原核表達(dá)的詳細(xì)步驟

1、原核表達(dá)詳細(xì)步驟Part選擇表達(dá)的目的基因一、 基因序列 1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有幾種方式尋找正確的讀碼順序: 利用生物信息學(xué)在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正確的讀碼。 實(shí)驗(yàn)方法，即得到蛋白，進(jìn)行測序，然后在DNA上找到正確的讀碼。 利用mRNA的特征，找到啟動(dòng)子，編碼區(qū)，終止子。在編碼區(qū)中找到翻譯起始密碼子與終止密碼子（cDNA）。 2. 注意事項(xiàng)： 區(qū)別ORF和CDSORF一般在DNA上的定義，尋找原則是翻譯起始密碼子和終止密碼子；CDS可以是DNA上的定義，也可以是mRNA上的定義，分為complete CDS和partial C

2、DS,是從第一個(gè)核酸開始讀，連續(xù)讀下去，complete CDS讀碼是“M、”，partial CDS的讀碼是相應(yīng)的AA 在進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，充分利用生物信息學(xué)的信息后，在進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。 二、 抗原決定簇的預(yù)測 1、原理： 蛋白質(zhì)表面部分可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的區(qū)域叫抗原決定簇。一般抗原決定簇是由612 氨基酸或碳水基團(tuán)組成，它可以是由連續(xù)序列（蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)）組成或由不連續(xù)的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)組成。變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產(chǎn)物，用來免疫動(dòng)物具有更強(qiáng)的抗原性。只是天然蛋白中被包在內(nèi)部的抗原決定簇也會(huì)暴露出來，如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的，如果用來檢測天然蛋白，可能會(huì)有假陽性。

3、做單抗也可以，同樣道理，篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內(nèi)部，是否能用還要看將來該單抗用來干什么。 2、選擇原則： （1）、親水性：大部分抗原決定簇是親水性的。 （2）、處于結(jié)構(gòu)表面：大部分抗體只與蛋白質(zhì)表面部分結(jié)合。 （3）、有彈性：許多已知的抗原決定簇是在自由活動(dòng)區(qū)域。所以一般來說蛋白質(zhì)的N 端及C 端是很好的抗原決定簇區(qū)域。 3、選定抗原決定簇的步驟： （1）預(yù)測：如軟件預(yù)測DNAstar（Protean）預(yù)測，Dnaman。在線網(wǎng)站預(yù)測（/molbio/hla_bind/index.shtml and http:/ww

4、w.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html） （2）選定：接近N、C端；選取在此區(qū)間內(nèi)，（Antigenic Index）Jameson-wolf抗原決定簇選正分高處；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle預(yù)測親水性強(qiáng)的區(qū)域。同時(shí)符合以上3點(diǎn)的區(qū)域較好（命名為多肽片斷A）。 注：如果設(shè)計(jì)的多肽是跨膜蛋白，請盡量回避選擇蛋白的跨膜區(qū)，即頭端信號(hào)肽所在的區(qū)域 （3）NCBI（BlastP）比對：將多肽片斷A放入blastp進(jìn)行同源性比對。如果制備某一動(dòng)物種屬的抗體，該區(qū)必須與該動(dòng)物的氨基酸序列沒有較高的同源性。 注：

5、這一步往往容易漏掉，所以學(xué)會(huì)應(yīng)用生物信息學(xué)，可以減少走彎路！ （4）抗原合成： 原核表達(dá)： 化學(xué)合成：需要做化學(xué)偶聯(lián)增強(qiáng)多肽穩(wěn)定性。多肽的純度越純越好，一般 80%就完全可以了。合成5-10 mg就可以了。 Part選擇表達(dá)系統(tǒng)一、 選擇表達(dá)載體 1、選擇表達(dá)載體的原則 （1）蛋白質(zhì)大?。簺Q定在胞質(zhì)中表達(dá)還是以包涵體的形式表達(dá)，是否加標(biāo)簽或以融合蛋白的形式表達(dá)。 （2）蛋白需求量：根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案確定蛋白需求量，選擇合適的載體。 （3）蛋白質(zhì)是否需要保留活性：有活性的可溶性蛋白表達(dá)（胞質(zhì)蛋白），無活性的不溶的蛋白（包涵體蛋白） 2、原核表達(dá)載體通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件： （1）

