DB53∕T 1058-2021 滇金絲猴個體識別分子技術(shù)規(guī)程

1、 ICS65.020.30CCSB4153云 南 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB53/T10582021滇金絲猴個體識別分子技術(shù)規(guī)程Regulation of molecular techniques of individual identification forRhinopithecus bieti2021-09-30發(fā)布2021-10-14實施 DB53/T10582021目次前言.III1范圍.12規(guī)范性引用文件.13術(shù)語和定義.14原理.25操作程序.25.1樣品制備及DNA提取.25.2DNA質(zhì)量檢測.25.3DNA保存.25.4微衛(wèi)星標(biāo)記.25.5微衛(wèi)星標(biāo)記PCR.25.6微衛(wèi)星基因分型

2、.36個體識別.3附錄A（規(guī)范性）滇金絲猴個體識別微衛(wèi)星標(biāo)記信息表.4附錄B（規(guī)范性）主要試劑及儀器設(shè)備.5附錄C（規(guī)范性）脫氧核糖核酸樣品（DNA）樣品的提取.7附錄D（規(guī)范性）PCR反應(yīng).9I DB53/T10582021前言本文件按照GB/T 1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。III DB53/T10582021滇金絲猴個體識別分子技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）個體識別分子技術(shù)的原理、操作程序、個體識別。本文件適用于滇金絲猴個體識別、遺傳多樣性評估、群體歷史評估和遺傳檔案建立。2規(guī)范性引用文件下列文

3、件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1微衛(wèi)星標(biāo)記 microsatellite marker基因組中的簡單串聯(lián)重復(fù)脫氧核糖核酸（DNA）片段，含短串聯(lián)重復(fù)序列（Short tandem repeats，STR）和簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats， SSR）。在個體間重復(fù)次數(shù)發(fā)生變化的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，可以作為微衛(wèi)星標(biāo)記使用。3.2微衛(wèi)星序列 microsat

4、ellite sequence基因組中由16個核苷酸為基本重復(fù)單元組成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，也稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單重復(fù)序列。3.3脫氧核糖核酸樣品 DNA samples利用滇金絲猴組織（如毛發(fā)、血液、肌肉組織等）或新鮮糞便提取的滇金絲猴基因組脫氧核糖核酸（DNA）樣品。3.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction（PCR）以一對寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱DNA聚合酶催化下，在體外人工合成特異的DNA片段的過程。3.5微衛(wèi)星基因分型 microsatellite genotyping對樣品進(jìn)行微衛(wèi)星位點(diǎn)PC

5、R擴(kuò)增后，利用自動化毛細(xì)血管電泳技術(shù)測定個體基因型。3.6微衛(wèi)星個體識別 microsatellite individual identification1 DB53/T10582021采用微衛(wèi)星多態(tài)性技術(shù)，判斷前后兩次或多次出現(xiàn)的生物學(xué)檢材是否屬于同一個體。采用微衛(wèi)星多態(tài)性技術(shù)進(jìn)行個體識別，以確認(rèn)個體身份。3.7微衛(wèi)星特異性引物 microsatellite specific primers用于滇金絲猴微衛(wèi)星分子鑒定選用的一套微衛(wèi)星引物，具有多態(tài)性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。4原理微衛(wèi)星廣泛分布于動物基因組的不同位置，微衛(wèi)星位點(diǎn)具有高度的遺傳多態(tài)性，微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度的物種特異性和良好的擴(kuò)增重現(xiàn)性，是

6、動物個體識別的首選標(biāo)記。在檢驗過程中，可將不同的樣品作為待檢樣品，待檢樣品之間的基因型差異作為判定不同個體的依據(jù)。本文件用了10對高多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，用于滇金絲猴個體識別（見附錄A）。5操作程序5.1樣品制備及 DNA提取收集滇金絲猴的血液、肌肉、皮膚、毛發(fā)、糞便等樣品，樣品采集應(yīng)符合實驗動物的福利和倫理的相關(guān)要求。使用針對不同樣品形式對應(yīng)的專用商品試劑盒或傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)手段進(jìn)行 DNA提取。主要試劑、儀器設(shè)備見附錄B，樣品的DNA提取具體步驟見附錄C。5.2DNA質(zhì)量檢測使用微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳對每個DNA樣品進(jìn)行濃度分析，260/280在1.72.1之間，濃度超過40n

