規(guī)范血液及骨髓標本細菌學標準操作規(guī)程

1、1. 目的規(guī)范血液及骨髓標本細菌學標準操作規(guī)程，確保檢驗結果準確可靠。2. 適用范圍血液及骨髓。3. 標本3.1 標本類型血液及骨髓。3.2 標本采集 采血時間抗菌藥物治療前，發(fā)熱初期或高峰時抽血。 采血頻率對懷疑菌血癥的成人患者，推薦同時在不同部位采集23套（每套包括一瓶需氧瓶，一瓶厭氧瓶或者兩套需氧瓶）對感染性心內(nèi)膜炎和真菌血癥則應多次采集；嬰幼兒患者，推薦同時在不同部位采集2套，可不做厭氧培養(yǎng)。 采血量以無菌方法從患者肘靜脈或股動脈采血。采血量以培養(yǎng)基的1/10為宜，成人一次采血10-20ml，兒童為3-5ml。血液抽出后，立即以無菌操作注入血培養(yǎng)瓶，充分混合后送檢。 骨髓標本用骨髓穿刺

2、針從髂骨采集1-2ml,立即以無菌操作注入血培養(yǎng)瓶，由于骨髓標本量少可選擇小兒需氧瓶及厭氧瓶。3.3 標本拒收標準 血培養(yǎng)瓶破裂或有明顯污染。 培養(yǎng)瓶標識與化驗申請單不符。 用過期的培養(yǎng)瓶采集標本，采血量不足等。 對于不合格標本，應及時通知采集人員重新留取標本。3.4 標本保存采集標本后立即送到實驗室，不能及時送檢可置室溫，切勿放冰箱。冬季血培養(yǎng)瓶在送檢過程應采取一定的保暖措施。4. 試劑、儀器4.1 革蘭染液、氧化酶試劑、3%觸酶、血瓊脂平板、巧克力平板、中國藍平板、沙保羅平板相關生化試劑等。4.2 BACT 9050全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)、ATB Expression鑒定及藥敏分析儀。成人需氧血

3、培養(yǎng)瓶，厭氧血培養(yǎng)瓶、兒童血培養(yǎng)瓶、TDR系統(tǒng)鑒定卡及藥敏板。4.3 接種針、接種環(huán)、電熱灼燒器、顯微鏡、孵育箱、CO2 培養(yǎng)、生物安全柜等。4.4 試劑的有效期和使用參照試劑說明書。5. 細菌鑒定和藥敏質(zhì)控參見微生物組室內(nèi)質(zhì)量的控制程序。6. 檢驗步驟接收標本后，立即用Lis系統(tǒng)簽收對標本進行編號、登記。門診病人要同時登記聯(lián)系電話等病人信息。6.1 自動化培養(yǎng) 置全自動血培養(yǎng)儀中。當標本有菌生長時，儀器發(fā)出陽性報警，應立即用無菌注射器抽取瓶內(nèi)培養(yǎng)液作直接涂片革蘭染色，鏡檢，將結果向臨床醫(yī)生報告，同時轉(zhuǎn)種血瓊脂平板，中國藍平板或加做巧克力平板，并進行直接藥敏試驗，置35、5% CO2 培養(yǎng)箱培

4、養(yǎng)1824h。若涂片為酵母樣真菌時，轉(zhuǎn)種到念珠菌培養(yǎng)基上。從瓊脂平板上挑取菌落進行涂片染色及觸酶和氧化酶試驗。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌分別選用相應卡片上機進行細菌鑒定和藥敏試驗或者做K-B法藥敏試驗（具體操作見藥物敏感性試驗標準操作規(guī)程）。儀器培養(yǎng)為陰性，報陰性后卸下血培養(yǎng)瓶，可報陰性結果。6.2 手工培養(yǎng) 將血培養(yǎng)瓶置35孵育箱，經(jīng)1820 h孵育在血瓊脂平板或巧克力平板上盲目轉(zhuǎn)種一次。 盲目傳種后，培養(yǎng)瓶繼續(xù)孵育至第5日，每日觀察一次有無菌生長，并搖勻繼續(xù)培養(yǎng)，下列幾種情況提示有細菌生長。見下表1。表1 培養(yǎng)瓶中有細菌生長時的不同反應 反應 菌種渾濁并有凝塊 金黃色葡萄球菌均勻渾濁，發(fā)酵葡萄

5、糖產(chǎn)氣大多為革蘭陰性菌微渾濁，有綠色變化肺炎鏈球菌表面有菌膜，培養(yǎng)液清晰，底層溶血枯草桿菌表面有菌膜，膜下呈綠色渾濁銅綠假單胞菌血細胞層上面出現(xiàn)顆粒狀生長，有自上而下的溶血溶血性鏈球菌厭氧培養(yǎng)瓶有變化，而需氧培養(yǎng)瓶無細菌生長可能為厭氧菌根據(jù)肉眼觀察，對有細菌生長跡象，取菌懸液涂片作革蘭染色，同時分離培養(yǎng)，接種需氧血瓊脂平板，中國藍平板或加做巧克力平板，并進行直接藥敏試驗，置35、5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)1824h。次日純培養(yǎng)再進行鑒定及藥敏試驗。7. 操作流程血液、骨髓置血培養(yǎng)儀瓶中厭氧培養(yǎng)需氧培養(yǎng)血培養(yǎng)儀報警，挑取培養(yǎng)物涂片、染色細菌種類轉(zhuǎn)種平板35培養(yǎng)1824 h直接藥敏二級報告一級報告觀察