6、選擇標(biāo)志的編碼序列：用于篩選重組子，有抗生素抗性基因 、報(bào)告基因（GFP等） （2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子： 啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并起始RNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱是對表達(dá)量有決定影響的因素之一。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。由于細(xì)菌RNA聚合酶不能識(shí)別真核基因的啟動(dòng)子，因此原核表達(dá)載體所用的啟動(dòng)子必須是原核啟動(dòng)。 原核啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游510 bp處，有一段由68個(gè)堿基組成，富含A和T的區(qū)域，稱為Pribnow 盒，又名TATA 盒或10區(qū)。來源不同的啟動(dòng)子，Pri

7、bnow 盒的堿基順序稍有變化。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35 bp處，有一段由10 bp組成的區(qū)域，稱為-35區(qū)。轉(zhuǎn)錄時(shí)大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別并結(jié)合啟動(dòng)子。-35區(qū)與RNA聚合酶s亞基結(jié)合，-10區(qū)與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近DNA被解旋形成單鏈，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵，以后在RNA聚合酶作用下向前推進(jìn)，形成新生的RNA鏈。 原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動(dòng)子有Lac(乳糖啟動(dòng)子)、Trp(色氨酸啟動(dòng)子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動(dòng)子) 、lPL (l噬菌體的左向啟動(dòng)子)、T7噬菌體啟動(dòng)子等。 （3）轉(zhuǎn)錄終止子： 在一個(gè)基因的3¢末端或是

8、一個(gè)操縱子的3¢末端往往有特定的核苷酸序列，且具有終止轉(zhuǎn)錄功能，這一序列稱之為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號(hào)上，完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來。對RNA聚合酶起強(qiáng)終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G/C的區(qū)域，G/C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)。這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制較為復(fù)雜，并且結(jié)論尚不統(tǒng)一。但在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因表達(dá)干擾載體的穩(wěn)定

9、性，一般都在多克隆位點(diǎn)的下游插入一段很強(qiáng)的rrB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子。 （4）核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）： 1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游310 bp處的由39 bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16S rRNA 3¢末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn)。以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱SD序列。它與起始密碼子AUG之間的距離是影響mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白的重要因素之一，某些蛋白質(zhì)與SD序列結(jié)合也會(huì)影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響

10、蛋白質(zhì)的翻譯。另外，真核基因的第二個(gè)密碼子必須緊接在ATG之后，才能產(chǎn)生一個(gè)完整的蛋白質(zhì)。 （5）多克隆位點(diǎn)（MCS）：選擇的酶切位點(diǎn)在靶基因上沒有相應(yīng)的酶切序列，否則在構(gòu)建重組子進(jìn)行酶切時(shí)會(huì)把靶基因給切開。在惠贈(zèng)或交換的質(zhì)粒中確定MCS的正確性，否則會(huì)造成錯(cuò)讀密碼子。 （6）復(fù)制子：通常表達(dá)載體都會(huì)選用高拷貝的復(fù)制子。pSC101類質(zhì)粒是嚴(yán)謹(jǐn)方式復(fù)制，拷貝數(shù)低，pCoE1，pMBI(pUC)類的復(fù)制子（復(fù)制起始部位）的拷貝數(shù)高達(dá)500以上，是表達(dá)載體常用的。通常情況下質(zhì)?？截悢?shù)和表達(dá)量是非線性的正相關(guān)，當(dāng)然也不是越多越好，超過細(xì)胞的承受范圍反而會(huì)損害細(xì)胞的生長。如果碰巧需要2個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，就

11、要考慮復(fù)制元（？）是否相容的問題。 （7）融合Tag：基因融合是將兩個(gè)或多個(gè)開放閱讀框按一定順序連接起來，并且正確讀碼。在表達(dá)靶蛋白是加上融合標(biāo)簽的好處，（a保護(hù)靶蛋白免受原核宿主蛋白酶的降解；b提供親和純化的配基結(jié)合位點(diǎn)；c改善靶蛋白的溶解性，使其正確折疊；d與已知酶或抗原結(jié)構(gòu)域連接，可以進(jìn)行標(biāo)記和分離；e與信號(hào)肽連接，可將融合蛋白分泌到特定細(xì)胞區(qū)域。） 注：選擇融合蛋白表達(dá)載體時(shí)，融合標(biāo)簽與靶蛋白的連接處如果有酶切位點(diǎn)，且想除去標(biāo)簽，則載體的酶切序列在靶蛋白中不能出現(xiàn)。 二、 選擇表達(dá)宿主 首先要看靶基因中有沒有細(xì)菌不常用的密碼子如果有，需要考慮換表達(dá)菌株。每種菌株都有自己獨(dú)特的設(shè)計(jì)，或者

