地中海貧血基因檢測系統(tǒng)

1、地中海貧血基因檢測地中海貧血基因檢測在臨床診斷上的應(yīng)用在臨床診斷上的應(yīng)用亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司http:/www.dbs- 地中海貧血地中海貧血l地中海貧血，又稱海洋性貧血，是一種常見的單基因遺傳性溶血性血液疾病。l廣泛分布在全世界沿海地區(qū)。l中國常見于東南沿海、西南 地區(qū)以及臺灣地區(qū)。地中海貧血的分布地中海貧血的分布地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一地中海貧血地中海貧血l地中海貧血的共同特點是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，致使血紅蛋白的組成成分改變。l地中海貧血分為-地中海貧血和-地中海貧血。人類不同時期血紅蛋白的組成人類不同時期血紅蛋

2、白的組成l胚胎期血紅蛋白：lHb Gower 1 （x2 e2 ）lHb Gower 2 (a2 e2)lHb Portland (x2 g2) 即Hb Portland 1l另有少量Hb Portland 2 (x2 b2)，Hb Portland 3 (x2 d2)l胎兒期主要血紅蛋白：lHbF （a2 g2 ） l成人主要血紅蛋白：lHbA （ a2 b2）約占血紅蛋白總量96.597.5%lHbA2 （a2 d2 ） 約占血紅蛋白總量2.53.5%lHbF （ a2 g2）約占血紅蛋白總量1%以下。血紅蛋白血紅蛋白a a2 2b b2 2za2a1Chromosome 16Chromo

3、some 11a a-globin gene clusterb b-globin gene clustereggdbPredominant HaemoglobinEMBRYONICFETALADULTz z2 2e e2 2a a2 2g g2 2(a(a2 2d d2 2) )Hemoglobin -地中海貧血地中海貧血l-地中海貧血（簡稱-地貧）是一種由于-珠蛋白基因突變導致肽鏈表達失衡而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病。多由-珠蛋白基因的缺失突變所致。l研究發(fā)現(xiàn)中國地區(qū)常見的3種 -地貧主要由 -SEA、-3.7、 -4.2缺失(左缺失）引起。 -地貧基因缺失示意圖地貧基因缺失示意圖-a a3.7

4、-a a4.2-SEA a2a2 a1a1a2a2a1a1 1 1b b-地中海貧血地中海貧血lb-地中海貧血是一種由于b-珠蛋白基因突變導致肽鏈合成減少或缺乏而產(chǎn)生的單基因遺傳血液病，多由b-珠蛋白基因點突變所致。 l在中國人群中常見的突變位點有CD41-42M， -28M， IVS-II-654M，CD71-72M等 突變類型突變類型l編碼區(qū)的移碼突變、無義突變和起始密碼突變：如CD41-42，CD71-72 ，CD17突變后形成終止子，表現(xiàn)為b0。 l非編碼區(qū)IVS-1和IVS-2突變?nèi)鏘VS-II-654突變影響mRNA的拼接，表現(xiàn)為b。l影響轉(zhuǎn)錄的突變：如-28，-29的突變影響基因

5、的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為b 。中國南方中國南方 和和 地貧的人群攜帶率地貧的人群攜帶率地區(qū)攜帶率（） 地貧 地貧廣州8.532.54廣西14.956.78四川1.922.18貴州-4.72臺灣4.201.10香港5.023.41廣州人群中廣州人群中地貧的攜帶者頻率地貧的攜帶者頻率基因變異基因變異頻率頻率(%)基因變異基因變異頻率頻率(%)a a 地貧地貧8.53b b 地貧地貧2.54-SEA4.14CD41-420.92-a a3.73.10IVS-2-6540.63-a a4.20.95-280.42-a aCS0.18CD260.13-THAL0.04CD170.10-a aQS0.04CD71-

6、720.09-11.10.02CD430.09a a1CD118(+TCA) 0.02-290.05-a-a-gene缺失缺失0.02CD27-280.05未知突變未知突變0.04b-b-gene 缺失缺失0.01未知突變未知突變0.04 a a地貧的地貧的基因型與表現(xiàn)型基因型與表現(xiàn)型Normal (/) 正常正常 + thal trait(/- 3.7)(/- 4.2) 靜止型單一靜止型單一基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能臨床無任何癥狀，一般血液學檢查無異樣，僅臨床無任何癥狀，一般血液學檢查無異樣，僅平均紅細胞體積平均紅細胞體積( (MCVMCV) ) 位于正常值下限。位于正常值下限。a

