維生素D臨床知識與產(chǎn)品培訓(xùn)

1、目錄博暉維生素D試劑盒介紹123維生素D檢測臨床意義維生素D檢測指南與方法一、維生素D檢測臨床意義1、維生素D簡介2、維生素D生理功能3、維生素D與疾?。?）理化性質(zhì)（2）代謝過程41、維生素D簡介 維生素D是一種脂溶性維生素，維生素D與動物骨骼的鈣化有關(guān),故又稱為鈣化醇。也被看作是一種作用于鈣、磷代謝的激素前體，它與陽光有密切關(guān)系，所以又叫“陽光維生素”。維生素D是一族A、B、C、D環(huán)結(jié)構(gòu)相同，但側(cè)鏈不同的一類復(fù)合物的總稱，目前已知的維生素D至少有10種，但最重要的是維生素D2（麥角骨化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）。 維生素D易被紫外光破壞，因此，含維生素D的試劑均應(yīng)避光保存。（1）理化性質(zhì)

2、維生素D2是紫外線照射植物中的麥角固醇產(chǎn)生，在自然界存在較少。維生素D3則由大多數(shù)高級動物的表皮和真皮內(nèi)含有的7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射轉(zhuǎn)變而成。維生素D2維生素D3（1）理化性質(zhì) 含量較多的食物有魚肝油、含油脂的魚類如（三文魚、沙丁魚 ,魚肝油）、奶油、雞蛋黃、雞鴨肝等動物肝臟以及牛奶。另外，維生素D可由人體經(jīng)紫外線照射后生成，所以日光浴是取得維生素D的可靠來源，所以提倡多做戶外活動。Vit DVit D主要來源主要來源（2）代謝過程（2）代謝過程機體主要的調(diào)節(jié)因子： 1,25(OH)2D3本身 甲狀旁腺激素 血清鈣和磷的濃度維生素D的分解代謝主要在肝臟，代謝物進入膽汁入腸，隨糞便排出。在體

3、內(nèi)，維生素D主要儲存在脂肪組織與骨骼肌中，肝臟、大腦、肺、脾、骨骼和皮膚中也存在少量。（2）代謝過程維生素維生素D肝臟肝臟25-羥化酶羥化酶25（OH）D腎臟腎臟1-羥化酶羥化酶1，25（OH）2 D 血P（）（）血Ca（）（）（+）血PPTH（+）血Ca()CT（+）(+)（2）代謝過程（1）調(diào)節(jié)鈣磷代謝（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞分化（3）調(diào)節(jié)免疫力112、生理功能 調(diào)節(jié)鈣磷代謝：維生素D與甲狀旁腺素共同作用，維持血鈣水平穩(wěn)定。這對正常骨骼的礦化、肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)以及體內(nèi)所有細(xì)胞的功能都是必需的。生理循環(huán)圈起點為甲狀旁腺內(nèi)鈣受體對鈣的識別。當(dāng)血鈣水平下降時，甲狀旁腺分泌PTH，刺激腎25-OH-D-1

4、2-氧化酶從25-OH-D3儲存池中轉(zhuǎn)化更多的1,25-(OH)2D3。隨PTH水平的升高， 1,25-(OH)2D3增加，導(dǎo)致腸、骨和腎中鈣轉(zhuǎn)運增多，促進鈣在腎小管的重吸收，將鈣從骨骼中動員出來，在小腸促進結(jié)合蛋白質(zhì)的合成，增加鈣吸收，最終使血鈣恢復(fù)正常水平。（1）調(diào)節(jié)鈣磷代謝 調(diào)節(jié)鈣磷代謝：這個過程均由甲狀旁腺的鈣受體進行識別。PTH分泌減少不僅是由鈣活性反饋，也可由與1,25-(OH)2D3有關(guān)短反饋環(huán)路直接抑制甲狀旁腺分泌PTH。當(dāng)血鈣過高時，促進甲狀旁腺產(chǎn)生降鈣素，阻止鈣從骨髓中的動員，增加鈣磷經(jīng)尿中排出。維生素D缺乏將導(dǎo)致25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3的合成減少，鈣內(nèi)