12、是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質(zhì)粒在細(xì)菌中存在更穩(wěn)定，表達(dá)的產(chǎn)物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7 RNA聚合酶片段整合在細(xì)菌中的菌株才可用于表達(dá)。采用不同調(diào)控機(jī)制會(huì)使用不同的表達(dá)菌株，所以換菌株一定要仔細(xì)看過載體的調(diào)控方式再換。以Novagen為例，如果使用BL21(DE3)表達(dá)不成功的話可以換Rosetta系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與pET 相容的質(zhì)粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA 的tRNA。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達(dá)限制。有時(shí)不明原因的表達(dá)蛋白截短（比預(yù)期的分子量要

13、小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)谋镜妆磉_(dá)產(chǎn)物抑制。 1.原核表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌） 優(yōu)點(diǎn)：遺傳圖譜明確容易培養(yǎng)且費(fèi)用低對許多外源蛋白耐受能力強(qiáng)能高水平表達(dá)這些蛋白 缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)不能進(jìn)行翻譯后修飾（在真核高爾基復(fù)合體中的糖基化修飾，特點(diǎn)位點(diǎn)的切割等產(chǎn)生具有活性的蛋白）具有密碼子的偏好（？） 2.真核表達(dá)系統(tǒng) 優(yōu)點(diǎn)：可以產(chǎn)生修飾的蛋白 缺點(diǎn)：真核表達(dá)系統(tǒng)復(fù)雜費(fèi)用高 注：不同的表達(dá)宿主有相應(yīng)的表達(dá)載體，二者應(yīng)是最佳表達(dá)組合。 Part構(gòu)建重組子一、 重組子的構(gòu)建 1. 設(shè)計(jì)引物：a保證引物序列擴(kuò)出的靶基因插入到表達(dá)載體MCS上，能夠正確讀碼；b引物兩端加入酶切位點(diǎn)；c遵循引

14、物設(shè)計(jì)原則（一般性引物自動(dòng)搜索可采用“Premier Primer 5”軟件，而引物的評(píng)價(jià)分析則可采用“Oligo 6”軟件）。 2. 擴(kuò)增靶基因： （1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán) 獲得所需基因片段。 （2）通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行 PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。 注：但在PCR過程中，需要減少突變的發(fā)生，可采用高保真酶，盡量減少PCR循環(huán)次數(shù)，增加模板和引物的濃度。尤其注意不要引入終止 密碼子。 3

15、. 限制性內(nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因： （1）載體雙酶切后回收：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。（減少假陽性的重組質(zhì)粒連接，去除切下的小片段多克隆位點(diǎn)） （2）PCR產(chǎn)物雙酶切后回收：限制性消化和膠純化是制備插入片段的常規(guī)方法。一般先用PCR擴(kuò)增帶酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因，克隆進(jìn)T載體，然后用與消化載體相同的內(nèi)切酶進(jìn)行消化和膠回收。 注：雙酶切后，進(jìn)行回收純化，可以提高陽性克隆的幾率。 4. 連接目的基因和載體 二、 重組子的驗(yàn)證 1. 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌（感受肽的制備，轉(zhuǎn)化） 2. 鑒定帶有重

16、組質(zhì)粒克?。撼Ｓ梅椒ǖ挠?互補(bǔ)、小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切分析、PCR以及雜交篩選。如果亞克隆成功，陽性菌落數(shù)遠(yuǎn)大于陰性菌落（甚至全部為重組子）。 3. 篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，DNA 序列測定。（正確測序） 測序結(jié)果出來后，首先，看看載體的多克隆位點(diǎn)和片斷插入的序列，是否有因?yàn)槊盖羞B接而意外引入了轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，讀碼是否正確，這是最有說服力的鑒定結(jié)果。有時(shí)載體幾經(jīng)多個(gè)實(shí)驗(yàn)人員的周轉(zhuǎn)，反復(fù)插入片斷，或者是粘端相同的不同酶切片斷之間的連接，會(huì)意外在啟動(dòng)子后面帶入終止位點(diǎn)，特別是用到XbaI之類的酶要小心。 然后要對測序結(jié)果進(jìn)行確定，確定插入的每個(gè)堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。 注：長期保