7、 a地貧的地貧的基因型與表現(xiàn)型基因型與表現(xiàn)型Hb H disease(- 3.7/-SEA)(- 4.2/-SEA) o Thal trait( /-SEA)( - / - )血紅蛋白血紅蛋白H病病3個個基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能肝脾腫大，中度貧血。小細胞，低色素，肝脾腫大，中度貧血。小細胞，低色素，HbHHbH含含 量量較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血，較高，易發(fā)生溶血，有些病例需不定期輸血， 癥重癥重者甚至需切除脾臟者甚至需切除脾臟。 標準型標準型2個個基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能臨床無癥狀，血液學檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細臨床無癥狀，血液學檢查出現(xiàn)輕微貧血，紅細胞大小

8、不均一，胞大小不均一，平均紅細胞體積平均紅細胞體積( (MCVMCV) ) 及平均及平均血紅蛋白含量血紅蛋白含量( (MCHMCH) )明顯偏低。明顯偏低。a a地貧的地貧的基因型與表現(xiàn)型基因型與表現(xiàn)型Hb Barts Hydrops(-SEA/-SEA) Hb Barts 水腫胎兒綜合癥水腫胎兒綜合癥 4個個a a基因缺失或喪失功能基因缺失或喪失功能患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡，全身水患胎于妊娠晚期或產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡，全身水腫，肝脾腫大。由于胎兒無法合成腫，肝脾腫大。由于胎兒無法合成a a亞基，臍亞基，臍血血紅蛋白血血紅蛋白（ Hb Barts ，g g4）含量高。含量高。中國南方中國南

9、方HbH病基因的主要構(gòu)成病基因的主要構(gòu)成省份例數(shù)非缺失型缺失型aaT/-、aaT /aaT-a3.7 /-a4.2 /-a2.7 /-nn%n%n%n%廣西1366044.13525.73928.721.5廣東1362719.97152.23827.9-四川551934.52749.1916.4-江西27829.6829.61140.8-香港38513.22668.4718.4-臺灣22511450.79441.8177.5-合計61723337.826142.312119.620.3a a地貧疾病嚴重程度的單倍型順序地貧疾病嚴重程度的單倍型順序a a2 2a a1 1T a a2 2- -

10、- a - a1 1a a2 2Ta a1 1 -a -a1 1T - - - -b b地貧的地貧的基因型與表現(xiàn)型基因型與表現(xiàn)型 重型重型b b-地中海貧血地中海貧血所有患者有組織缺氧癥狀，可出現(xiàn)所有患者有組織缺氧癥狀，可出現(xiàn)“地中地中海貧血面容海貧血面容”，生長發(fā)育遲緩。紅細胞體，生長發(fā)育遲緩。紅細胞體積小且低色素。過剩的游離積小且低色素。過剩的游離 鏈形成鏈形成 鏈包鏈包涵體，引起溶血性貧血，靠輸血維持生命。涵體，引起溶血性貧血，靠輸血維持生命。b/ b、b0/ b0 、b0/ b（純合子或雙重雜合子） 輕型輕型b b-地中海貧血地中海貧血患者癥狀較輕，輕度貧血，輕度肝脾腫大?；颊甙Y狀較輕

11、，輕度貧血，輕度肝脾腫大。紅細胞脆性降低，小細胞，低色素，紅細胞脆性降低，小細胞，低色素，MCVMCV、MCHMCH較低。較低。bA/ b、bA/ b0 （雜合子）b b地貧的地貧的基因型與表現(xiàn)型基因型與表現(xiàn)型 中間型中間型b b-地中海貧血地中海貧血患者臨床癥狀介于重型和輕型之間，如中患者臨床癥狀介于重型和輕型之間，如中度偏重貧血，生長發(fā)育遲緩，黃疸等。血度偏重貧血，生長發(fā)育遲緩，黃疸等。血液檢查呈小細胞低色素貧血癥。液檢查呈小細胞低色素貧血癥。b/ b、b/ b0 （純合子或雙重雜合子）中國南方高發(fā)區(qū)的主要突變類型中國南方高發(fā)區(qū)的主要突變類型突變類型廣州臺灣香港廣西四川貴州湖北福建n%n%

