轉(zhuǎn)基因植物篩選與檢測(cè)PPT課件

1、轉(zhuǎn)基因植物的篩選與檢測(cè) 問(wèn)題 1.進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作了，如何選出來(lái)已成功 導(dǎo)入基因的細(xì)胞？ 2. 轉(zhuǎn)化體里的外源基因是否成功的表達(dá)了呢？1第1頁(yè)/共17頁(yè)一、篩選的方法與原理 通過(guò)特定基因在轉(zhuǎn)化體內(nèi)的表達(dá)，利用特定的試劑，選擇出來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 注：注： 1.1.特定基因又稱特定基因又稱“抗性基因抗性基因” 2.2.表達(dá)方式：蛋白質(zhì)的合成、酶的失活等表達(dá)方式：蛋白質(zhì)的合成、酶的失活等 表表“植物遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇試劑及其抗性基因植物遺傳轉(zhuǎn)化中的選擇試劑及其抗性基因”2第2頁(yè)/共17頁(yè)3第3頁(yè)/共17頁(yè)二、檢測(cè)的方法與原理 利用特定基因在轉(zhuǎn)化體內(nèi)的表達(dá)，對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。 不同分子水平上檢測(cè)方法：不同

2、分子水平上檢測(cè)方法：SouthernPCRNorthernqRT-PCRWestern4第4頁(yè)/共17頁(yè) 報(bào)告基因(reporter gene)是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。 必須具有以下幾個(gè)條件：必須具有以下幾個(gè)條件： (1)已被克隆和全序列已測(cè)定；已被克隆和全序列已測(cè)定； (2)表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中原本不存在；表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中原本不存在； (3)其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。其表達(dá)產(chǎn)物能進(jìn)行定量測(cè)定。 例如：例如：Kan 抗性基因、抗性基因、Gus 基因、基因、Bar 基因基因5第5頁(yè)/共17頁(yè) Gus基因存在于E.coli等一些細(xì)菌

3、基因組內(nèi)，編碼-葡萄糖苷酸酶。 缺點(diǎn)： （1 1）染色不均勻）染色不均勻 （2 2）不能進(jìn)行亞細(xì)胞定位）不能進(jìn)行亞細(xì)胞定位 （3 3）不能進(jìn)行活體染色）不能進(jìn)行活體染色6第6頁(yè)/共17頁(yè) Southern 印跡雜交是利用標(biāo)記的探針（probe）與膜上靶DNA片段進(jìn)行雜交的技術(shù)，檢測(cè)靶DNA片段中是否存在與探針同源的序列。 特點(diǎn)： 可清除操作過(guò)程中的污染可清除操作過(guò)程中的污染 (如如 DNA 分離及植物分離及植物 DNA 分離過(guò)程中的交叉污染分離過(guò)程中的交叉污染) ，以及轉(zhuǎn)化愈傷，以及轉(zhuǎn)化愈傷胞間質(zhì)粒殘留所引起的假陽(yáng)性信號(hào)，胞間質(zhì)粒殘留所引起的假陽(yáng)性信號(hào)，準(zhǔn)確度高準(zhǔn)確度高。 Southern 雜

4、交程序雜交程序復(fù)雜復(fù)雜，成本高成本高 ，且對(duì)實(shí)驗(yàn)技，且對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)條件術(shù)條件要求較高要求較高。7第7頁(yè)/共17頁(yè) Northern 雜交的主要原理是把變性 RNA 轉(zhuǎn)移和固定在特定的薄膜上 , 用特定的 DNA 探針來(lái)檢測(cè) RNA。 特點(diǎn)： Northern 雜交與雜交與Southern 雜交相比雜交相比 , 更接近更接近于性于性 狀表現(xiàn)狀表現(xiàn) , 更有現(xiàn)實(shí)意義更有現(xiàn)實(shí)意義 , 被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植被廣泛用于轉(zhuǎn)基因植株株 的檢測(cè)。但的檢測(cè)。但RNA 提取條件嚴(yán)格提取條件嚴(yán)格 , 在材料內(nèi)在材料內(nèi)含含量少量少 , 不適于大批量樣品的檢測(cè)。不適于大批量樣品的檢測(cè)。8第8頁(yè)/共17頁(yè) Western 印

