Westernblot的由來原理步驟幫你理解

1、 Western blot Western Blot印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNADNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。 埃德溫邁勒薩瑟恩 （Edwin Mellor Southern） 是什么？是什么

2、？DNA重組技術(shù)siRNA的轉(zhuǎn)染技術(shù)表觀遺傳學(xué)（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平檢測的研究，均可運用到凡是涉及蛋白水平檢測的研究，均可運用到western blotwestern blot技術(shù)技術(shù)能做什么？能做什么？n為什么要作蛋白質(zhì)印跡實驗？為什么要作蛋白質(zhì)印跡實驗？q研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當中在樣品當中q蛋白質(zhì)的表達情況，上調(diào)或下調(diào)表達，在不同的樣蛋白質(zhì)的表達情況，上調(diào)或下調(diào)表達，在不同的樣品中，如疾病和正常的樣品之間的表達差異性。品中，如疾病和正常的樣品之間的表達差異性。Western Western Blot基

3、本原理基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。 Western Blot Western Blot 一、 原理 與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯

4、影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鑒定蛋白質(zhì)最方便也是最通用的方法。E E3.SDS-PAGE電泳電泳原理：原理： SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當 SDS 與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量之蛋白質(zhì)帶電價一致

5、(charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素Western Blot 的具體步驟-濾紙濾紙凝膠凝膠膜膜濾紙濾紙+主要試劑 制膠用（1-6）： 1. 1.0mol/L TrisHCl （pH6.8）Tris (MW121.14) 12.114g 蒸餾水 100ml 溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至6.8），室溫下保存。 2. 1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）Tris (MW121.14) 18.671g 蒸餾水 100ml溶解后，（用濃鹽酸調(diào)pH至8.8），室溫下保存。 3. 10SDS SDS 10g 蒸餾水至 100ml 如溶解困難，可在50水

6、浴下溶解，室溫保存。 如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 4. 10過硫酸胺（AP） 過硫酸胺 0.1g 蒸餾水 1ml （現(xiàn)用現(xiàn)配，可先將過硫酸胺干粉稱好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多裝幾管，使用時加入蒸餾水水即可，溶解后，4保存，保存時間為1周） 5四甲基乙二胺原液（TEMED）： 4C保存。 630%丙稀酰胺： 4C保存。 下層膠 依次加入 去離子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（pH8.8） 3.8ml10%SDS 150l10%AP 150lTEMED 6l5% 上層膠 依次加入 去離子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tri

7、s-HCl（pH6.8） 0.75ml10%SDS 60l10%AP 60l TEMED 6l 75X電泳液緩沖液 Tris（MW121.14） 15.1g 甘氨酸（MW75.07） 94g SDS 5.00g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存,用時稀釋5倍，通常取160ml配制成800ml即可。 810X轉(zhuǎn)膜緩沖液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸餾水至 1000ml 溶解后室溫保存,用時稀釋10倍，并加入甲醇至20%。 通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易產(chǎn)生沉淀）910XT

8、BS緩沖液 Tris（MW121.14） 24.2g NaCl 80.0g 蒸餾水至 1000ml （濃鹽酸調(diào)pH至7.6），溶解后室溫保存。 101XTBST緩沖液10XTBS緩沖液 100ml 蒸餾水 900mlTween-20 1 ml因Tween-20比較粘稠，應(yīng)緩慢吸取并可把槍頭剪掉一塊，即可防止產(chǎn)生氣泡。溶解后室溫保存。 11封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶)： 1XTBST緩沖液 95-100 ml 脫脂奶粉 5g 溶解后4保存，可于一周內(nèi)使用。 其他試劑 一抗、二抗、顯影液、定影液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑 A 和 B 兩種試劑Western Blot 的具體步驟3.SDS-PAGE

9、電泳電泳 凝膠成份：凝膠成份：丙烯酰胺N,N-亞甲雙丙烯酰胺 SDS過硫酸銨TEMEDH2O儀器：儀器：電泳緩沖液：電泳緩沖液：Tris-甘氨酸溶液Western Blot 的具體步驟3.SDS-PAGE電泳電泳 1.制膠需緊密固定！Western Blot 的具體步驟3.SDS-PAGE電泳電泳 2.上樣 每孔上樣量為20-50 g蛋白；根據(jù)目的蛋白的表達情況的不同而有所變化。Western Blot 的具體步驟3.SDS-PAGE電泳電泳 3.電泳電泳條件：推薦：濃縮膠 80V 3545min 分離膠 120V 4575minWestern Blot 的具體步驟3.SDS-PAGE電泳電泳