6、菌落特征及涂片、染色儀器或手工細菌鑒定及藥敏試驗三級報告（最終報告）8. 結果報告8.1 陽性結果報告報告通常分為三級：一級報告陽性報警血培養(yǎng)瓶應進行涂片革蘭染色，將涂片結果電話（或其他方式）通知臨床，同時記錄報告的日期、時間、內(nèi)容以及接收報告人的姓名和工號。血培養(yǎng)陽性應列為危急值。 二級報告報告直接藥敏試驗結果。直接藥敏試驗，將血培養(yǎng)陽性標本進行革蘭染色，如涂片找到細菌，根據(jù)革蘭染色結果選擇藥敏所用培養(yǎng)基（Muller-Hinton或含5%羊血Muller-Hinton瓊脂平板），取陽性血培養(yǎng)標本約0.2ml，用無菌棉簽均勻涂布于瓊脂表面，根據(jù)革蘭染色結果選擇所用抗菌藥物的紙片，如鏡檢見革蘭

7、陰性桿菌，選擇腸桿菌科常用的抗菌藥物紙片；若為革蘭陽性球菌，成對排列，選擇葡萄球菌用的抗菌藥物紙片。然后置35，孵育1824h讀取初步藥敏結果。純培養(yǎng)再進行菌株鑒定和藥敏試驗，發(fā)最終報告。注：最終結果如與初步報告不符，應及時與臨床溝通，并在書面最終報告注明變更內(nèi)容。 三級報告報告細菌種屬、藥敏試驗、結果評價和建議。8.2 陰性結果報告血培養(yǎng)72h未見細菌生長，應通知臨床醫(yī)師，以便作相應處理，但培養(yǎng)瓶要繼續(xù)培養(yǎng)至第5日，方可發(fā)出陰性報告。如果發(fā)現(xiàn)有菌生長，可補發(fā)報告。8.3 對發(fā)出報告進行銷號，并作好菌名或無菌及報告日期登記。8.4 傳染?。▊ι抽T菌）報醫(yī)務部或防保科。8.5 傳染病菌種保存(

8、傷寒沙門菌)交疾病控制中心復核。9. 注意事項9.1 抽血后無需更換針頭即可注入血瓶中。9.2 抽血前即應貼好標簽，標簽不能貼到條形碼。9.3 若不能立即送至實驗室，應置于35溫箱或室溫，絕不可放置冰箱。9.4 有自動血培養(yǎng)儀的實驗室，應及時處理陽性報警標本。9.5 如不同部位采集的兩瓶血培養(yǎng)瓶出現(xiàn)一瓶陽性一瓶陰性，或者出現(xiàn)兩瓶均為陽性，檢測結果均為凝固酶陰性葡萄球菌， 這兩種情況都應該向臨床報告和溝通。10. 臨床意義引起敗血癥的多為耐藥性金黃色葡萄球菌、某些革蘭陰性桿菌及部分球菌。癤、癰、膿腫和化膿性骨髓炎繼發(fā)的敗血癥主要由金黃色葡萄球菌和溶血鏈球菌引起，尿道、膽道、胃腸道炎癥和黏膜損傷引

9、起的敗血癥以大腸埃希菌最常見，燒傷后銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌多見。傷寒和副傷寒于病程第12w做血液細菌培養(yǎng)，傷寒和副傷寒沙門菌的檢出率可達80%90%。11. 危急值報告儀器報警陽性標本直接涂片、革蘭染色，確定細菌種類，應立即向臨床報告細菌涂片結果。參考文獻1 CNAS-GL23醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的應用指南, 20132周庭銀編著. 臨床微生物學診斷與圖解. 第二版. 上海: 上?？茖W技術出版社, 20073 葉應嫵, 王毓三, 申子瑜主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程. 第3版 .南京: 東南大學出版社。4 Murray PR. Manual of Clinica

10、l Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 20075 徐英春, 倪語星, 王金良, 等主編. 血培養(yǎng)操作規(guī)范. 上海: 上海科學技術出版社, 2002血液操作規(guī)程1概述血液是臨床微生物室所接收培養(yǎng)的重要標本，在大多數(shù)病人血液中出現(xiàn)細菌為菌血癥。原發(fā)性菌血癥來自機體部位污染細菌，如粘膜的細菌入血，可能經(jīng)歷亞臨床結果，繼而出現(xiàn)臨床的菌血癥。敗血癥包含菌血癥，意指帶有臨床跡象和癥狀，如發(fā)熱、寒戰(zhàn)和心動過速。敗血癥休克提示敗血癥伴有血壓過低，嚴重敗血癥是以敗血癥休克伴有器官或全身衰竭特點，20%-40%死亡率。繼發(fā)性菌血癥，如肺炎原始部位的感染播散菌血

11、癥。2標本采集2.1 一般情況下，在病人發(fā)熱高峰時，采集血液標本。對持續(xù)性菌血癥可不考慮采血時間，而某些間歇性菌血癥，應在病人體溫上升期采血。采血時間原則上應選擇在抗菌藥物應用前，對已用藥而不能中止用藥的病人，應在下次用藥前采集。用藥前24小時內(nèi)采集34次血液標本，可使細菌檢出率高達90。2.2一般在肘靜脈采集血液，其次是股動脈。采血部位的局部皮膚應徹底消毒，通常用碘酒涂布消毒，干后用75酒精擦拭，消毒時應以穿刺部位為中心逐漸向外延伸消毒。2.3系上止血帶，抽取5-10ml血液，若為嬰兒或小孩則只抽取2-5ml血液。2.4將液注入BD血培養(yǎng)瓶，嬰兒或小孩則用小兒專用BD血培養(yǎng)瓶。2.5疑似分枝