5、環(huán)境出現(xiàn)失衡,并且要不斷地提高PTH的水平，表現(xiàn)為繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進。（1）調(diào)節(jié)鈣磷代謝 與細(xì)胞生長和分化的關(guān)系：近年來的研究資料表明，正常皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞都有VD受體， VD缺乏大鼠的皮膚顆粒細(xì)胞層變薄，角蛋白改變和細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性降低等。VD3可抑制培養(yǎng)的小鼠角化細(xì)胞和正常人表皮細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其分化。也有資料表明VD3有抑制白血病細(xì)胞株M1增殖并誘導(dǎo)使之分化為成熟的單核細(xì)胞，延長動物存活時間的作用。VD3對其他腫瘤細(xì)胞也有明顯的抗增殖和誘導(dǎo)分化的作用。（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化 對免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)：單核/巨噬細(xì)胞是非特異性免疫反應(yīng)的主要防御機制。體外實驗證明VD3可促使

6、白血病細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并增強單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬活性及殺菌能力。VD缺乏的人和動物對非特異性炎癥刺激的反應(yīng)能力有明顯的降低，而且有吞噬活性和趨化功能障礙。（3）調(diào)節(jié)免疫 維生素D的各種功效都是由其受體調(diào)節(jié)的。維生素D受體除了在腸和骨中表達外，還在腦、前列腺、乳房、結(jié)腸、免疫細(xì)胞、血管平滑肌和心肌細(xì)胞中表達。參考文獻1)Holick MF . Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007;357;266-812)Wang T J et al .Vitamin D deficiency and risk of cardiovas

7、cular disease.circulation 2008 ;117;503-511 體內(nèi)維生素D水平不足與非骨骼性疾病的風(fēng)險增加有相關(guān)性，包括：心血管疾病、高血壓、癌癥、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、傳染性疾病等。參考文獻1)Holick MF . Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007;357;266-812)Wang T J et al .Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease.circulation 2008 ;117;503-5113、維生素D與疾?。?）佝僂病、

8、手足搐搦癥（2）骨軟化?。?）骨質(zhì)疏松（4）維生素D中毒病 因 1、日光照射不足主要病因2、VitD攝入不足 3、生長速度快4、藥物等5藥物影響（1）佝僂病、手足抽搐癥20VitD CaP 骨樣組織鈣化障礙且繼續(xù)增殖骨骺端鈣化障礙骺線參差不齊鈣化帶增厚或毛刷樣、 杯口樣改變骨樣組織堆積骨骺端膨出肋骨串珠手鐲、腳鐲骨干鈣化障礙骨質(zhì)疏松彎曲變形（郝氏溝、“O”、 “X”腿）病理性骨折扁平骨鈣化障礙顱骨軟化骨樣組織堆積方顱病病理理（1）佝僂病、手足抽搐癥胸部：多見于1歲左右小兒.肋骨串珠雞胸郝氏溝漏斗胸上述畸形均使胸腔變小，影響呼吸功能.臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)（1）佝僂病、手足抽搐癥 四 肢腕踝6個月以上

9、小兒手鐲、腳鐲下肢 1歲以上小兒“O”“X ”型腿（1）佝僂病、手足抽搐癥（1）佝僂病、手足抽搐癥全身肌張力下降，骨骼肌：（坐、站、走晚）腹肌肌張力下降，呈蛙腹（1）佝僂病、手足抽搐癥神經(jīng)興奮性改變：神經(jīng)興奮性改變：腦皮層功能減低的表現(xiàn)條件反射形成慢表情淡漠語言發(fā)育落后 免疫力低下：免疫力低下：易合并感染、且易遷延、反復(fù)（1）佝僂病、手足抽搐癥血生化改變明顯血生化改變明顯血Ca稍下降血P明顯下降25（OH）D3 1，25（OH)2D3X線改變線改變：長骨長骨 骨骺軟骨明顯增寬 2mm 干骺端鈣化帶消失，呈毛刷樣、杯口樣改變 骨質(zhì)普遍稀疏，密度減低 骨干可有彎曲或骨折CaP明顯下降 AKP明顯升

