遺傳病的診斷

1、會(huì)計(jì)學(xué)1遺傳病的診斷遺傳病的診斷 第一節(jié) 現(xiàn)癥患者診斷 (symptomatic diagnosis) 一、常規(guī)臨床診斷1. 病史的收集一般病史：患者的一般發(fā)病情況。家族史:本病在家族中的發(fā)病情況?；橐鍪罚河袩o(wú)近親結(jié)婚等。生育史:生育年齡，子女健康狀況；有無(wú)流產(chǎn)、 死產(chǎn)、早產(chǎn)；有無(wú)藥物接觸史、放射線 接觸史等。 2.癥狀和體征的了解 遺傳病的癥狀和體征有和其它疾病的共同性，亦有遺傳病本身的特殊性。 除注意遺傳病的特異性征候群，還應(yīng)注意身體發(fā)育，智力發(fā)育，性器官發(fā)育情況。 3.臨床輔助檢查 包括實(shí)驗(yàn)室檢查、X線、超聲、心電圖、腦電圖、CT等。 二、 系譜分析 pedigree analysis

2、系譜分析往往是由先證者的癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查和其它輔助檢查作出疾病的診斷后，追溯到家系中其他成員，寫(xiě)出系譜圖。 在繪制系譜過(guò)程中要注意：1.系統(tǒng)、完整 *系譜成員應(yīng)調(diào)查三代以上，（包括死者） *凡有近親婚配、死胎、流產(chǎn)和嬰兒死亡等，也須詢(xún)問(wèn)清楚，記錄在系譜中。2.去偽存真 注意區(qū)別病人和家屬所提供信息的真?zhèn)巍?對(duì)系譜的分析要注意區(qū)別：1.孟德?tīng)栠z傳病 包括AD遺傳病、AR遺傳病、XD遺傳病、XR遺傳病、YL疾病等。 系譜分析對(duì)這類(lèi)疾病的分析非常有用，分析時(shí)要考慮到某些疾病的遺傳異質(zhì)性、不規(guī)則外顯、外顯不全和延遲顯性等情況，可能會(huì)造成一些臨床假象，由于遺傳的異質(zhì)性可能將不同的遺傳病誤認(rèn)為同一種

3、遺傳病進(jìn)行分析。 2.非孟德?tīng)栠z傳病線粒體遺傳病 ： 線粒體基因突變所致的遺傳病只通過(guò)母系遺傳，女性患者的子女都可能患病。線粒體遺傳病表現(xiàn)為晚發(fā)、進(jìn)行性。多基因病： 其家族性聚集性可能類(lèi)似于孟德?tīng)栠z傳，但不嚴(yán)格遵循孟德?tīng)柗蛛x規(guī)律。3.具有特殊遺傳學(xué)現(xiàn)象的疾病基因組印記 來(lái)自雙親的等位基因和染色體區(qū)域的表達(dá)不是等同的，這些等位基因在傳遞上符合孟德?tīng)栆?guī)律，但在表達(dá)方面受傳遞的雙親性別影響,因而產(chǎn)生母源印記或父源印記時(shí)，在系譜分析中要加以注意。動(dòng)態(tài)突變 在孟德?tīng)栠z傳疾病中，突變后的基因在世代傳遞中穩(wěn)定存在，但在三核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)展所致的遺傳病中，處于突變狀態(tài)的基因在世代傳遞中表現(xiàn)為不穩(wěn)定，其重復(fù)單元

4、的數(shù)目發(fā)生改變。（一）染色體檢查 又稱(chēng)核型分析（karyotape analysis)，即通過(guò)血液或組織培養(yǎng)制備染色體標(biāo)本，進(jìn)而顯帶、顯微攝影，分組排列對(duì)比分析。 是確診染色體病的主要方法。隨著顯帶技術(shù)的應(yīng)用以及高分辯率染色體顯帶技術(shù)的出現(xiàn)和改進(jìn)，能更準(zhǔn)確地判斷和發(fā)現(xiàn)更多的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常綜合征，還可以發(fā)現(xiàn)新的微畸變綜合征。三、細(xì)胞遺傳學(xué)檢查1.標(biāo)本來(lái)源： 現(xiàn)癥病人外周血和身體的各種組織2.染色體檢查適應(yīng)癥：智能低下、生長(zhǎng)遲緩或伴有其他先天畸形者。夫婦中有染色體異常，如平衡結(jié)構(gòu)重排、嵌合體等。家族中已發(fā)現(xiàn)染色體異常或先天畸形個(gè)體。多發(fā)性流產(chǎn)的婦女及其丈夫。原發(fā)閉經(jīng)和男女不育癥者。35歲以上

