 max min A 260 227 G 253 223 C 271 250 U 262 230 T 267 236

17、不同波長下吸收比值 A250/A260 A280/A260 A290/A260 注意點: 一般 max 250-280, min 220-250 吸收曲線特征與pH 相關, pH 1,7,12 下測定。 Base 與 Ns 吸收值差異大 NsdNsNm NsNtdNt Gua類在酸性時,UV下蘭色熒光,光譜曲線有 肩。 稀有成分的吸收光譜特征常不同于常見成分 一. 細胞中的核酸 1. 存在狀態(tài) 與蛋白質結合 (除 tRNA ) 2. 分布 DNA : 原核 核質區(qū) 真核 95%核內 5%核外（mt,ct ) RNA : 原核 胞質 真核 90%質(15%細胞器） 10%核 3.含量 少, 細胞

18、干重5-15%, 1015-1010g / cell 4.大小 RNA 104-106 Da DNA 106 Da二.制備中注意事項 保持生物學功能,具有生物活性 分子完整,天然狀態(tài)(未變性) 1.簡化步驟 2.避免高溫 0-4 3.避免過酸或過堿 pH 5-9 4.防止機械剪切作用（shearing ) 5.防止核酸酶降解作用 5. 防止核酸酶降解作用 a. DNase 活性需要 Me2+( Mg 2+, Ca2+, Mn2+) 螯合劑 SSC 檸檬酸三鈉-NaCl EDTA-Na2 乙二胺四乙酸鈉 ( Me2+) EGTA 乙二醇二氨基乙醚四乙酸 (Ca2+ 特異性) b. RNase 活

19、性不需Me2+，熱穩(wěn)定，回復能力強. 防止外源RNase污染 污染源：器皿、溶液、操作者 措施 180高溫處理數(shù)小時 0.1% DEPC（二乙基焦碳酸鹽)處理 O O蛋白變性劑 C2H5OCOCOC2H5 共價修飾RNase 操作者 抑制內源RNase 盡早、徹底去蛋白 非專一性吸附劑 RNase 堿性蛋白（pI 9.6）,中性pH下 靜電吸附皂土、復合硅酸鹽（Macaloid）、多聚陰 離子（肝素、聚乙烯硫酸酯） 蛋白變性劑異硫氰酸胍、SDS （十二烷基硫酸鈉）破細胞同時使 RNase 失活 RNase 抑制劑 RNasin 465aa 酸性蛋白（鼠肝、人胎盤）與RNase結合，保護RNA,

20、 不用于提取 核苷酸底物類似物競爭性抑制劑 ApUp RNaseA G2-5G RNaseT1三. 核酸的分離提取 總核酸目的核酸 細胞器 目的核酸 1.破細胞 物理法物理法石英沙研磨、超聲、勻漿、搗碎器 化學法化學法去污劑、蛋白變性劑破膜 生化法生化法溶菌酶、蛋白酶動、植物材料液N2, 機械破碎細菌溶菌酶水解肽聚糖破壁培養(yǎng)細胞去污劑與蛋白酶破膜破膜用去污劑 SDSC12-H25-O-SO3 Na 0.5-2% 終濃度Na+ 1 M SDS影響 CsCl 梯度 Sarkosyl（十二烷基肌氨酸鈉）3% 終濃度 異硫氰酸胍 非離子型去污劑TritonX-100、Brij58 作用溫和、膜部 分破

21、2解聚核蛋白并除蛋白a.去污劑核酸 pI 2-2.5 SDS結合蛋白質濃 KAc + SDS SDS-K b有機溶劑酚、氯仿蛋白質變性劑酚、酚氯仿異戊醇、氯仿異戊醇注意：防剪切力（振蕩速度、大口吸管），處理酚（重蒸、緩沖液飽和、0.1% 8-羥基喹啉）cProteinase K 處理廣譜,水解力強,可在SDS,EDTA存在下作用3核酸的沉淀a乙醇核酸的 Na, K 鹽在乙醇中 調節(jié)鹽濃度：0.1M NaCl, 0.3M NaAc, 2.5M NH4Ac 加2-2.5V 冷乙醇（95%） 攪出DNA 或離心 70-75% 乙醇洗滌去鹽 除盡EtOH,干燥 溶于 TE (10mM TrisHCl

22、pH 8.0,1m MEDTA) 核酸濃度0.1g/ml , 加助沉淀劑 重復沉淀，補鹽! b異丙醇0.3 M NaAc, 0.6-1V 選擇性沉淀 DNA and 大RNA, 體積小，不需低溫放置沸點高，鹽，須 EtOH 洗滌 4. 雜質的去除 a. 小分子雜質 b. 多糖 樣品預處理 動物 饑餓 植物 暗化 選擇性沉淀 異丙醇 糖與小分子RNA不 CTAB（十六烷基三甲基溴化銨） CH3 | CH3(CH3)15N+CH3 + NA / CH3 CH3 CTANA NaNA (EtOH) + CTAAc（溶）（溶）Br-0.1M NaAc70% EtOH1% CTAB-0.35M NaCl