10、高輔輔助助檢檢查查（1）佝僂病、手足抽搐癥輔助檢查輔助檢查（1）佝僂病、手足抽搐癥治治療療 （一）維生素（一）維生素D制劑：制劑： 口服法維生素D 20004000 IU/d （50100 ug/d) 1,25(OH)2D3(羅鈣全) 0.52.0 ug/d （2080 IU/d ）一個月后改為預(yù)防量(400 IU/d ) 肌注法：適合重癥、不能口服者VitD3：2030萬IU初期：1次激期：23次，間隔24周23月后給預(yù)防量。注意同時用鈣劑注意同時用鈣劑（1）佝僂病、手足抽搐癥（二）鈣劑治療（二）鈣劑治療 肌注VitD時 有搐搦者 食物中鈣量不足者 適應(yīng)癥（三）矯形治療（三）矯形治療治治療療

11、 （1）佝僂病、手足抽搐癥3、嬰兒期：口服400800 IU/d （不可間斷） 4、幼兒期：夏季增加戶外活動，可不用VitD冬季（10月中旬） 南方：1020萬IU（肌注 ）北方：2040萬IU （肌注 ）（1）佝僂病、手足抽搐癥31（2）骨軟化病 骨軟化病由于成人缺乏維生素D及鈣質(zhì)引起骨基質(zhì)礦化障礙，以骨質(zhì)軟化和骨骼畸形為特征。病人多為女性。 臨床表現(xiàn) 骨痛活動常受限，步態(tài)搖擺、步行困難，病理性骨折，長骨、肋骨、骨盆和脊柱骨均可發(fā)生胸廓兩側(cè)內(nèi)陷，胸腔縮小兩側(cè)肋緣可及髂嵴或其間距明顯縮短。骨盆三葉畸形，身高縮短，可達cm以上。 （2）骨軟化病骨質(zhì)軟化癥骨質(zhì)軟化癥X X線表現(xiàn)線表現(xiàn) 早期普遍性骨

12、質(zhì)疏松，密度減低，骨皮質(zhì)變薄，嚴(yán)重者呈線條狀。髓腔透亮度增加。骨小梁先是模糊，最終消失，可出現(xiàn)多個囊狀透光區(qū)。（2）骨軟化病 2.假骨折是骨質(zhì)軟化癥的X線特點（稱為Looser帶）。表現(xiàn)為橫越骨皮質(zhì)的透明線，其邊緣密度略高，常呈對稱而多發(fā)。多見于肩胛骨、肋骨、坐骨、恥骨等。骨折處無骨痂形成和錯位，日久可出現(xiàn)骨骼彎曲畸形。（2）骨軟化病骨質(zhì)軟化癥骨質(zhì)軟化癥X X線表現(xiàn)線表現(xiàn)骨質(zhì)軟化癥X線表現(xiàn)假骨折，假骨折，Looser帶帶（2）骨軟化病雙凹征雙凹征 骨質(zhì)軟化癥X線表現(xiàn)（2）骨軟化病治治療療維生素D缺乏 補充維生素D 維生素D3400800IU 一般不超過每日4000IU 增加鈣磷攝入（2）骨軟化

13、?。?）骨軟化病正常骨正常骨 骨質(zhì)疏松骨骨質(zhì)疏松骨 以骨強度受損 導(dǎo)致骨折危險性升高為特征的骨骼疾病。骨強度主要反映了骨密度和骨質(zhì)量兩個方面的綜合特征。NIH Consensus Development Panel on Osteoporosis. JAMA 285 (2001): 785-95（3）骨質(zhì)疏松40（3）骨質(zhì)疏松（3）骨質(zhì)疏松臨床表現(xiàn)臨床表現(xiàn)骨痛（腰背酸疼痛）骨折身高縮短，骨骼畸形功能障礙（活動受限）（3）骨質(zhì)疏松骨質(zhì)疏松常見骨折 椎體骨折 橈骨遠(yuǎn)端骨折 髖部骨折 肱骨外科頸骨折38%19%19%（3）骨質(zhì)疏松防治藥物防治藥物骨吸收抑制劑骨吸收抑制劑 骨形成促進劑骨形成促進劑鈣劑