5、的高齡孕婦。有兩性?xún)?nèi)外生殖器畸形者。（二）性染色質(zhì)檢查利用發(fā)根鞘細(xì)胞，皮膚或口腔上皮細(xì)胞，絨毛和羊水細(xì)胞檢查X染色質(zhì)或Y染色質(zhì)。用于兩性畸形或性染色體數(shù)目異常疾病的診斷。 優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)單，有一定價(jià)值，但確認(rèn)仍需依靠染色體檢查。 1.X染色質(zhì)檢查 用于由于X染色體數(shù)目異常而引起的性染色體畸變綜合征檢測(cè)。 如：Turner綜合征 X染色質(zhì)為陰性。 Klinefelter綜合征 X染色質(zhì)為陽(yáng)性。2個(gè)X染色質(zhì)（三）染色體原位雜交 應(yīng)用標(biāo)記的特異性DNA探針與玻片上的細(xì)胞中期染色體或間期核的DNA或RNA雜交，在這些核酸不改變其結(jié)構(gòu)和分布格局的情況下，研究核酸片段的位置、相互關(guān)系，因此稱(chēng)為原位雜交。 熒

6、光原位雜交（FISH）： 用生物素、地高辛配基等標(biāo)記物標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行原位雜交后，用熒光標(biāo)記的生物素親和蛋白和抗親和蛋白的抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)和放大，使探針雜交的區(qū)域發(fā)出熒光，這種原位雜交稱(chēng)為熒光原位雜交?？赏瓿煞钦扼w的檢測(cè)。 3個(gè)雜交信號(hào),經(jīng)選擇性人工流產(chǎn)后確診為Down綜合征患兒。 四、生物化學(xué)檢查 單基因遺傳病往往是由于基因突變導(dǎo)致酶和蛋白質(zhì)的改變或缺如，使一些器官的發(fā)育和正常的代謝發(fā)生改變，并在臨床上表現(xiàn)出一系列癥狀。 因此，酶和蛋白質(zhì)的定性和定量分析可反映基因結(jié)構(gòu)的改變，是診斷單基因病的主要方法之一，由于主要采用生化手段故稱(chēng)之為生物化學(xué)檢查。 五、 基因診斷 gene diagno

7、sis 采用分子生物學(xué)方法在DNA水平或RNA水平對(duì)某一基因進(jìn)行分析，從而對(duì)特定的疾病進(jìn)行診斷。 基因診斷特點(diǎn): 針對(duì)直接病因診斷。 特異性強(qiáng),靈敏度高。適應(yīng)性強(qiáng),診斷范圍廣,因基因探針可為任何來(lái) 源、任何種類(lèi),其探針序列可為未知或已知,待 檢測(cè)的目的基因可為一個(gè)特定基因或基因組合。目的基因是否處于活化狀態(tài)均可,無(wú)組織和發(fā) 育特異性,因此可用于檢測(cè)一些具有組織表達(dá) 特異性和分化階段表達(dá)特異性的基因。（一）基因診斷的基本技術(shù) * 分子雜交技術(shù) * 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) * DNA序列測(cè)定技術(shù) * 基因芯片技術(shù) 分子雜交技術(shù) molecular hybridization 原理：雙鏈DNA

8、在加熱到一定溫度以上或在堿性溶液中會(huì)變性成為兩條單鏈，互補(bǔ)的兩條DNA單鏈在一定條件下結(jié)合成為雙鏈。即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。 因此 ，當(dāng)一段已知基因的核酸序列作為探針，與變性后的單鏈DNA接觸時(shí)，如果兩者的堿基完全配對(duì)，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。 基因探針（Probe）： 是一段帶有標(biāo)記的，與待測(cè)基因有關(guān)的核酸序列。探針?lè)N類(lèi): 基因組探針（genomic probe） cDNA探針（cDNA probe） 寡核苷酸探針（oligonucleotid