12、桿菌感染或霉菌感染之病人則抽取血液10ml，注入血液于專用結核培養(yǎng)瓶或真菌培養(yǎng)瓶。3標本處理及注意事項3.1 每一發(fā)燒病人抽血次數(shù)以每次抽二瓶為原則，同時左右肘臂各抽一瓶。如果病患情況危急，同時亦可采集身體不同部位血液做兩套培養(yǎng)。但是不可由血管導管抽取血液樣本。3.2 抽取血液后，不需要更換針頭即可注入血瓶中，以避免針扎后污染率提高。3.3 抽血前，血瓶應先將病患標簽貼好，病患標簽不可貼在血液培養(yǎng)瓶的條碼上及玻璃上。3.4 注入標本的血培養(yǎng)瓶務必立即送至微生物室。如因某種原因不能立即送檢時，應放置室溫，切勿存放冰箱。微生物室收到血培養(yǎng)瓶后應立即登記后放入培養(yǎng)箱。3.5 兩種以上細菌或細菌和真菌

13、同時或交替感染引起的敗血癥，雖其中有一種主要致病菌，但必須同時報告。對檢出的細菌肯定是血中的病原菌的標準是：兩次血培養(yǎng)結果為同一細菌。患者23周后血中抗體滴度明顯升高，應作敗血癥的病原菌處理。3.6 對于血培養(yǎng)中出現(xiàn)的細菌，如果暫時鑒定不了或罕見細菌，可作藥物敏感試驗，將結果報告臨床醫(yī)生。同時將菌種報上一級單位繼續(xù)鑒定。4檢驗步驟.(血液培養(yǎng)儀BACTEC 9050操作規(guī)程)4.1 放入培養(yǎng)瓶4.2 開門前按復位鍵，打開機箱門。4.3 按放瓶鍵4.4 拿瓶子上的條形碼在機器右下角發(fā)紅光處掃描，聽到叫聲后掃描完畢。4.5 根據(jù)屏幕顯示的位置放入培養(yǎng)瓶。4.6 按OK鍵4.7 按關門鍵退出，關門。

14、4.8 取出陰/陽性瓶4.9 開機前按復位鍵，開門。4.10 按陰性瓶鍵/陽性瓶鍵指定位置選擇取出陰/陽性瓶4.11 將陰/陽性瓶上的條形碼掃描。4.12 按關門鍵退出，關門。4.13 若有陽性瓶，儀器將會自動報警，按以上方法取出陽性瓶，直接涂片鏡檢，并轉(zhuǎn)種相關培養(yǎng)基。5分級報告5.1 緊急口頭（電話）報告：血培養(yǎng)儀在血液出現(xiàn)陽性時會自動報警，接到報警，將儀器上培育瓶取出，立即進行轉(zhuǎn)種血平板；涂片革蘭染色；鏡檢。并在最短時間內(nèi)將結果向臨床主管醫(yī)生進行緊急口頭（電話）報告。報告內(nèi)容應包含以下內(nèi)容：5.1.1 報告者全名（或工號）；5.1.2 報告的時間（無論成功或不成功）；5.1.3 所聯(lián)系醫(yī)生

15、的全名（或工號）；5.1.4 報告鏡檢結果,并強調(diào)其緊急價值；5.1.5 確認臨床醫(yī)生收到報告并復述結果。5.2 做直接藥敏試驗，第二天報告結果。5.3 按涂片、染色、純分血平板菌落形態(tài)，選擇相應的方法作進一步鑒定及藥敏試驗。陽性培養(yǎng)報告最終鑒定結果、最終藥敏結果。6其他報告和記錄 如血液培養(yǎng)儀沒有報警，每天必須觀察一次，作好記錄。五天陰性者，可報告：血液培養(yǎng)五天無細菌生長。6.1 標本被拒收時，應立即通知臨床醫(yī)生，立即重新采血，并記錄在案。6.2 最終結果與緊急報告結果不符，需變更時，應立即與臨床醫(yī)生溝通，做緊急口頭報告。同時必須在書面報告上提供正確的結果，同時注明變更的內(nèi)容。6.3 其他需

16、要臨床醫(yī)生注意的事項如：本次采血量不足；標本轉(zhuǎn)運時間過長；標本采集份數(shù)不夠等信息。7檢驗結果的判斷與分析7.1 急性敗血癥、腦膜炎、骨髓炎、關節(jié)炎、急性未處理的細菌性肺炎和腎盂腎炎，應該在治療前從不同部位采集血液標本，分別接種于需氧、厭氧血培養(yǎng)瓶內(nèi)。7.2 可疑為心內(nèi)膜炎，體溫不太高的持續(xù)菌血癥，應增加采血次數(shù)。7.3 急性病例：治療前在1-3h內(nèi)在3個不同部位取3份標本。7.4 亞急性病例：第1天取3個標本，24h后，若全陰性再取3個標本。7.5 若已用了抗生素的心內(nèi)膜炎患者，連續(xù)3天每天取2個標本。7.6 已用抗生素治療的其他患者，在48h內(nèi)取6個血標本，每次在使用抗生素前采標本。8血液培

17、養(yǎng)中常見的病原菌 革蘭陽性菌: 革蘭陰性菌: 葡萄球菌屬 腦膜炎奈瑟菌 鏈球菌屬 卡他莫拉菌 腸球菌屬 傷寒及副傷寒沙門菌 厭氧鏈球菌 腸桿菌科細菌 李斯特菌屬（產(chǎn)單核） 假單胞菌屬 產(chǎn)氣莢膜梭菌 不動桿菌屬 丙酸桿菌 流感嗜血桿菌 念珠菌 彎曲菌屬 擬桿菌屬 梭桿菌屬9操作流程 血液、骨髓 （需氧及厭氧）涂片、染色、鏡檢 分離培養(yǎng) 直接藥敏試驗 需氧培養(yǎng) 真菌培養(yǎng) 厭氧培養(yǎng) 35 及CO環(huán)境培養(yǎng) （血瓊脂平板 46h（血瓊脂平板和 等分離培養(yǎng)基） 巧克力瓊脂平板） 初步報告 菌落觀察 涂片、革蘭染色、鏡檢 純培養(yǎng) 血清學檢查 確定報告 生化反應試驗、藥敏試驗 最終報告參考文獻全國臨床檢驗操作