14、鈣劑 氟化物氟化物維生素維生素D D 甲狀旁腺素甲狀旁腺素二膦酸鹽二膦酸鹽 維生素維生素D D降鈣素降鈣素 合成類固醇合成類固醇雌激素雌激素選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（3）骨質(zhì)疏松 發(fā)病機理：血漿中25（OH）D3水平過高，而不是1,25（OH）2D3水平升高造成。高維生素D血癥病人血中25（OH）D濃度可比正常個體高15倍，但是他們的1,25（OH）2D3水平?jīng)]有顯著變化。 短期多次大劑量維生素D治療 維生素D預(yù)防劑量過大 誤診佝僂病錯誤治療45（4）維生素D中毒 診斷： 維生素D過量病史 早期血鈣升高：高于3mmol/L X線檢查：軟組織鈣化46（4）維生素D中毒二、維生

15、素D檢測指南與方法1、維生素D檢測指南2、維生素D檢測方法1、維生素D檢測指南（1）維生素D缺乏診斷程序（2）建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（3）維生素D治療和預(yù)防策略 內(nèi)分泌學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)會2011年年6月月6日發(fā)表日發(fā)表維生素維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南 全文見Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism與內(nèi)分泌學(xué) 該指南針對不同年齡段、不同疾病背景的維生素D缺乏高危、低危人群，進一步明確了維生素D缺乏的有效評估、飲食補充和藥物預(yù)防治療的具體實施方法，指明了維生素D在非血鈣受益上的不

16、確定性，旨在達到維生素D缺乏防治的最優(yōu)化 內(nèi)分泌學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)會2011年年6月月6日發(fā)表日發(fā)表維生素維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南 指南認(rèn)為。維生素D缺乏的高危人群（例如西班牙裔、黑種人、妊娠婦女和肥胖個體妊娠婦女和肥胖個體等）應(yīng)當(dāng)接受維生素D水平篩查。外周血血清25-羥基維生素D水平低于20ng/ml者應(yīng)被診斷為維生素D 缺乏。全文見Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism與內(nèi)分泌學(xué) 內(nèi)分泌學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)會2011年年6月月6日發(fā)表日發(fā)表維生素維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南缺乏評估

17、、治療和預(yù)防的臨床實踐指南 全文見Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism與內(nèi)分泌學(xué) 指南中寫道，現(xiàn)有的所有證據(jù)均表明，兒童和成人預(yù)防佝僂病或骨軟化的最低血25-羥維生素D水平應(yīng)為20 ng/ml，但為了增強維生素D對鈣、骨骼以及肌肉代謝的積極影響，血25-羥維生素D的水平應(yīng)高于30 ng/ml。指南推薦的維生素D缺乏的診斷程序： 推薦對于有維生素D缺乏危險者，采用可靠方法檢測其血清循環(huán)25-羥維生素D25（OH）D水平，以評價患者體內(nèi)的維生素D狀況。維生素D缺乏定義為25（OH）D水平低于20 ng/ml（50nmol/L）。不推薦使用

18、血清1，25二羥維生素D 1，25（OH）2D檢測評價維生素D缺乏，僅在監(jiān)測特定情況如獲得性和遺傳性維生素D和磷酸鹽代謝紊亂時應(yīng)用52（1）維生素D缺乏診斷程序 25（OH）D是血液循環(huán)中維生素D最主要的存在形式，半衰期23周，是監(jiān)測維生素D狀態(tài)的最佳指標(biāo)。 1,25（OH）2D在血液中濃度比25（OH）D低1000倍，半衰期約4小時，且對PTH、鈣、磷的調(diào)控非常敏感，1,25（OH）2D不能反映維生素D的儲備水平，血清1,25（OH）2D在維生素D缺乏時經(jīng)常是正常的甚至升高，因此檢測其濃度對于監(jiān)測病人的維生素D的狀態(tài)沒有幫助。（1）維生素D缺乏診斷程序維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指