9、e probe） 2.斑點(diǎn)雜交法 又稱(chēng)等位基因特異的寡核苷酸(ASO)探針雜交。 用人工合成的20個(gè)堿基左右長(zhǎng)度的ASO探針，一般要合成兩種探針：正常探針，突變探針。 將待測(cè)的細(xì)胞或DNA直接點(diǎn)在硝酸纖維膜或尼龍膜上，將標(biāo)記有同位素（或其他標(biāo)記）的變性探針與其進(jìn)行雜交，通過(guò)放射自顯影，判斷受檢基因的有無(wú)以及基因的拷貝數(shù)，進(jìn)行基因診斷。 聚合酶鏈反應(yīng) polymerase chain reaction，PCR 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)是在體外迅速的選擇擴(kuò)增特定的靶DNA的方法。又稱(chēng)體外DNA克隆技術(shù)。PCR的原理：（1）按靶DNA片段的5和3端的堿基順序各合成兩條引物（長(zhǎng)約20個(gè)堿基的寡核苷酸）；（2）

10、將待測(cè)DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP），引物和耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）；（3）反應(yīng)液進(jìn)行熱循環(huán)，每一周期經(jīng)過(guò)變性（92-95），復(fù)性（40-60）和延伸（65-72）三個(gè)階段產(chǎn)生倍增的DNA。一般進(jìn)行20-40個(gè)周期。PCR相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用： 多重PCR RT-PCR Amp-FLP PCR-ASO PCR-SSCP 定量PCR PCR-DGGE1 2 3 4 5a b1：正常人 2,4,5：純合體患者 3：雜合體(2的弟弟)左為泳動(dòng)變位模式：a 正常人；b 純合體患者PCR-SSCPGAAGAGTGTTATCTCCAC DNA測(cè)序技術(shù)(DNA sequenceing Maxan

11、和Gilbert首先建立了化學(xué)方法，Sanger建立了DNA測(cè)序的酶學(xué)方法。 最新的DNA自動(dòng)測(cè)序法以不同熒光色素標(biāo)記的四種不同脫氧核苷酸為原料進(jìn)行酶促合成反應(yīng)，經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離，應(yīng)用激光分析及計(jì)算機(jī)處理就能直接讀出堿基順序。極大地推進(jìn)了生命科學(xué)的發(fā)展和人類(lèi)基因組計(jì)劃的進(jìn)程，而且測(cè)序的長(zhǎng)度可以達(dá)到1000bp以上。 DNA測(cè)序（DNA Sequencing)是檢測(cè)未知突變和已知突變基因的最基本和最重要的實(shí)驗(yàn)手段?；蛐酒夹g(shù) 基因芯片技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展十分迅速的大規(guī)模、高通量分子檢測(cè)技術(shù)。其基本原理是核酸雜交，其基本過(guò)程是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，形

12、成矩陣點(diǎn)?，F(xiàn)在的技術(shù)可以做到在1cm2上排列成千上萬(wàn)個(gè)“點(diǎn)”。 樣品DNA/RNA通過(guò)PCR擴(kuò)增、體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，然后按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)做出比較和檢測(cè)，得出所要的信息。 （二）基因診斷的途經(jīng)1.直接診斷 檢測(cè)突變基因 直接診斷是直接檢測(cè)致病突變的基因。它通常使用基因本身或緊鄰的DNA序列作為探針，或通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以探查基因無(wú)突變、缺失等異常及其性質(zhì)，這稱(chēng)為直接基因診斷，它適用已知基因異常的疾病。2. 間接診斷 基因連鎖分析 當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知或突變類(lèi)型較多時(shí)；或致病基因本身尚屬

13、未知時(shí)，但被檢測(cè)基因有緊密連鎖的DNA多態(tài)標(biāo)記，可以通過(guò)對(duì)受檢者及其家系進(jìn)行連鎖分析，以推斷前者是否獲得了帶有致病基因的染色體。 （三）基因診斷的方法選擇： 各種遺傳病的基因異常是不同的，同一遺傳病也可以有不同的基因異常，但這些異常大體可分為基因缺失和突變兩大類(lèi)型。根據(jù)對(duì)基因異常類(lèi)型的了解，可以采用不同的診斷方法。 遺傳的基因診斷方法基因異常 方法 探針、引物或限制酶基因缺失 基因組DNA印跡雜交PCR擴(kuò)增 缺失基因的探針 引物包括缺失或在缺失部位內(nèi)點(diǎn)突變 RFLP分析ASO雜交 突變導(dǎo)致其切點(diǎn)消失的限制酶 PCR產(chǎn)物的多態(tài)性分析 正常和異常的ASO探針 （RFLP、SSCP、DGGE） 引物