10、 考馬斯亮藍染膠考馬斯亮藍染膠轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜Western Blot實驗實驗SDS-PAGE電泳實電泳實驗驗SDS-PAGE膠的考馬斯亮藍染色Western Blot 的具體步驟4.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 原理：原理：蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，轉(zhuǎn)膜即在電場作用下從膠中轉(zhuǎn)至膜上的過程。Western Blot 的具體步驟4.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 半干轉(zhuǎn)半干轉(zhuǎn)濕濕 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)半干式轉(zhuǎn)膜速度快，適合與小分子量蛋白濕式成功率高并特別適合用于分子量大于 100KD的蛋白兩種方法的轉(zhuǎn)膜液不同！方法方法儀器儀器特點特點Western Blot 的具體步驟4.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 表5 PVDF膜、NC膜、尼龍膜特點比較Western Blot 的具體步驟4

11、.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜準備制作“三明治”Western Blot 的具體步驟4.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 Western Blot 的具體步驟4.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜條件：推薦：100V ，12小時；根據(jù)蛋白大小以及膠厚度的不同而不同。Western Blot 的具體步驟5.轉(zhuǎn)膜后檢測：（轉(zhuǎn)膜后檢測：（立春紅染色）立春紅染色） 1x立春紅5min染色前染色后Western Blot 的具體步驟6.封閉封閉 封閉條件： 4C搖動，封閉1 hour，再用 TBST洗5秒，進入下一步抗體的孵育。 為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進行膜的封閉，常用的封閉液：脫脂奶粉（5）BSA（5）Western B

12、lot 膜封閉液（生物試劑公司提供）不能用于磷酸化蛋白！Western Blot 的具體步驟7.免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) 1.按照抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋抗體；2.抗體孵育時間：室溫下孵育12h或4過夜（一般不超過18小時）；3. 保持適當?shù)膿u動使抗體與膜的結(jié)合均勻；Western Blot 的具體步驟7.免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) 擺床上，二抗雜交，室溫（25左右）1h，或4過夜。PBST(TBST)洗滌3次，每次10分鐘。上二抗上二抗Western Blot 的具體步驟7.免疫反應(yīng)免疫反應(yīng) 不同二抗稀釋濃度的效果圖Western Blot 的具體步驟8.顯色（結(jié)果檢測）顯色（結(jié)果檢測） 顯色

13、方法顯色方法代表類型代表類型特點特點酶促底物發(fā)光法 DAB顯色法穩(wěn)定性好，靈敏度較高（250pg），背景一般，成像性較差，藥品疑有一定致癌性。 化學(xué)發(fā)光法 （推薦使用）ECL發(fā)光法穩(wěn)定性好，靈敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重復(fù)標記，暗室操作！Western Blot 的具體步驟8.顯色（結(jié)果檢測）顯色（結(jié)果檢測） A液B液11: 膜混合ECL工作液滴加ECL工作液 顯影、定影n蛋白樣品的制備nSDS聚丙烯酰胺 凝膠電泳l轉(zhuǎn)膜l封閉l一抗雜交l二抗雜交l底物顯色 Western Blot（一） 蛋白樣品制備 （二） 蛋白含量的測定 Western Blot1） 清洗玻璃板

14、： 一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。 Western Blot 1、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。） Western Blot2、按前面方法配 10分離膠，加入TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時， 可用 10ml 槍吸取 5ml 膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。 然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。） West

15、ern Blot3、當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。 Western Blot4、配4 的濃縮膠,加入TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。 Western Blot 5、用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那

16、槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。） Western Blot7、加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。） 用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。 Western Blot電泳時間一般45 h，電壓為40V 較好，也可用 60V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。 Western Blot Western Blot Western Blot（1） 轉(zhuǎn)一張膜需準備 6 張7.08

17、.3cm 的濾紙和1 張7.38.6cm 的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h 才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細管作用可使整個膜浸濕。 若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。 Western Blot（2 ） 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和 浸過的膜。 （3） 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回搟幾遍以 搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊

18、三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去 其中的氣泡。 Western Blot（4） 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。 撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。） 除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。 將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋 3 張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能

19、相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。） Western Blot（5） 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。 轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用 60V 轉(zhuǎn)移2 h 或40V 轉(zhuǎn)移 3 h。 Western Blot1封閉： 將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，去離子水與PBST或TTBS稍加漂洗，浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和TTBS將麗春紅洗脫后封閉，如用蛋白marker則可省略此步。 Western Blot2結(jié)合一抗： 一抗的準備：使用反貼法時每張39cm2膜約需2ml一抗稀釋液。 反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加于搖床的塑料膜上，將Western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4靜置過夜。在反應(yīng)體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發(fā)。 Western Blot3洗滌： 一抗孵育結(jié)束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每