18、規(guī)程（第3版）BACT9050血培養(yǎng)儀使用說書1. 目的規(guī)范腦脊液標本細菌學標準操作規(guī)程，確保檢驗結果準確可靠。2. 適用范圍腦脊液培養(yǎng)。3. 標本3.1 標本類型腦脊液。3.2 標本采集由臨床醫(yī)師以無菌要求做腰椎穿刺，抽取腦脊液2ml3ml，盛于無菌容器中送檢。腦膜炎奈瑟菌離體后能產(chǎn)生自溶酶，迅速自溶，肺炎鏈球菌及流感嗜血桿菌離體后也易死亡。因此，腦脊液無論涂片或培養(yǎng)，必須于采集后立即送檢。3.3 標本拒收標準 標本標識與化驗申請單不符。 標本未用無菌試管留取。3.4 標本保存采集標本后立即送到實驗室，不能及時送檢可置室溫，放置時間不應超過2h，切勿放冰箱，否則影響檢出率。4. 試劑、儀器4

19、.1 革蘭染液、氧化酶試劑、3%觸酶、血瓊脂平板、巧克力平板、中國藍平板、相關生化試劑等。4.2藥敏紙片、ATB板條/TDR系統(tǒng)鑒定卡及藥敏板等，有效期及儲存條件參見試劑說明書。4.3 接種針、接種環(huán)、電熱灼燒器、顯微鏡、孵育箱、CO2 培養(yǎng)箱等。5. 細菌鑒定和藥敏質(zhì)控參見質(zhì)量管理。6. 檢驗步驟接收標本后，立即對標本進行編號、登記。6.1 涂片檢查 一般細菌涂片檢查外觀混濁或膿樣腦脊液可直接涂片，無色、透明的腦脊液，應3000r/min 10min15min離心后取沉淀物涂片、革蘭染色、鏡檢。根據(jù)染色及形態(tài)特征，?？沙醪教崾炯毦姆N類。 新生隱球菌涂片檢查取腦脊液的離心沉淀物作墨汁負染色，

20、或取腦脊液的離心沉淀物接種于沙氏培養(yǎng)基上，置于35培養(yǎng)2日5日，根據(jù)菌落特性，涂片染色鏡檢作出報告。必要時可作生化反應進一步鑒定。 6.2 分離培養(yǎng) 用接種環(huán)挑取混濁腦脊液或經(jīng)離心沉淀的沉淀物，分別接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和中國藍平板，置于5%10%CO2 環(huán)境中35培養(yǎng)1824 h，觀察細菌生長情況，根據(jù)菌落特點、形態(tài)與染色及生化反應鑒定細菌，并作藥敏試驗。7. 操作流程腦脊液離心觀察菌落特征及涂片、染色血瓊脂平板、巧克力平板、中國藍平板5% CO2 35培養(yǎng)18-24h發(fā)出報告儀器或手工細菌鑒定及藥敏試驗沉淀物涂片、染色8. 結果報告無論是涂片還是培養(yǎng)，一旦檢測到陽性細菌應立即電話

21、或書面通知臨床醫(yī)師。查見細菌，報告菌名和藥敏結果。經(jīng)培養(yǎng)48h，仍無細菌生長者，報告“培養(yǎng)2日無細菌生長”。9. 注意事項9.1 抽取的腦脊液分置于無菌試管中，迅速送至實驗室，病毒、霉菌、分支桿菌培養(yǎng)樣本置4 保存待送。9.2 流感嗜血桿菌容易在外界環(huán)境中死亡，腦膜炎奈瑟菌對寒冷和干燥均很敏感，在體外容易自溶，故不論是涂片鏡檢還是進行培養(yǎng)均應及時送檢。10. 臨床意義正常人的腦脊液是無菌的，檢出細菌提示細菌性（急性化膿性或結核性等）腦膜炎?；撔阅X膜炎最多見腦膜炎奈瑟菌，肺炎鏈球菌居第二位。5歲以下兒童細菌性腦膜炎的主要致病菌是流感嗜血桿菌，結核分枝桿菌引起結核性腦膜炎。85%腦膿腫患者腦脊液

22、培養(yǎng)可檢出厭氧菌，有時可為厭氧菌和需氧菌混合感染。11. 危急值報告直接涂片找到細菌或培養(yǎng)陽性均作危急值報告。若檢測出腦膜炎奈瑟菌則應做傳染病報告。參考文獻1 CNAS-GL23醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的應用指南, 20132周庭銀編著. 臨床微生物學診斷與圖解. 第二版. 上海: 上?？茖W技術出版社, 20073 葉應嫵, 王毓三, 申子瑜主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程. 第3版 .南京: 東南大學出版社, 20064 Murray PR. Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 20

23、075 ISO15189:2007醫(yī)學實驗室-質(zhì)量和能力認可準則, 20071. 目的規(guī)范呼吸道標本細菌學標準操作規(guī)程，確保檢驗結果準確可靠。2. 適用范圍呼吸道標本培養(yǎng)和涂片檢查。3. 標本3.1 標本類型痰、咽拭、支氣管肺泡灌洗吸出液、支氣管沖洗液或刷子、肺穿刺等。3.2 標本采集 采集時間以晨痰為好；支氣管擴張癥患者，清晨起床后進行體位引流，可采集大量痰標本。 自然咳痰法在留取痰之前，用清水反復漱口，應從氣管深部咳出痰，吐入無菌容器內(nèi)。 氣管鏡下采集法在病灶附近用導管吸或用支氣管刷直接取得標本。 氣管穿刺法在環(huán)甲膜下穿刺抽取痰液，收集標本，適用于厭氧菌培養(yǎng)。 棉拭采集法用無菌棉拭子輕輕擦