14、包括突變部位基因已知 基因內(nèi)或旁側(cè)序列多態(tài)性 基因內(nèi)或旁但異常不明 （RFLP、 SSCP、AMPFLP） 側(cè)序列探針或引物 連鎖分析 基因未知 與疾病連鎖的多態(tài)性， 與疾病連鎖的多態(tài) 如SSCP、AMPFLP連鎖分析， 位點(diǎn)探針或引物 RFLP位點(diǎn)單體型連鎖分析（四）基因診斷在遺傳病診斷中的應(yīng)用1 對(duì)單基因病的基因診斷（1）點(diǎn)突變型遺傳病的基因診斷鐮形細(xì)胞性貧血的基因診斷 Normal probeMutation probe無(wú)過(guò)氧化氫酶血癥（acatalasemia) 是一種常染色體隱性遺傳病，患者過(guò)氧化氫酶活性只有正常人的0.2%0.4%，雜合體血液中過(guò)氧化氫酶活性則處于中間水平。過(guò)氧化氫

15、酶基因由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子組成。應(yīng)用32P標(biāo)記PCR反應(yīng)中底物方法，擴(kuò)增第4個(gè)外顯子和內(nèi)含子附近的203bp片段，應(yīng)用SSCP法可清楚地判斷患者和雜合體。 aa/aa aa/- aa/a- a-/- -/-14kb10kb10kb 4kbBamH IBamH I左側(cè)：16號(hào)染色體上攜有數(shù)目不同的基因右側(cè)：a基因探針雜交的結(jié)果 -地貧基因缺失的診斷正常貧血癥狀攜帶者HbH（2）基因缺失型遺傳病的診斷DMDBMD的缺失型診斷：（3）基因異常不明的遺傳病的診斷 以苯丙酮尿癥( PKU )的基因診斷為例。RFLP分析： 一個(gè)PKU家系的RFLP單體型分析 PKU，AR1 21 2 35.6 K

16、b5.2 Kb4.2 Kb4.0 KbHind Sph11.0 Kb 9.7 Kb 7.0 KbPKU家系PAH基因STR連鎖分析 2多基因遺傳病的基因診斷 人類(lèi)基因組多態(tài)性是多基因病基因診斷的基礎(chǔ)，易感基因多態(tài)性的檢測(cè)能幫助我們理解多基因病發(fā)生的機(jī)制，有助于對(duì)疾病的診斷和分類(lèi)。 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些多基因病相關(guān)基因，如載脂蛋白E基因（ApoE）的多態(tài)性與阿爾茨海默?。ˋD）有高度相關(guān)性，血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶基因的多態(tài)性與原發(fā)性高血壓和心肌梗死高度相關(guān)。3 對(duì)腫瘤的基因診斷ras基因突變的檢測(cè) ras基因突變的檢測(cè)可采用PCR-ASO方法進(jìn)行，已知ras基因突變的熱點(diǎn)在12、13及61密碼子。 p53

17、基因的檢測(cè) 目前常用PCR法進(jìn)行檢測(cè)p53突變的熱點(diǎn)是外顯子5-8，一般可先選用外顯子5-8的引物進(jìn)行擴(kuò)增，其后再進(jìn)行突變位點(diǎn)的詳盡分析，甚至測(cè)序。另一初步檢測(cè)p53基因突變的方法為PCR-SSCP，然后測(cè)序。 （五）疾病基因診斷的展望未來(lái)的基因診斷主要發(fā)展方向 *胚胎著床前診斷在囊胚8個(gè)細(xì)胞期，通過(guò)對(duì)其中一個(gè)細(xì)胞的染色體核型分折和原位雜交，從而將人類(lèi)的遺傳缺陷控制在最早期階段； *母體外周血中胎兒細(xì)胞分析技術(shù)； *對(duì)常見(jiàn)病、多發(fā)病如心血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、精神疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、哮喘、近視眼等進(jìn)行分子診斷。第二節(jié) 癥狀前診斷（pre-symptomatic diagnosis） 指