19、南建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D每IU=25ng建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D維生素D可耐受維持量的上限：上限： -即除醫(yī)生建議外均不可超過的限量維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南治療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南治

20、療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略維生素D缺乏評估、治療和預(yù)防的臨床實踐指南治療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略2、維生素D檢測方法（1）體內(nèi)維D水平含量與意義（2）檢測維生素D的方法64體內(nèi)血中25-羥維生素D水平含量與意義據(jù)估計，全世界大約10億人未達到維生素D足量濃度的最低限30ng/ml（1）體內(nèi)維D水平含量與意義 臨床常見方法 幾種方法學(xué)對比 ELISA的兩種產(chǎn)品對比65檢測維生素D的方法（2）檢測維生素D的方法（1）酶聯(lián)免疫法（ELISA）：IDS、BH（2）化學(xué)放光免疫法（CLIA）：雅培、索靈、貝克曼等（3）電化學(xué)發(fā)光法（ECLI）：羅氏661、臨床常見方法（2

21、）檢測維生素D的方法酶聯(lián)免疫法使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很

22、高的敏感度。672、幾種方法學(xué)對比（2）檢測維生素D的方法 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析：又稱化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA ) , 是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物acridinium ester (AE) , 其通過起動發(fā)光試劑作用而發(fā)光, 強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成, 為快速的閃爍發(fā)光。靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數(shù)量級，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯(lián)免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（6-18個月）、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優(yōu)點。682、幾種方法學(xué)對比（2）檢測維生素

23、D的方法 電化學(xué)發(fā)光技術(shù)：在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+標(biāo)記Ab，通過Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。高度敏感，可達pgml或pmol水平；特異性強，重復(fù)性好，CV5。測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。試劑穩(wěn)定，無毒害，無污染，有效期長，達數(shù)月至數(shù)年。操作簡單，耗時短，易于自動化。在對環(huán)保很重視的國家，CLIA成了取代RIA的首選方法。692、幾種方法學(xué)對比TPA+TPARu(bpy)3+Ru(bpy)Ru(bpy)2+光 子 (620nm)333*（2）檢測維生素D的方法70

24、免疫標(biāo)記檢測技術(shù)對比（2）檢測維生素D的方法IDSvsBH：.exl重復(fù)性：批內(nèi)、批間時間：713、ELISA的兩種產(chǎn)品對比（2）檢測維生素D的方法三、博暉維生素D試劑盒介紹 博暉公司維生素D3檢測原理 維生素D3檢測試驗準(zhǔn)備與流程 維生素D3檢測試驗步驟與數(shù)據(jù)分析 維生素D3檢測操作規(guī)范及注意事項（1） ELISA簡介（2）維生素D3檢測中競爭法應(yīng)用原理731、博暉公司維生素D3檢測原理 定義與原理定義與原理 ELISA又叫酶聯(lián)反應(yīng)，是一種免疫測定 ?；A(chǔ):抗原或抗體的固抗原或抗體的固相化相化及及抗原或抗體的酶標(biāo)記抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)

25、本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。（1）酶聯(lián)反應(yīng)簡介在這種測定方法中有三個必要的試劑：1、固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）、固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）2、酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）、酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）3、酶作用的底物（顯示計）、酶作用的底物（顯示計） 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法 ELISA檢測法必要試劑檢測法必要試劑（1）酶聯(lián)反應(yīng)簡介常用ELISA類型類型夾心法競爭法雙抗體夾心法雙抗原夾心法BH100檢測原理為：雙抗體夾心法