12、n%n%n%n%n%n%CD41-4218440.720236.34547.98344.21723.61740.51229.31441.265410022.122840.72021.3126.4912.5716.71741.51338.3-286714.8447.977.43619.268.312.437.312.9CD17419.1386.899.53619.22433.41638.137.3411.8CD71-72153.330.50042.111.40012.400Cd26112.491.611.1-2942.179.712.437.312.9CD43920.1

13、0.2-31.611.40024.912.9廣州市主要出生缺陷的發(fā)生率廣州市主要出生缺陷的發(fā)生率(1998-2001)排序出生缺陷例數(shù)發(fā)生頻率(/10000)1先天性心臟病26019.662重型a地貧20815.733多指20015.124肢體短縮1118. 395唇裂/腭裂1098.24a a-地中海貧血基因診斷地中海貧血基因診斷l(xiāng)可同時檢測 -SEA、-a a3.7、-a a4.2等3種缺失型a a-地中海貧血。l可檢出無臨床癥狀的靜止型a a-地貧（aaaa/ -a a3.7、 aaaa /-a a4.2），l應(yīng)用：婚前檢查、產(chǎn)前檢查及產(chǎn)前診斷。a a -地中海貧血基因診斷操作流程地中海

14、貧血基因診斷操作流程 待測樣品待測樣品DNA的制備的制備l全血DNA快速提取試劑盒l(wèi)應(yīng)用l全血DNA的提取l培養(yǎng)細胞基因組DNA的提取l注意事項l抗凝劑:不能用肝素。l紅細胞裂解l干燥環(huán)節(jié)：乙醇干燥須完全,有機溶劑抑制PCR擴增. PCR擴增擴增PCR反應(yīng)液Mix-A 21LDNA模板 4L ( 200-500ng)Total 25L96 15min98 45s64 1min30s 35 cycles 72 3min72 5min a a-地中海貧血基因診斷試劑盒地中海貧血基因診斷試劑盒：-采用電泳結(jié)果判讀采用電泳結(jié)果判讀M DNA Marker1. (aa /aa ) 1.8kb2. (aa

15、 / -a 4.2) 1.8kb; 1.6kb3. (aa / -a 3.7) 2.0kb; 1.8kb4. (-a 4.2 / -SEA ) 1.6kb; 1.3kb 5. (-a 3.7 / -SEA ) 2.0kb; 1.3kb6. (aa/-SEA ) 1.8kb; 1.3kb M 1 2 3 4 5 6 Ma a - -珠蛋白基因型珠蛋白基因型 PCRPCR產(chǎn)物片段長度產(chǎn)物片段長度 -a 3.72.0kbaa 1.8kb -a 4.21.6kb-SEA1.3kb注：注： -地中海貧血基因診斷地中海貧血基因診斷l(xiāng)可對17個突變位點 (8個常見位點及9個少見位點)進行檢測 l合理的探針設(shè)

16、計明顯減少了非特異性雜交反應(yīng)的發(fā)生。l位點設(shè)計更合理，絕大部分突變位點都有相應(yīng)正常對照，結(jié)果易于判定 l-地貧基因診斷；攜帶者檢出 HBB gene HBB1HBB2HBB34142717241-42M/N65471-72M/654M -地中海貧血基因診斷操作流程PCR擴增擴增l用生物素標記的引物擴增待測樣品DNAPCR-Mix-I 23LDNA模板 2LTotal 25L5015min95 10min94 1 min50 30s 35 cycles 72 30s72 5min l取15 mL 塑料離心管，放入膜條，加入A液5-6 mL及PCR產(chǎn)物。將塑料管放入沸水中加熱10分鐘，取出擰緊蓋子， 放入42雜交箱雜交1.54小時。 變性及雜交變性及雜交洗 膜l取出膜條，移至裝有預(yù)熱B液的50 mL管中， 于42輕搖洗滌15分鐘 顯顯 色色l1）POD溶液孵育30分鐘l2）洗滌 用A液室溫洗兩次，每次5分鐘。l3）顯色 將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10-15分鐘即可見斑點顯現(xiàn)。N/N654M/N41-42M/N結(jié)果判讀結(jié)果判讀41-42N654N28N71-72N17NEN31N27/28M41-42M654M28M71-72M17MEM31MIVS1-1M43M32M2