5、跡是將蛋白質(zhì)從 SDS-PAGE膠中電泳轉(zhuǎn)移至固相支持體上 , 然后對(duì)固定化蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫學(xué)測(cè)定的方法。 特點(diǎn)： Western 雜交雜交靈敏度極高靈敏度極高，可以測(cè)出粗蛋白提，可以測(cè)出粗蛋白提取取 物中小于物中小于 50ng 抗原，在較純的制劑中抗原，在較純的制劑中 ，可測(cè)，可測(cè)出出 15ng 抗原。能直接顯示目的基因在轉(zhuǎn)化體抗原。能直接顯示目的基因在轉(zhuǎn)化體中中 是否經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯最終合成蛋白而影響植株是否經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯最終合成蛋白而影響植株的的性狀表現(xiàn)性狀表現(xiàn)。9第9頁(yè)/共17頁(yè) PCR/qRT-PCR PCR/qRT-PCR 是在體外快速特異地?cái)U(kuò)增目的基因DNADNA片段的有效方法。 特

6、點(diǎn)： 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 ，染色后很容易，染色后很容易觀察，觀察，不通過(guò)雜交不通過(guò)雜交分析就可以鑒定出基因組中分析就可以鑒定出基因組中的一些順序。材料的一些順序。材料用量少用量少，檢測(cè)方便，可以在，檢測(cè)方便，可以在試管苗階段，甚至對(duì)愈傷組織進(jìn)行檢測(cè)，了解試管苗階段，甚至對(duì)愈傷組織進(jìn)行檢測(cè)，了解轉(zhuǎn)化早期的信息，便于及時(shí)優(yōu)化試驗(yàn)方案。轉(zhuǎn)化早期的信息，便于及時(shí)優(yōu)化試驗(yàn)方案。DNA提取方便，適合于提取方便，適合于大批量樣品分析大批量樣品分析，又能，又能檢測(cè)目的基因的完整性，是檢測(cè)目的基因的完整性，是早期檢測(cè)早期檢測(cè)的一種較的一種較好方法。好方法。10第10頁(yè)/共17頁(yè)So

7、uthern雜交 1.提取DNA 2.電泳 3.變性 4.轉(zhuǎn)膜 5.固定DNA 6.探針的標(biāo)記 7.雜交與檢測(cè)（NBT/BCIP顯色）印跡印跡DNA膜膜轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移11第11頁(yè)/共17頁(yè)Southern雜交轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜儀把膜和膠片緊密結(jié)合，壓！把膜和膠片緊密結(jié)合，壓！12第12頁(yè)/共17頁(yè)轉(zhuǎn)膜 注意： 此過(guò)程最重要的是保持各此過(guò)程最重要的是保持各DNA片段的相對(duì)片段的相對(duì)位置位置不變不變。故而稱為。故而稱為印跡（印跡（blotting）。 用于轉(zhuǎn)膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維用于轉(zhuǎn)膜的固相支持物有多種，包括硝酸纖維素膜（素膜（NC膜）、尼龍膜（膜）、尼龍膜（Nylon） 、化學(xué)活化、化學(xué)活化膜和濾紙等。膜和濾紙等。 雙鏈雙鏈DNA變性變性單鏈單鏈DNA轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移固相支持物固相支持物電泳槽、緩沖液、夾板電泳槽、緩沖液、夾板13第13頁(yè)/共17頁(yè)Western 1.1.制膠及上樣 2.2.電泳 3.3.轉(zhuǎn)膜 4.4.封閉 5.5.抗體孵育 6.6.曝光顯影曝光顯影后的條帶曝光顯影后的條帶14第14頁(yè)/共17頁(yè) 總結(jié)：這些技術(shù)需要轉(zhuǎn)膜、雜交，操作繁瑣，費(fèi)用高,可對(duì)轉(zhuǎn)基因植株隨機(jī)取樣檢測(cè)。 Southern 雜交