24、拭患者鼻咽部黏膜，留取標本，置無菌試管內(nèi)送檢。3.3 標本拒收標準 申請單姓名、科別、床號與標本的標簽不符。 痰標本呈水樣或唾液樣。 痰涂片白細胞25低倍視野。 標本容器溢漏，無瓶蓋。 痰標本留取放置時間太長，超過2h。 未用指定的無菌容器留痰作細菌培養(yǎng)。3.4 標本保存采集標本后立即送到實驗室，放置時間不應超過2h。4. 試劑、儀器4.1 革蘭染液、氧化酶試劑、3%觸酶、血瓊脂平板、巧克力平板、中國藍平板、相關生化試劑等。4.2藥敏紙片、ATB板條TDR系統(tǒng)鑒定卡及藥敏板等，有效期及儲存條件參見試劑說明書。4.3 接種針、接種環(huán)、電熱灼燒器、顯微鏡、孵育箱、CO2 培養(yǎng)箱等。5. 細菌鑒定和

25、藥敏質(zhì)控：參見質(zhì)量管理。6. 檢驗步驟接收標本后，立即對標本進行編號、登記。6.1 肉眼觀察包括顏色、黏度、有無血絲或膿。6.2 涂片檢查可以確定標本是否適合做細菌培養(yǎng)，直接涂片鏡檢，依據(jù)低倍鏡下觀察白細胞和上皮細胞數(shù)目多少來評定，見下表5-30。并可初步判定是否有病原菌存在。表5-30痰標本鏡下分類分級白細胞（個）上皮細胞（個）A252525C25注：A、B兩種情況的痰標本適合做培養(yǎng)，C不合格，應重新留標本。 一般細菌涂片挑取膿性或血性痰液制成薄而均勻的涂片，革蘭染色后鏡檢。 結核分枝桿菌涂片參見結核分枝桿菌檢驗操作規(guī)程。放線菌及諾卡菌涂片將痰液用生理鹽水洗滌數(shù)次，如含血液，則加水溶解紅細胞

26、， 然后挑取黃色顆?；虿煌该鞯闹唿c，置載玻片上，覆以蓋玻片，輕輕擠壓，置高倍鏡下觀察其結構，如見中央為交織的菌絲，末端呈放線狀排列，則揭去蓋玻片，干燥后作革蘭及萋-尼染色鏡檢。如查見中間部分的菌絲為革蘭陽性，而四周放射的末端為革蘭陰性，萋-尼染色為非抗酸性者，可報告為”找到革蘭陽性桿菌疑似放線菌”。萋-尼染色弱陽性則報告革蘭陽性桿菌疑似諾卡菌。6.3 分離培養(yǎng) 培養(yǎng)標本的選擇應選擇黏液膿痰作涂片，排除不合格標本。 痰標本培養(yǎng)前處理用無菌鹽水將痰洗滌或加入等量的1%胰酶溶液，使痰液均質(zhì)化后備用。 接種痰液接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和中國藍（或EMB、中國藍）瓊脂平板，置510CO2 環(huán)

27、境中，35培養(yǎng)1824 h。根據(jù)菌落及形態(tài)特點，作出初步判斷，然后按各類細菌特征進行生化鑒定，并同時作藥物敏感試驗。7操作流程發(fā)出報告儀器或手工細菌鑒定及藥敏試驗觀察菌落特征及涂片、染色消化液或生理鹽水處理痰或咽拭肉眼觀察涂片染色血瓊脂平板、巧克力平板、中國藍平板5%10% CO2 35培養(yǎng)1824 h7. 結果報告8.1 報告的各細菌種可注明各自所占比例情況，可分為純培養(yǎng)，大量，中等量，少量。8.2 未檢出致病菌時應報告“正常菌群”。8. 注意事項9.1 痰標本一般不可采用肉湯或高選擇性培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)。9.2草綠色鏈球菌為口腔和鼻咽部的正常菌群，其毒力很低，但由拔牙等原因造成的局部損傷中

28、侵入血流，可引起亞急性細菌性心內(nèi)膜炎等感染，故從血液中分離出草綠色鏈球菌有臨床意義。9.3 咳痰標本不做厭氧菌培養(yǎng)。9. 臨床意義上呼吸道標本培養(yǎng)生長的細菌是否與疾病有關，需各方面綜合分析，排除常居菌后，才可作出正確的判斷。下呼吸道的痰液應是無細菌的，而經(jīng)口腔咳出的痰帶有多種上呼吸道的正常寄生菌（如草綠色鏈球菌）。若從患者痰標本中查見致病菌或條件致病菌，提示可能有呼吸道細菌感染。肺炎鏈球菌是肺炎最常見的致病菌。兒童細菌性肺炎多為流感嗜血桿菌所致。醫(yī)院獲得性肺炎的常見病原菌是革蘭陰性桿菌，主要有肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、沙雷菌屬和腸桿菌屬細菌等。肺結核由結核分枝桿菌引起的。嗜肺軍團菌引起軍團菌

29、病，肺部厭氧感染大多是脆弱類桿菌及梭桿菌屬的細菌等。疑典型形態(tài)細菌所致肺部感染時，常先做痰液和支氣管分泌物涂片、染色鏡檢（如肺部結核痰液涂片、抗酸染色，鏡檢找抗酸染色陽性結核分枝桿菌，有助于細菌培養(yǎng)檢查。10. 危急值報告如查出抗酸桿菌陽性，則應及時向臨床報告并作報傳染病報告。參考文獻1 CNAS-GL23醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的應用指南, 20132周庭銀編著. 臨床微生物學診斷與圖解. 第二版. 上海: 上?？茖W技術出版社, 20073 葉應嫵, 王毓三, 申子瑜主編.全國臨床檢驗操作規(guī)程. 第3版 .南京: 東南大學出版社, 20064 Murray PR.