23、多糖溶解多糖溶解 c. RNA與DNA 互為雜質 DNP 溶于 1-2M NaCl RNP 溶于 0.14M NaCl 除RNA RNase( 100,15min 處理,除DNase) 除DNA RNase-free DNase 5. 保存 防止降解、變性 措施：滅菌、低溫、鹽濃度、pH、EDTA DNA TE buffer,4- 20, 70 % EtOH RNA 冰凍干燥、低溫6. 純度的初步鑒定 a. UV吸收曲線 b. UV吸收比值 DNA A260/A280 = 1.8 RNA A260/A280 = 2.0 核酸的含量測定(260nm,1cm 光徑) 1 A260 50g/ml d

24、sDNA 40g/ml ssDNA, RNA 36g/ml oligo Nts c. 膠電泳 定量, 定性四. 核酸的純化 1.超離心 a.類型 沉降速度法 被分離物質在強大的離心力場中因沉降速度沉降速度不同而分離. (速度區(qū)帶超離心). 沉降平衡法 被分離物質在離心時因浮密浮密度度 不同進行分離.(浮密度梯度 or 等密度梯度超離心). 浮密度是溶劑化密度,即核酸銫鹽水化物( CsCl,H2O,NA )的密度. 不同介質下,核酸的不同. CsCl DNA=1.71 ;Cs2SO4 DNA=1.45 pH 不同,堿基結合 Cs量不同,值不同. 沉降速度超離心沉降速度超離心 沉降平衡超離心沉降平

25、衡超離心原理 沉降速度不同 浮密度不同梯度物質 蔗糖 0-70% CsCl 0-7.355M 密度1-1.3470 密度1-1.9052 NA密度 包含DNA1.71離心力場 強 5-6萬rpm 稍強 3-5萬rpm NA CsCl 成梯度分子運動 向管底 5S 小 or 于等密度處 16S rRNA (ds,ss,cc,oc,l 23S 大 DNA RNA )離心時間 較短 免于管底 長 1-2 天時間過長 失敗 不變操作 制備梯度鋪樣離 CsCl+樣品混勻 心收集 離心收集應用 RNA,ssDNA,限制性 DNA 酶切片段 b.沉降平衡超離心法的應用 測 測(G + C)% =1.660

26、+ 0.098 (G + C)% 天然、線狀、ds DNA , 修飾少. (G + C)% 20 80% RNA , DNA 和蛋白質的分離 中性CsCl RNA 1.9 , DNA 1.7 , 蛋白1.3-1.4 : RNA RNADNA DNA 蛋白質 值不同的dsDNA的分離 (值差0.01-0.02) 影響 值的因素： (G + C)% 甲基化 , 重原子取代 N15 N14 重金屬原子結合 Cs2SO4 Ag+ GC-rich Hg2+ AT-rich 堿性 CsCl 離心分離DNA 兩條互補鏈 dsDNA變性 pH12-12.5 CsCl 離心 兩個 峰（兩條ssDNA） 變性DN

27、A 輕鏈（L） 重鏈（H） G + T 比例高， 大 pH 12 下, G-N1 and T-N3 解離，結合 Cs+ 多， 升高. 分離不同構型DNA DNA 結合具插入作用藥物(溴乙錠 EB), 值降低. cc, oc和 l DNA 結合藥物的量不同, 變化不同. ccDNA結合少；oc和l DNA結合多. 純化質粒ccDNA , 除RNA , oc ,l DNA 和染色體 DNA. 2. 膠電泳 快速、簡便、設備簡單、樣品用量少 a.原理 核酸 pI=2-2.5 , pH 8-8.3 時, NA帶負電荷. * Pi pK1= 1 , pK2=6 完全解離 * -+NH= -NH= pK=

28、2.4-4.4 完全解離 * -NH- -N- + H+ pK=9.4-10 基本未解離 核酸分子大小不同,荷質比相同.荷/質 = n+1/n 電泳緩沖液: TAE Tris-NaAc-EDTA pH 8.3 TBE Tris-Boric acid-EDTA pH 8.3 - b.膠類型的選 agarose gel 0.250kb (恒電場) 3010,000kb (交變脈沖電場） PAGE 51000 bp , 分辨率1bp 192-5-13-29 -32-39 -49-60溫度溫度(電壓電壓)對遷移率的影響對遷移率的影響鹽濃度對遷移率的影響鹽濃度對遷移率的影響c.核酸高級結構對分離的影響 分子量相同,構型不同,遷移率不同 遷移率: cc l oc ccDNA超螺旋數(shù)不同,遷移率不同 ssDNA or RNA分子內折疊影響遷移率 變性膠(脲、甲酰胺），醛處理RNA 線狀DNA的形狀 彎