26、25-OH-維生素D3檢測：競爭法（1）酶聯(lián)反應(yīng)簡介 競爭法：是利用待測抗原和酶標(biāo)抗原與特異性抗體競爭結(jié)合，或待測抗體和酶標(biāo)抗體與特異性抗原競爭結(jié)合而進行測定的一種方法 競爭法示意圖競爭法示意圖（2）維生素D3檢測中競爭法應(yīng)用原理 25-OH-VD3試劑盒（酶聯(lián)免疫法-競爭法），定量測定人體血清中的25羥基維生素D3，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣品均被樣品稀釋液稀釋，稀釋后的樣品和辣根標(biāo)記的25羥基維生素D3抗原在包被了鼠單克隆抗體的微孔中溫育1小時后洗版，然后利用TMB顯色。終止反應(yīng)后利用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。顏色的強度和25-OH-VD3的濃度成反比 。北京博暉公司研發(fā)的北京博暉公司研發(fā)的25-OH-

27、VD3試劑盒原理概述試劑盒原理概述（2）維生素D3檢測中競爭法應(yīng)用原理792、維生素D3檢測試驗準(zhǔn)備與流程（1）BH公司VD3檢測試劑盒（2）自備材料與設(shè)備（3）試劑準(zhǔn)備（4）維生素D3檢測實驗流程25-羥基維生素羥基維生素D3檢測試劑盒包含內(nèi)容檢測試劑盒包含內(nèi)容注：試劑盒在2-8攝氏度，有效期一年（1）BH公司VD3檢測試劑盒u 0.5ml及以上的玻璃或聚丙烯微量離心管； 注意：聚苯乙烯試管不適合，不要重復(fù)使用試管。注意：聚苯乙烯試管不適合，不要重復(fù)使用試管。u 高精度加樣器（10ul、和200ul）以及對應(yīng)槍頭u 旋渦震蕩器；u 自動洗板機（可選擇）；u 酶標(biāo)儀和數(shù)據(jù)分析裝置； 適用于具有

28、450nm、630nm波長的所有全自動和半自動酶標(biāo)儀u 恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴箱。（2）自備材料與設(shè)備u 定標(biāo)血清和質(zhì)控血清：定標(biāo)血清和質(zhì)控血清以凍干品的形式提供，使用前復(fù)溶于500ul蒸餾水中。蓋緊瓶蓋，室溫下放置10-15min，期間顛倒搖晃幾次，使其充分溶解，保存于2-8一周。u 工作洗滌液：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。u 其他試劑直接使用-所有試劑使用之前應(yīng)該平衡至室溫并反復(fù)顛倒混勻。（3）試劑準(zhǔn)備1-6-試劑與樣本配制與準(zhǔn)備；7-13-實驗操作步驟14-15-數(shù)據(jù)檢測（4）維生素D3檢測實驗流程樣品N孔，質(zhì)控2孔，定標(biāo)血清5孔6：酶標(biāo)板排版5：標(biāo)準(zhǔn)品五系列配制10uL樣品血清

29、+400稀釋液（41倍稀釋）4：樣品配制10uL復(fù)溶質(zhì)控血清+400稀釋液（41倍稀釋）3：質(zhì)控品配制25uL復(fù)溶定標(biāo)血清+1000uL稀釋液。（41倍稀釋）2：標(biāo)準(zhǔn)品母液配制復(fù)溶：定標(biāo)血清、質(zhì)控高、中值血清干粉+500ul蒸餾水1：復(fù)溶干粉（4）維生素D3檢測實驗流程（4）維生素D3檢測實驗流程863、維生素D3檢測試驗步驟與數(shù)據(jù)分析（1）維生素D3檢測實驗步驟（2）維生素D3檢測數(shù)據(jù)分析u試劑的復(fù)溶或準(zhǔn)備見“試劑準(zhǔn)備”。u1） 準(zhǔn)備玻璃管或聚丙烯管并做好標(biāo)記，每個定標(biāo)血清、質(zhì)控血清和樣本對應(yīng)一個管。a定標(biāo)血清的稀釋：將對應(yīng)的試管中加入1000ul樣本稀釋液，然后加入25ul復(fù)溶的定標(biāo)血清（