30、Manual of Clinical Microbilogy. 9th ed. Washington: ASM Press, 20075 ISO15189:2007醫(yī)學實驗室-質(zhì)量和能力認可準則, 2007操作規(guī)程：1眼、耳、鼻和咽拭子樣本采集：1.1采集眼、耳、鼻、咽拭子時易被粘膜上的正常菌群污染，應在采集時注意。1.2采集眼分泌物時，應先用無菌生理鹽水沖洗眼部，然后用棉拭子拭干，再以無菌棉拭子采取分泌物。1.3若從鼻腔采樣本作培養(yǎng)，可用一支無菌棉花拭子（其尖端之棉花必須緊密）直接插入鼻腔，應避免用大而疏松的棉花拭子，因其可能滑落，甚至陷于病人鼻腔中。1.4若從咽喉采集樣本作培養(yǎng)，須在光線充

31、足下，壓住舌根采集扁桃體兩側(cè)分泌物，以防樣本干燥，采集時盡量避免接觸舌頭和唾液。2樣本處理：涂片檢查：拭子直接在玻片上涂片，根據(jù)臨床提示決定涂片的數(shù)量。2.1革蘭染色：所觀察到的細菌染色性及形態(tài)報告結果。咽部或口腔拭子還應注意是否有革蘭染色陰性的硫螺旋體和粗大梭形桿菌，確定有否奮森螺旋體和梭形桿菌感染。2.2疑為白喉感染，除已證實為革蘭陽性桿菌處，還須用異染顆粒染色法，鏡檢異染顆粒。2.3疑有念珠菌感染，可以濕片直接在高倍鏡下檢查芽生孢子和假菌絲。2.4麻風分枝桿菌檢查：可取鼻粘膜拭子涂片做抗酸染色檢查。3培養(yǎng)步驟：3.1增菌培養(yǎng)：眼內(nèi)和內(nèi)耳拭子可增菌培養(yǎng)。應選用適于需氧和厭氧菌生長的培養(yǎng)基增

32、菌。增菌的拭子應不被正常菌群污染，否則，增菌培養(yǎng)會使致病菌因正常菌群過度生長而抑制，產(chǎn)生錯誤的假象。3.2分離培養(yǎng)：一般培養(yǎng)：根據(jù)這些部位感染細菌的特點，須用血平板和巧克力平板作分離培養(yǎng),必要時加選中國藍瓊脂。在CO2環(huán)境中培養(yǎng)1824h，此時長出的肺炎鏈球菌很大，溶血特征明顯，十分容易識別，分離腦膜炎奈瑟菌時，接種血平板和專用巧克力平板，置CO2環(huán)境中孵育。其他致病菌經(jīng)純培養(yǎng)，ATB全自動鑒定后報告。白喉棒狀桿菌培養(yǎng)：血平板，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，當用接種環(huán)推移開血平板上菌落后可見菌落下有溶血血環(huán)。在亞碲酸鹽平板上，白喉棒狀桿菌的菌落顯黑色。流行性腦膜炎流行季節(jié)或流行區(qū)，采集凝似患者鼻咽拭子，接種于

33、含抗生素的巧克力瓊脂平板上，置CO2環(huán)境下孵育，分離培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌。4結果報告方式：4.1對正常無菌的器官如眼內(nèi)、內(nèi)耳標本，可報告檢出的細菌及敏感試驗結果。4.2鼻、喉拭子檢出病原菌時，可直接報告菌名和生長菌數(shù)量(純培養(yǎng)或占優(yōu)勢)及其藥敏試驗結果。4.3鼻咽拭子標本在出報告時，必須報告正常菌群量的多少，致病菌量的多少。用1+-4+表示。例如：正常菌群在平板的二段劃線均生長，為2+；致病菌在平板的三段劃線均生長，為3+。一般認為，致病菌的量必須大于或等于正常菌群的量，臨床上才有意義。5病原菌：5.1正常眼部是無菌的。5.2正常的中耳及鼻竇內(nèi)是無菌的。健康人的咽峽部有口腔的正常菌群。5.3耳、鼻

34、、咽部的細菌感染病原菌來源于口腔?？谇恢屑扔行柩蹙灿袇捬蹙?，所以，其周圍組織器官的感染不僅考慮是需氧菌，也須檢查厭氧菌。中耳炎、鼻竇炎及扁桃腺炎的病原菌分布情況見。5.4百日咳、白喉患者的咽部可以分離到相應的細菌，同時還可以分離出腦膜炎奈瑟菌。 眼、耳、鼻、喉拭子培養(yǎng)常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 金黃色葡萄球菌 腦膜炎奈瑟菌 肺炎鏈球菌 淋病奈瑟菌 溶血性鏈球菌 嗜血桿菌 白喉棒狀桿菌 莫拉菌 念珠菌 卡他布蘭漢菌 百日咳桿菌 腸桿菌科 假單胞菌屬 產(chǎn)堿桿菌屬6眼、耳、鼻、喉拭子操作流程： 眼、耳、鼻、喉拭子 涂片 血平板 血平板 肉湯 革蘭染色 巧克力 巧克力 中國藍 35過夜 血平

35、板 初步報告結果 CO25-10 中國藍純分 35過夜 35過夜 35過夜 純分 菌種鑒定 藥敏試驗 報告結果下呼吸道（痰）培養(yǎng)1樣本采集：所采取的痰樣本，必須真正能代表肺部之分泌物者，通常清晨時痰液最多，且可能含較多量病原菌，采集步驟如下：1.1以清水或牙刷清潔口腔及牙齒，不可用牙膏。1.2指導患者從呼吸道深部咳出痰（不可含有唾液），裝于無菌容器。若作結核菌培養(yǎng)時，應將標本置于4冰箱中保存待種。1.3痰涂片檢查：其一是為確定標本是否適合做細菌培養(yǎng)。采用的方法是直接涂片鏡檢，用無菌小竹簽挑取痰液的膿性或帶血部分，置于載玻片中，制成涂片。依據(jù)低倍鏡下觀察白細胞和上皮細胞數(shù)目的多少來判定。 白細胞