18、在遺傳病的臨床癥狀出現(xiàn)前所作的診斷。 是針對(duì)一些常染色體顯性(AD)遺傳病的雜合子個(gè)體的一種診斷方法。這些個(gè)體往往發(fā)病年齡延遲，如果能在雜合子個(gè)體生育之前或出現(xiàn)癥狀之前就作出診斷，可以避免他將致病基因傳遞給后代，減少遺傳病的發(fā)病率。 常染色體顯性雜合子個(gè)體的癥狀前診斷方法有三種：1家系分析法和風(fēng)險(xiǎn)估計(jì) 2生化學(xué)檢查3基因分析 新生兒篩查（neonatal screening）也是一種癥狀前的診斷。是對(duì)已出生的新生兒進(jìn)行某些遺傳病的診斷，是出生后預(yù)防和治療某些遺傳病的有效方法。 第三節(jié) 產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis） 產(chǎn)前診斷又稱(chēng)宮內(nèi)診斷（intrauterine diagno

19、sis）是對(duì)胚胎或胎兒在出生前是否患有某種遺傳病或先天畸形作出準(zhǔn)確的診斷。 一、產(chǎn)前診斷的適應(yīng)征135歲以上的高齡孕婦或夫婦一方有明顯致畸因素接 觸史；2夫婦之一有染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常者；或曾生育過(guò) 染色體病患兒的孕婦；3已知或推測(cè)孕婦是AR或XR攜帶者；曾生育過(guò)某種單 基因遺傳病患兒的孕婦；4曾生育過(guò)先天畸形（尤其是神經(jīng)管畸形）的孕婦；5有原因不明的自然流產(chǎn)，畸胎，死產(chǎn)及新生兒死亡 的孕婦。二、產(chǎn)前診斷的方法儀器診斷 包括：X線檢查 超聲波檢查 胎兒鏡檢查細(xì)胞學(xué)方法（染色體檢查；染色質(zhì)檢查） 生化學(xué)方法（蛋白質(zhì)或酶檢查；代謝產(chǎn)物檢查） 分子生物學(xué)方法（基因分析）三、產(chǎn)前診斷的標(biāo)本及采集技術(shù)可

20、用于檢測(cè)的標(biāo)本： 羊水上清液、羊水細(xì)胞 絨毛 臍帶血、孕婦外周血中胎兒細(xì)胞 孕婦血清和尿液 受精卵、胚胎組織 羊膜穿刺術(shù)（amniocentesis） 羊膜穿刺術(shù)一般在妊娠1618周時(shí)進(jìn)行。因?yàn)榇藭r(shí)羊水量多、胎兒浮動(dòng)，穿刺時(shí)容易進(jìn)針，且不易傷及胎兒。取材最好是在B超監(jiān)視下進(jìn)行。絨毛吸取術(shù)chorionic villi aspiration sampling, CVS 絨毛吸取術(shù)一般可在妊娠早期79周時(shí)進(jìn)行。取樣最好在B超監(jiān)視下進(jìn)行。臍帶穿刺術(shù)（cordocentesis） 臍帶穿刺術(shù)可在B超監(jiān)視下進(jìn)行。用一細(xì)針經(jīng)孕婦腹壁進(jìn)入胎兒的臍帶，抽取胎兒臍靜脈血。 一般在孕中期（妊娠18周）進(jìn)行。 孕婦

21、外周血分離胎兒細(xì)胞分離 孕婦外周血分離胎兒細(xì)胞是一項(xiàng)非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷技術(shù)，并易于被孕婦接受。孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞至少有3種，即滋養(yǎng)葉細(xì)胞、有核紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。 目前許多學(xué)者都致力于解決胎兒細(xì)胞的識(shí)別、富集和如何排除母血的“污染”等。此方法將以簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)在遺傳病的預(yù)防中發(fā)揮作用。植入前診斷（preimplantation diagnosis） 植入前診斷是利用微操作技術(shù)和DNA擴(kuò)增技術(shù)對(duì)胚泡植入前進(jìn)行檢測(cè)。 植入前遺傳學(xué)診斷 （preimplantation genetic diagnosis,PSD） 是指用分子或細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)體外受精的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，確定正常后再將胚胎植入子宮。 獲得植入前胚胎的主要方法： 子宮沖洗 體外授精 植入前診斷的基本技術(shù)：胚胎組織微活檢： 目前多采用在68個(gè)細(xì)胞期，通過(guò)顯微操作技術(shù)取出12個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體或基因的檢查。PCR技術(shù)： 單細(xì)胞PCR技術(shù)主要用于單基因