17、存的重組子在高濃度甘油（19）中會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定，即脫質(zhì)粒?？梢詫⑤d體和宿主分別保存。 Part誘導(dǎo)表達(dá)一、 誘導(dǎo)表達(dá) 1. 誘導(dǎo)表達(dá)類型 組成型表達(dá)：表達(dá)載體的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子，也就是一直努力不停表達(dá)目的蛋白的啟動(dòng)子，如pMAL系統(tǒng)。持續(xù)性表達(dá)通常表達(dá)量比較高，成本低，但是不適合表達(dá)一些對宿主細(xì)菌生長有害的蛋白。因?yàn)檫^量或者有害的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)影響細(xì)菌的生長，反過來影響表達(dá)量的積累。 誘導(dǎo)調(diào)控型表達(dá)：表達(dá)載體采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，只有在誘導(dǎo)劑存在的條件下才能表達(dá)目的產(chǎn)物。這種方法有助于避免菌體生長前期高表達(dá)對菌體生長的影響，又可減少菌體蛋白酶對目標(biāo)產(chǎn)物的降解。特別適合解決有毒蛋白的表達(dá)。另外也有

18、啟動(dòng)子是組成型的，但是啟動(dòng)子所依賴的轉(zhuǎn)錄酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，也屬于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。 融合表達(dá)：表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上有一段融合表達(dá)標(biāo)簽（Tag），表達(dá)產(chǎn)物為融合蛋白（有分N端或者C端融合表達(dá)），方便后繼的純化步驟或者檢測。對于特別小的分子建議用較大的Tag（如GST）以獲得穩(wěn)定表達(dá)；而一般的基因多選擇小Tag以減少對目的蛋白的影響。His-Tag是最廣泛采用的Tag。 分泌表達(dá)：在起始密碼和目的基因之間加入信號(hào)肽，可以引導(dǎo)目的蛋白穿越細(xì)胞膜，避免表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的過度累積而影響細(xì)胞生長，或者形成包含體，而且表達(dá)產(chǎn)物是可溶的活性狀態(tài)不需要復(fù)性。通常這種分泌只是分泌到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間的周質(zhì)空間。 可溶

19、性表達(dá)：大腸桿菌表達(dá)效率很高，特別是強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白來不及折疊而形成不溶的包含體顆粒，包涵體容易純化但是復(fù)性效率不高（非常股復(fù)雜）。分泌表達(dá)可以得到可溶的產(chǎn)物，也有部分融合Tag有助于提高產(chǎn)物的可溶性，比如Thio，pMAL系統(tǒng)。 2.誘導(dǎo)表達(dá) （1）挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB（含Amp50g/ml）中37過夜培養(yǎng)。 （2）按150比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中, 37震蕩培養(yǎng)至OD6000.4-1.0（最好0.6，大約需3h。 （3）取部分液體作為未誘導(dǎo)的對照組,余下的加入100mMIPTG至終濃度為0.4mM（T7啟動(dòng)子）或1 mM（T7l

20、ac啟動(dòng)子），作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù) 37震蕩培養(yǎng)3h。 （4）分別取菌體1ml, 離心12000g30s收獲沉淀，用PBS重懸、洗滌、離心。 （5）對細(xì)菌沉淀進(jìn)行處理，做SDS-PAGE等分析。 3.注意事項(xiàng)： （1）關(guān)于表達(dá)不出來的原因有很多 a如果測序都是正確的話，設(shè)計(jì)一個(gè)postive expression control，驗(yàn)證整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)沒問題。 b檢測是否有毒性。涂一個(gè)IPTG的板子看菌落生長情況如何。 c 看看稀有密碼子情況，是不是存在成簇的N端的稀有密碼子。 d看看穩(wěn)定性，上swiss prot看看在大腸桿菌中的穩(wěn)定時(shí)間是多少。 e如果表達(dá)的是真核蛋白，可能問題更復(fù)雜，可能涉及到