36、 上皮細胞 A 25 25 25 C 25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)，C不適合，應退回重留標本。其二是初步判定是否有病原菌存在。2樣本處理與檢查：2.1 一般細菌涂片檢查：挑選痰液中膿性或帶血部分，涂成均勻簿片，行革蘭染色，鏡檢。根據(jù)其細菌形態(tài)，排列和染色性，大致可以初步推定菌屬（或種）。如鏡見排列成葡萄狀的革蘭陽性球菌，可報告為：“找到革蘭陽性球菌，形似葡萄球菌”；如見到瓜子仁形或矛頭狀的尖端相背、成雙排列、具有明顯莢膜的革蘭陽性球菌時，可報告為：“找到革蘭陽性雙球菌、形似肺炎鏈球菌”；如查見短而粗的革蘭陰性桿菌，排列多成雙且有明顯莢膜時，可報告為：“找到革蘭陰性桿菌形似肺炎克雷白菌”；如

37、查見不易識別的細菌，則報告為：“找到革蘭性形細菌”。2.2 結核分枝桿菌涂片：直接涂片:以接種環(huán)取干酪樣或膿性部分的痰制成涂片，作抗酸染色。應查遍整個涂片，根據(jù)所見結果報告“找到(或未找到)抗酸性桿菌”。2.3 厭氧菌涂片檢查“涂片染色同一般細菌，鏡檢時注意有芽胞的革蘭陽性桿菌 (可能是芽胞梭菌屬)。如見芽胞位菌體不膨大，排列呈竹節(jié)狀，要注意炭疽需氧芽胞菌。兩端尖的革蘭 陰性桿菌(可能是梭桿菌)及革蘭陰性無芽胞桿菌，同時痰液有惡臭(可能是擬桿菌屬)，可根據(jù)細菌形態(tài)和染色作出報告，不能直接確定為厭氧菌。2.4 放線菌及奴卡菌涂片檢查：將痰液用生理鹽水洗滌數(shù)次，如含血液，則加蒸餾水溶解紅細胞，然后

38、挑取黃色顆粒(硫磺顆粒)或不透明的著色斑點，置載玻片上，覆以蓋玻片，輕輕擠壓，置高倍鏡下觀察其結構。如見中央為交織的菌絲，其末端較粗桿形呈放線狀排列。然后揭去蓋玻片，干后作革蘭及萋-納氏染色，鏡檢。2.4.1 如查見中間部分的菌絲為革蘭陽性，而四周放射的末梢菌絲為革蘭陰性，萋-納氏染色為非抗酸性者，可報告為“找到似放線菌”。2.4.2 如查見革蘭染色反應與放線菌相同，但萋-納氏染色為弱抗酸性時，可報告為“找到似奴卡菌”。3培養(yǎng)步驟：3.1 痰培養(yǎng)前的處理：（必要時）3.1.1 痰的洗凈：由于痰含有正常菌群，影響病原菌的檢出，采用以下方法以減少正常菌群。將痰加入含有15-20ml滅菌生理鹽水的試

39、管中，劇烈振蕩5-10秒，然后用接種環(huán)將沉淀于管底的膿痰小片沾出，再放入另一試管內(nèi)，以同樣的方法沾出，再放入另一試管內(nèi)，以同樣的方法反復二次，最后將剩余的膿痰接種在培養(yǎng)基上。3.1.2 痰均質(zhì)化：痰均質(zhì)化法以用胰酶均質(zhì)化為多見。其方法為向痰液內(nèi)加等量的pH7.6的1胰酶溶液，放置3790分鐘即能使痰液均質(zhì)化，而對細菌培養(yǎng)無甚影響，此外，還可選用玻璃研磨。3.2 選擇培養(yǎng)基：下呼吸道的病原菌種類繁多，除一般細菌外，還有結核菌、真菌、厭氧菌等。所以，除基本分離培養(yǎng)外，還須用特殊培養(yǎng)基和適當?shù)呐囵B(yǎng)環(huán)境。一般須用以下幾種分離方法。3.2.1 血平板適用于分離各類細菌，特別是-溶血性鏈球菌、葡萄球菌。血

40、平板放CO2或厭氧環(huán)境易于分離肺炎鏈球菌和-溶血性鏈球菌。3.2.2 巧克力平板于CO2環(huán)境下分離嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌。3.2.3 中國藍/中國藍平板分離革蘭陰性桿菌。3.2.4 TTC沙保羅培養(yǎng)基分離念珠菌及其他酵母菌、奴卡菌等。3.2.5 厭氧血平板置厭氧環(huán)境，分離厭氧菌。3.3 對于直接來自下呼吸道的標本(如灌洗、毛刷、穿刺物等)，應定量或半定量作細菌計數(shù)培養(yǎng)。4報告方式：4.1 痰中的病原菌不少屬于條件致病菌，與正常菌群同在，在報告時應作說明。對于條件致病菌，一般僅當其數(shù)量超過正常菌群時才可報告鑒定結果及其敏感試驗結果。4.2 檢出致病菌時，除報告該菌的鑒定名稱外，還需同時報告正常菌

41、群的情況。4.3 通常以報告草綠色鏈球菌和奈瑟菌作為正常菌群存在的指標。報告的各種細菌應該注明各自所占比例情況，以“+”號表示。如：草綠色蓮球菌+ 奈瑟菌+肺炎克雷伯菌2+ 此報告表明肺炎克雷伯菌在數(shù)量上多于正常菌群，診斷為病原菌。未檢出致病菌 時，應報告“正常菌群”。5下呼吸道病原菌：5.1 正常人的下呼吸道是無菌的，上呼吸道有正常菌群棲居。因下呼吸道的分泌物須經(jīng)上呼吸道排出，常受該處的正常菌群的污染，因此，判斷下呼吸道分泌物中是否有病原菌存在，須對上呼吸道的正常菌群有所了解。 上呼吸道棲居正常菌群 、鏈球菌 棒狀桿菌* 微球菌 擬桿菌 奈瑟菌* 梭桿菌 嗜血桿菌* 厭氧球菌 表皮葡萄球菌