30、濃度100ug/L），即用樣本稀釋液41倍稀釋，置于旋渦混合器上混合10秒。 其余4個定標(biāo)點80ug/L、40ug/L、20ug/L、0ug/L用40倍稀釋好的100ug/L的定標(biāo)血清按表1進行稀釋：（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟質(zhì)控血清和樣本的稀釋：用樣本稀釋液分別將質(zhì)控血清和樣本41倍稀釋，例如每個試管中加入400ul的樣本稀釋液，然后分別加入對應(yīng)編號的10ul質(zhì)控血清和樣本，置于旋渦混合器上混合10秒。如稀釋的總量不同，可參照表2進行稀釋：（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟u2） 于相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中加入50ul已稀釋好的定標(biāo)血清、質(zhì)控血清或樣本，再加入50ul的

31、酶工作液。貼上封口膠，于37條件下孵育1小時。（粉色）（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟圖示：加酶后顯色（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟u3） 用工作洗滌液洗板5次，a手動洗版：迅速將板顛倒倒出孔內(nèi)物，每孔加入300ul工作洗滌液，b自動洗版：設(shè)置洗板機分配每孔至少300ul工作洗滌液。注：在進入下一步前，于吸水紙上用力拍打倒置的板以除去多注：在進入下一步前，于吸水紙上用力拍打倒置的板以除去多余的工作洗滌液余的工作洗滌液（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟洗板機 清洗包被板 示意圖（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟4）每孔加入50ul的底物液A和50ul

32、的底物液B，貼上封口膠，于37下孵育，恒溫水浴箱中反應(yīng)時間為10分鐘，恒溫培養(yǎng)箱或恒溫鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)時間為15分鐘。圖示：加底物液后顏色變?yōu)樗{(lán)色（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟圖示：酶標(biāo)儀檢測讀數(shù)5）每孔加入50ul終止液。在加入終止液后立即于450nm、 630nm波長處讀取吸光度。（1 1）檢測試驗操作步驟）檢測試驗操作步驟維生素維生素D3檢測試驗數(shù)據(jù)案例檢測試驗數(shù)據(jù)案例濃度=LN(OD值/3.3317)/-0.0165（2）實驗數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)記錄和計算方法u數(shù)據(jù)處理軟件u人工處理數(shù)據(jù) 人工數(shù)據(jù)處理步驟和方法1、excel抄錄酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)2、選中全部數(shù)據(jù)，插入散點圖 （2）實驗數(shù)

33、據(jù)分析鼠標(biāo)點擊曲線右鍵-選擇添加趨勢線（2）實驗數(shù)據(jù)分析X=LN(Y/5.4619)/-0.4244（2）實驗數(shù)據(jù)分析【參考值（參考范圍）參考值（參考范圍）】 本公司采用的參考值范圍：19-57.6ug/l（47.5-144nmol/L）每個實驗室應(yīng)建立自己的參考范圍，本試劑盒檢測結(jié)果僅作為輔助診斷手段之一，供臨床醫(yī)生參考。（2）實驗數(shù)據(jù)分析【檢驗結(jié)果的計算與解釋檢驗結(jié)果的計算與解釋】 根據(jù)5個定標(biāo)液數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，值為縱坐標(biāo)，25-OH-D3濃度為橫坐標(biāo)濃度為橫坐標(biāo)，進行指數(shù)曲線擬合指數(shù)曲線擬合。 R不小于不小于0.990，質(zhì)控數(shù)值波動質(zhì)控數(shù)值波動在正負(fù)在正負(fù)20%。根