7、g/µL的DNA樣品合格。瓊脂糖凝膠電泳檢測及成像方法見附錄C。5.3DNA保存近期（一個月內(nèi)）使用的DNA，裝有DNA的離心管保存于20冰箱中。長期保存的DNA，裝有DNA的離心管保存于80超低溫冰箱中。5.4微衛(wèi)星標(biāo)記使用10個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行滇金絲猴個體識別。微衛(wèi)星標(biāo)記信息見附錄A。5.5微衛(wèi)星標(biāo)記 PCR5.5.1微衛(wèi)星標(biāo)記 PCR引物合成與熒光標(biāo)記根據(jù)10個微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的序列合成引物，并對正向引物的5端進(jìn)行熒光標(biāo)記，每個微衛(wèi)星標(biāo)記有一條引物帶有熒光標(biāo)記。在試驗過程中，應(yīng)避光操作，以免影響引物的熒光標(biāo)記效果。5.5.2PCR反應(yīng)體系可選用多種PCR擴(kuò)增酶進(jìn)行微衛(wèi)星PCR，PC

8、R反應(yīng)體系見附錄D，表D.1。5.5.3PCR反應(yīng)程序樣品DNA在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序，反應(yīng)程序見附錄D，表D.2。5.5.4PCR反應(yīng)最適退火溫度2 DB53/T1058202110對微衛(wèi)星引物退火溫度見附錄D，表D.2。PCR產(chǎn)物質(zhì)量檢測5.5.5PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物2 µL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如電泳條帶清楚片段大小正確，參考長度應(yīng)符合附錄C所示，符合微衛(wèi)星擴(kuò)增大小，表明PCR擴(kuò)增成功，成為符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物。將符合質(zhì)量要求的PCR產(chǎn)物使用錫箔紙盒避光存放于4冰箱，用于后續(xù)測序儀檢測，進(jìn)行基因分型；對于不符合質(zhì)量要求的樣品，要進(jìn)行PCR條件優(yōu)

9、化，改變PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)時間，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增和質(zhì)量檢測。5.6微衛(wèi)星基因分型5.6.1將符合質(zhì)量要求的 PCR產(chǎn)物采用遺傳分析儀進(jìn)行基因掃描分型。5.6.2不同顏色標(biāo)記引物的 PCR產(chǎn)物可以混合后進(jìn)行基因掃描分型，獲取微衛(wèi)星分型峰圖和數(shù)值。為消除系統(tǒng)誤差，所有樣品使用同一型號分型設(shè)備進(jìn)行基因分型，所有批次都選用相同分子內(nèi)標(biāo)，并且使用同一數(shù)據(jù)判讀軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)判讀。5.6.3獲取的微衛(wèi)星分型峰圖和數(shù)值，對各微衛(wèi)星位點(diǎn)重復(fù)單元堿基數(shù)對測序結(jié)果進(jìn)行人工校正。在校正中，根據(jù)分型峰圖和數(shù)值，參考片段大小，判斷分型數(shù)據(jù)的奇偶性。根據(jù)分型數(shù)值，將偏差小于等于 1的基因型校正為堿基重復(fù)數(shù)的整數(shù)倍數(shù)值，偏

10、差大于 1重新進(jìn)行 PCR，以確保數(shù)據(jù)真實可靠。6個體識別用生物學(xué)軟件對微衛(wèi)星位點(diǎn)的分型數(shù)據(jù)進(jìn)行個體識別：a)當(dāng)兩個或兩個以上的樣品微衛(wèi)星標(biāo)記分型結(jié)果完全一致時，判定樣品來自同一個體；b)當(dāng)兩個樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記分型結(jié)果中有2個及以上標(biāo)記分型結(jié)果不同時，判定樣品來自不同個體；c)當(dāng)兩個樣品的微衛(wèi)星標(biāo)記分型結(jié)果中只有1個標(biāo)記差異時，認(rèn)為兩個樣品來自相同個體。3 DB53/T10582021附錄A（規(guī)范性）滇金絲猴個體識別微衛(wèi)星標(biāo)記信息表滇金絲猴個體識別微衛(wèi)星標(biāo)記信息表見表A.1。表A.1滇金絲猴個體識別微衛(wèi)星標(biāo)記信息表編號標(biāo)記名稱引物序列 5- 3核心序列參考長度（bp）195227F: GCAA

11、AGACACACACATAGGCTCAR: ATGCCTTCTTTGTCTCTTGATCTTF: AGAGAGAATCCCCCTGAGCATR: GAGCAAGACTCCATCTCAAAACAF: TTCCAACTAACACTAAAAGGAGGGR: CACAGGGGTGAAAATATTCAAGAF: GACAACCCAGAGCCATCTATGTAR: TGGGTGACAGAGTAAGACTCGGTF: CTGTGGAATCTGCCCATCAA1RB1(AAAG)n(AGGA)n(TTCC)n(TCTTT)n(TTCC)n(AGAT)n(CCTT)n(TAGA)n(TACAA)n(ATTGT)