42、注：* 致病菌除外。5.2 引起下呼吸道感染的常見細菌： 下呼吸道感染常見病原菌 革蘭陽性菌 革蘭陰性菌 肺炎鏈球菌 卡他布蘭漢菌 A群鏈球菌 腦膜炎奈瑟菌 金黃色葡萄球菌 流感嗜血桿菌 厭氧球菌 肺炎克雷伯菌 結核分枝桿菌 其他腸桿菌科細菌 白喉棒狀桿菌 假單胞菌屬細菌 放線菌、奴卡菌 嗜肺軍團菌 念珠菌6痰及下呼吸道分泌物標本操作流程： 痰液及下呼吸道分泌物 肉眼觀察 培養(yǎng)前處理 涂片檢查 血瓊脂平板 巧克力平板 中國藍 必要時可增加 CO2環(huán)境下培養(yǎng) 厭氧培養(yǎng) 需氧培養(yǎng) 35,18-24h 觀察菌落和涂片染色鏡檢 各種鑒定試驗 藥物敏感性試驗 報告7參考文獻：全國臨床檢驗操作規(guī)程（第3版

43、）1. 目的規(guī)范穿刺液標本細菌學標準操作規(guī)程，確保檢驗結果準確可靠。2. 適用范圍穿刺液標本培養(yǎng)。3. 標本3.1 標本類型胸水、腹水、心包液、關節(jié)液、鞘膜液等。3.2 標本采集采用無菌方法采集體內(nèi)可疑感染部位的液體約2ml，注入無菌試管，或抽取穿刺液12ml注入多功能體液培養(yǎng)瓶，或抽取穿刺液25ml注入血培養(yǎng)瓶，混勻，立即送檢。如懷疑厭氧菌感染，應做床邊接種或接種運送培養(yǎng)基。3.3 標本拒收標準 標本標識與化驗申請單不符。 標本不是無菌留取，容器不符合要求。3.4 標本保存采集標本后立即送到實驗室，不能及時送檢可置室溫，放置時間不應超過2h。4. 試劑、儀器4.1 革蘭染液、氧化酶試劑、3%

44、觸酶、血瓊脂平板、巧克力平板、中國藍平板、相關生化試劑等。4.2全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)、ATB Expression鑒定系統(tǒng)和TDR系統(tǒng)鑒定卡及藥敏板、藥敏紙片、ATB板條等，有效期及儲存條件參見試劑說明書。4.3 接種針、接種環(huán)、電熱灼燒器、顯微鏡、孵育箱、CO2 培養(yǎng)箱等。5. 細菌鑒定和藥敏質(zhì)控參見質(zhì)量管理。6. 檢驗步驟接收標本后，立即對標本進行編號、登記。6.1 涂片檢查膿性標本直接涂片。漿液性標本先離心（3000rmin，15min），取沉淀物涂片作革蘭染色，觀察有無細菌，以及細菌的形態(tài)。6.2 分離培養(yǎng) 一般細菌培養(yǎng)接種血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和中國藍瓊脂平板（或EMB及中國藍瓊脂平

45、板），510CO2 條件下，35培養(yǎng)1824 h，根據(jù)菌落及染色形態(tài)特點，作出初步判斷。 增菌-分離培養(yǎng)法將多功能體液培養(yǎng)瓶顛倒混勻使液體覆蓋整個固體面，然后置35孵育箱培養(yǎng)（固體面在上，液體在下）。次日觀察固體表面菌苔生長及瓶中液體是否混濁。如發(fā)現(xiàn)有菌生長，立即涂片鏡檢、生化鑒定和藥敏試驗。此法可提高陽性檢出率。 厭氧菌培養(yǎng)床邊接種或從厭氧運送培養(yǎng)基轉(zhuǎn)種后，立即置厭氧環(huán)境中，35培養(yǎng)2448h；挑取可疑菌落作耐氧試驗，確定為厭氧菌。操作流程穿刺液（胸水、腹水、心包液、關節(jié)液等）厭氧培養(yǎng)多功能體液培養(yǎng)瓶或血培養(yǎng)瓶離心厭氧血瓊脂平板35厭氧環(huán)境培養(yǎng)2448h有菌生長沉淀物涂片、染色培養(yǎng)2日或5日

46、無細菌生長可發(fā)出報告涂片、染色耐氧試驗儀器或手工細菌鑒定及藥敏試驗厭氧血平板生長發(fā)出報告7. 結果報告 培養(yǎng)48h無細菌生長，報告“培養(yǎng)2日無細菌生長”。 查見細菌，報告菌名和藥敏結果。8. 注意事項9.1 標本的采集一定要嚴格履行無菌操作技術，避免污染。9.2 加入抗凝劑的標本（如胸腹水）采集后要與抗凝劑充分混勻并及時送檢。9.3 體液均需做厭氧培養(yǎng)，故輸送過程嚴格厭氧環(huán)境。9. 臨床意義各個部位穿刺液（胸水、腹水、心包液、關節(jié)液及鞘膜液等）的細菌學檢查對于確定該部位是否有細菌感染具有重要的診斷價值。正常穿刺液是無菌的，若從患者穿刺液中查見致病菌或條件致病菌則提示該部位有細菌感染。胸腔感染的病原菌以結核分枝桿菌多見，其次是金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌等；腹腔感染的病原菌以腸道細菌如大腸埃希菌、糞腸球菌，以及結核分枝桿菌多見；心包炎和關節(jié)腔液以金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌等多見。參考文獻1 CNAS-GL23醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則在臨床微生物學檢驗領域的應用指南, 20132周庭銀編