34、據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和每個樣本檢測的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找到對應(yīng)的25-OH-D3濃度值（ug/l或nmmol/L）。1、57.6ug/l（144nmmol/L），說明25-羥基維生素D3充足。（2）實驗數(shù)據(jù)分析【檢驗方法的局限性檢驗方法的局限性】1、本試劑盒測定范圍為5-100ug/l（12.5-250nmmol/L）。超出試劑超出試劑盒測定范圍的測定結(jié)果盒測定范圍的測定結(jié)果是通過校準(zhǔn)品曲線外延得出的計算結(jié)果，不不作為準(zhǔn)確定量數(shù)據(jù)作為準(zhǔn)確定量數(shù)據(jù)。使用前應(yīng)先對樣本進行稀釋。診斷結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀和醫(yī)師其他的實驗室檢查進行分析。2、加完終止液后應(yīng)立即在酶標(biāo)儀加完終止液后應(yīng)立即在酶標(biāo)儀450nm、6

35、30nm處讀數(shù)處讀數(shù)（2）實驗數(shù)據(jù)分析（1）維生素D3檢測操作規(guī)范（2）維生素D3檢測注意事項4、維生素D3檢測操作規(guī)范及注意事項 實驗前實驗前u復(fù)溫：將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條和凍在冰箱內(nèi)的血清標(biāo)本置室溫平衡（20-25）十分鐘以上。u儀器準(zhǔn)備：洗板機、酶標(biāo)儀、恒溫設(shè)備開啟（37度）u洗滌液準(zhǔn)備：蒸餾水配制洗滌液1：19稀釋u標(biāo)本：血清或血漿（當(dāng)天最好）（1）維生素D3檢測操作規(guī)范實驗中實驗中u復(fù)溫：將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫平衡，試劑樣品使用前必須達到室溫（20-25）后才能使用，未用完的板條應(yīng)立即用封片封好，避光冷藏保存；u復(fù)溶：質(zhì)控品、定標(biāo)品凍干粉用500ul蒸餾水復(fù)溶u五濃

36、度標(biāo)準(zhǔn)品配制：五個系列定標(biāo)品濃度的配制(見說明書)u41倍稀釋：41倍血清樣本的稀釋和質(zhì)控品的稀釋u微孔板上排序有序，設(shè)好標(biāo)準(zhǔn)位，樣品位，質(zhì)控位u加樣：加稀釋后的樣品，質(zhì)控品，定標(biāo)品50uL（1）維生素D3檢測操作規(guī)范實驗中實驗中u加酶液：加入酶液50微升，加入酶液時避免吸頭接觸孔壁及孔內(nèi)樣本，即垂直而不碰避。如有接觸，請更換吸頭；最后并加貼封片u孵育： 恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴箱均為1小時u洗板：在第一步孵育結(jié)束后，小心將封片揭下并棄掉，用洗板機洗滌5次，拍干?；蚴窒矗ㄊ窒辞跋鹊沟艨字幸后w，洗5次，每次放置30秒，每次倒掉液體后需拍干包被板）（1）維生素D3檢測操作規(guī)范實驗中實驗中u加顯色液：每

37、孔中加入50微升顯色液A，再每孔加入50微升顯色液B。u恒溫培養(yǎng)箱孵育15分鐘或恒溫水浴箱中10分鐘，第二次孵育結(jié)束后，小心將封口膠揭開。u加入終止液：加液過程中避免碰到小孔邊緣或其中的試劑，盡量避免污染。在5分鐘內(nèi)上機（酶標(biāo)儀）檢測，時間太久，會有沉定生成，影響檢測結(jié)果。（1）維生素D3檢測操作規(guī)范一、一、 標(biāo)本的采取和保存影響因素標(biāo)本的采取和保存影響因素u血清：標(biāo)本采集管選用，標(biāo)本采用普通干燥管、普通生化管、速凝生化管，靜脈穿刺法采集靜脈血，不能采用有分離膠的管不能采用有分離膠的管，因分離膠含某些蛋白質(zhì)，干擾抗原抗體反應(yīng)，引起假陽、假陰性結(jié)果。（2）維生素D3檢測注意事項注意事項一、一、 標(biāo)本的采取和保存影響因素標(biāo)本的采取和保存影響因素u樣品采集后應(yīng)盡快分離血清，應(yīng)注意避免溶血。一般說來，標(biāo)本放置于2-8冰箱可保存3天，超過3天測定的需分離血清并-20低溫冰存。但反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝再冰存。u凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)