12、n23RB2RB3RB4RB5RB6RB7RB8RB9RB1021925121023020422923726122023620822819622021823828931445R: GCCTGGACAACAGAGTAAGACACF: GCTTCTGAATTCTTCCAATGTCCR: CCCTGAATTCCAAGAATGTCAAF: GTCTACTGTGGGTGAACCTGGAR: TGGGCCTAGAAGGTTGTGGTF: AGAGGTTGCAGTGAGCCAAGAR: GGACTACTGCTAAGCAAGGTATCGF: GGGTATCAGTCTGCTTTGGAATCR: GCACAAGT

13、TCCCATTGCCATAF: GCCCTCCACTGCTCAATTTT678910R: GGTAGGAGAACTGCTTGATCCC4 DB53/T10582021附錄B（規(guī)范性）主要試劑及儀器設(shè)備B.1主要試劑B.1.1除非另有說明，在分析中所使用的試劑均為分析純，所使用的水均為無菌水。B.1.2B.1.3B.1.4B.1.5B.1.6B.1.750×TAE緩沖液(TAE Buffer)：Tris堿242 g和冰醋酸57.1 mL，用雙蒸水定容到1 L。GeneFinder核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。6×上樣緩沖液（Loading Buffer），含有溴酚藍(lán)，用于電

14、泳和凝膠成像。2.5 mM dNTP試劑：dATP、dCTP、dGTP和dTTP的預(yù)混溶液。5×PCR Buffer。GoldStar酶。B.1.8無菌水：ddH2O。B.1.9瓊脂糖（純度100%）。B.1.101%瓊脂糖凝膠（用于檢測DNA）：1 g瓊脂糖與100 mL 1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，60時，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。B.1.11 2%瓊脂糖凝膠（用于檢測PCR產(chǎn)物）：2 g瓊脂糖與100 mL 1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，60時，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定

15、在凝膠中的樣品梳。B.1.12B.1.13STE緩沖液：30 mM Tris-HCL，200 mM EDTA，50 mM NaCl，pH 8.0。Tris飽和酚。B.1.14水飽和酚。B.1.15異戊醇（C5H12O）。B.1.16異丙醇（CH3CH(OH)CH3）。B.1.17氯仿（CHCl3）。B.1.18TE：10 mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH=8.0。B.1.19苯酚（C6H5OH）。B.1.20蛋白酶K。B.1.21十二烷基硫酸鈉：SDS。B.1.22DNA提取試劑盒可選用QIAamp Fast DNA Stool（51604），使用試劑盒中的相關(guān)試劑。試劑盒可進(jìn)行

16、自由選擇。B.2儀器設(shè)備B.2.1PCR儀。B.2.2低溫高速離心機(jī)。B.2.3單道可調(diào)移液器（2 µL，10 µL，200 µL，1 000 µL）。B.2.4電子天平（量程0.01 mg10 000 mg）。B.2.5水浴恒溫振蕩器。B.2.6普通離心機(jī)。B.2.7超純水器。B.2.8高壓滅菌器。5 DB53/T10582021B.2.9電泳儀。B.2.10凝膠成像系統(tǒng)。B.2.11磁力攪拌器。B.2.12遺傳分析儀。B.2.13超低溫冰箱（80）。B.2.14低溫冰箱（20）。B.2.15DNA混合儀。6 DB53/T10582021附錄C（規(guī)范性

17、）脫氧核糖核酸樣品（DNA）樣品的提取C.1說明DNA提取可用多種方式進(jìn)行，可使用不同試劑盒等方法，本文件給出糞便樣品 DNA的試劑盒提取法、組織血液樣品DNA的傳統(tǒng)提取方法。C.2糞便樣品的DNA提取C.2.1試劑盒本標(biāo)準(zhǔn)采用的試劑盒為QIAamp Fast DNA Stool（51604），所有離心步驟，在室溫下（1525），14 000 rpm/min進(jìn)行。如果不能提供14 000 rpm/min離心速度，則增加離心時間比例。C.2.2預(yù)處理C.2.2.1為盡可能多的獲得滇金絲猴腸道脫落細(xì)胞，最大限度去除糞便樣品中的多糖、色素等阻抑物，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理。C.2.2.2利用研磨儀將糞便

18、樣品磨碎，使得脫落下來的腸道細(xì)胞充分存在于樣品保存液中。C.2.2.3通過離心法富集樣品中的腸道細(xì)胞以備DNA提取。C.2.2.4使用預(yù)冷的無水乙醇和無菌水對富集物進(jìn)行洗滌離心，以去除樣品中的阻抑物成分。C.2.3準(zhǔn)備工作C.2.3.1確保緩沖AW1和緩沖AW2已經(jīng)按照試劑盒標(biāo)簽上的說明準(zhǔn)備。C.2.3.2使用前將緩沖液混合均勻。C.2.3.3如果在Buffer ASL或 Buffer AL中有沉淀形成，在70水浴鍋內(nèi)加熱至溶解。C.2.3.4準(zhǔn)備70水浴在C.2.4.7使用。C.2.4DNA提取C.2.4.1稱取180 mg220 mg糞便于2 mL離心管置于冰上做預(yù)處理。C.2.4.2向樣

19、品中加入1 mL緩沖液InhibitEX Buffer，間歇振蕩渦旋1min2min至樣品完全同質(zhì)化。C.2.4.3全速離心1.5min，使糞便均質(zhì)化。C.2.4.4取25 µL蛋白酶K進(jìn)入一個新的2 mL微離心管。C.2.4.5從第3步中吸取600 µL上清于有蛋白酶K的2 mL離心管中。C.2.4.6加600 µL Buffer AL渦旋15s。C.2.4.770孵育10min，中途顛倒混勻12次。簡短離心收集管蓋上的液滴。C.2.4.8在裂解液中加600 µL無水乙醇，渦旋混勻。簡短離心收集管蓋上的液滴。C.2.4.9將上一步所得溶液取600 &#

20、181;L加入到一個吸附柱中（吸附柱放入2 mL收集管）。全速14 000 rpm/min離心1.5min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中。C.2.4.10打開柱子的蓋子，加入另外600 µL的裂解液，全速14 000 rpm/min離心1.5min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中。7 DB53/T10582021C.2.4.11重復(fù)C.2.4.10將第三份600 µL的裂解液負(fù)載到柱子上。全速14 000 rpm/min離心1.5min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的收集管中。C.2.4.12加入500 µL Buffer AW1到柱子中。蓋緊離心管蓋，全速

21、14 000 rpm/min離心1.5min。將離心管取出，放入一新的2 mL收集管中。丟棄舊收集管及其中液體。C.2.4.13加入500 µL Buffer AW2到柱子中。蓋緊離心管蓋，以全速14 000 rpm/min離心3min。將離心管取出，放入新的2 mL收集管中（試劑盒提供）。丟棄舊收集管及其中液體。C.2.4.14將離心管取出，放入新的2 mL收集管中后以全速14 000 rpm/min離心2min。C.2.4.15將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管中，小心加入無菌水，室溫下靜置2min，全速14 000 rpm/min離心2min，把DNA洗脫下來。C.2.4.16

22、準(zhǔn)備0.2 mL的PCR小管，吸取4 µL用于膠檢測和定量，將1.5 mL離心管中的DNA樣品迅速放于20冰箱。C.3組織、血液樣品DNA的提取C.3.1取1.5 mL全血或少許組織樣品0.03 g，加入450 µL STE緩沖液（30 mM Tris-HCL，200 mMEDTA，50 mM NaCl， pH 8.0）和終濃度分別為10%的SDS 75 µL和200 mg/mL的蛋白酶K 25 µL；充分混勻后置于57溫箱中消化8 h12 h至澄清，其間搖勻數(shù)次。C.3.2加入等體積的水飽和酚或Tris飽和酚550 µL700 µL

23、，人工緩慢混勻20min或在DNA混合儀上緩慢轉(zhuǎn)動抽提24 h，小心的混合兩相。于室溫9 000 rpm/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管中。C.3.3加入等體積的苯酚:氯仿:異戊醇（25:24:1）混合液300 µL緩慢混勻抽提20min或在DNA混合儀上緩慢轉(zhuǎn)動抽提24 h，9 000 rpm/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管。C.3.4再加入等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提10 min或在DNA混合儀上緩慢轉(zhuǎn)動抽提24 h，9 000 rpm/min離心10min，上清液轉(zhuǎn)至另一干凈的Eppendorf管中。C.

24、3.5加入等體積的異丙醇沉淀DNA，于20靜置120min以上沉淀DNA，12 000 rpm/min離心10min后，棄上清。C.3.6加入1 000 µL70%乙醇振蕩洗滌，除去一些鹽分或其他不利于DNA溶解的成分，13 000 rpm/min離心10min后，棄上清（重復(fù)兩次）。C.3.7盡可能徹底除去70%乙醇，于室溫將DNA沉淀置于敞開的Eppendorf管內(nèi)，直至可見痕量乙醇揮發(fā)殆盡。C.3.8加入150 µL200 µL TE（10mM Tris-HCL，1mM EDTA，pH=8.0）緩沖液或無菌水溶解，置37充分溶解，68加熱滅活，待DNA完全溶解后置于4冰箱或長期保存于20待用。C.4瓊脂糖凝膠電泳檢測及成像方法C.4.1配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠（即1×TAE電泳緩沖液100 mL加1 g瓊脂糖），加熱融化混勻，冷卻至60 °C左右，倒入膠槽，插上樣品梳。