21、伴侶蛋白等問題？ f 有人會(huì)檢測mRNA的穩(wěn)定性。 g可以用親和層析等辦法富集你的目的蛋白，然后再跑膠。因?yàn)橛袝r(shí)你的目的蛋白表達(dá)豐度過低，SDS-PAGE檢測不到。 （1）提高外源基因表達(dá)水平的基本手段之一，就是將宿主菌的生長與外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段，以減輕宿主菌的負(fù)荷。 （2）IPTG：IPTG濃度0.2-0.5mM IPTG足夠了，不會(huì)降低表達(dá)量，反而會(huì)增加蛋白的可溶性。IPTG濃度過高，易使蛋白表達(dá)速度增大，來不及正確折疊而產(chǎn)生不溶性蛋白（包涵體）。T7lac啟動(dòng)子是嚴(yán)謹(jǐn)啟動(dòng)子，IPTG誘導(dǎo)時(shí)可以優(yōu)化最佳濃度（25uM-1mM之間）使目的蛋白達(dá)到最佳的活性和溶解性。 （3）溫度：一般

22、37誘導(dǎo)3-4小時(shí)，30誘導(dǎo)6小時(shí)是蛋白表達(dá)的最大產(chǎn)量期。22、18、16等低溫誘導(dǎo)時(shí)間在12h-48h。低溫誘導(dǎo)可使蛋白緩慢合成，利于蛋白正確折疊形成可溶性蛋白。為了得到更多的可溶性蛋白，可以考慮將溫度再降（但表達(dá)總量會(huì)有所降低），可以考慮25，誘導(dǎo)8-10個(gè)小時(shí)；20誘導(dǎo)14-18個(gè)小時(shí)；甚至1524-36小時(shí)誘導(dǎo)。 二、 檢測誘導(dǎo)表達(dá) 1.細(xì)菌的裂解裂 常用方法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法；酶溶法；化學(xué)滲透等。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法、已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。 下面介紹酶溶法和超聲破碎法結(jié)合使用的實(shí)驗(yàn)步驟。 （1）常用的溶解酶有溶菌酶

23、；-1,3 -葡聚糖酶；-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要對細(xì)菌類有作用，而其他幾種酶對酵母作用顯著。4 ，5000rpm 離心，15 min ，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（30 mL ）。棄上清，1mL 裂解緩沖液，懸浮沉淀，30作用1h。 （2）超聲破碎細(xì)菌，40w,10s,10s,50次；12000rpm ,4 離心，15min ，分別收集上清液和沉淀。分別取少量上清和沉淀，加入等體積的2 凝膠電泳加樣緩沖液，待檢測。 注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類型等因素有關(guān)，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前，標(biāo)本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。 2

24、進(jìn)行SDS PAGE檢測 （1）表達(dá)結(jié)果： a細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；b包涵體形式表達(dá)。 （2）包涵體的純化 a包涵體的洗滌；b包涵體的溶解；c包涵體的檢測 從基因角度改造一下，如果能夠去掉一些疏水區(qū)段會(huì)很大程度上改善蛋白的可溶性 （4）注意事項(xiàng) a所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質(zhì)發(fā)生變性； b根據(jù)自己的需要選擇不同的表達(dá)載體，并注意不同的表達(dá)載體上的融合標(biāo)簽和攜帶的抗性基因，其中有些標(biāo)簽是可以去除的。具體的序列和說明 都可以從中下載。 c包涵體蛋白溶液保存在四度里，避免反復(fù)凍融，否則體系不穩(wěn)定，蛋白以沉淀析出；胞質(zhì)蛋白不能在四度放置很久，因?yàn)樯锨逯泻泻芏嗟鞍酌?，?huì)把靶蛋白降解掉。 1. 了解實(shí)驗(yàn)

25、課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達(dá)目的（是蛋白結(jié)晶、藥劑結(jié)合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內(nèi)表達(dá)還是分泌表達(dá)，是組成型表達(dá)還是誘導(dǎo)型表達(dá)；另外，還要了解蛋白表達(dá)后需要采用什么樣的方式進(jìn)行純化，純化標(biāo)簽有多大，蛋白純化后是否需要將標(biāo)簽去除（即標(biāo)簽的存在是否會(huì)影響蛋白的活性）。還要對目的蛋白進(jìn)行稀有密碼子（僅限于真核生物基因通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)參考，注意稀有密碼子的多少，位置5位或3位，稀有密碼子是否成串出現(xiàn)等）和可溶性網(wǎng)上預(yù)測等。稀有密碼子預(yù)測網(wǎng)址：.ru/eng/scripts/01_11.htmlhttp:/w

26、/mmaduro/codonusage/usage.htm/RACC//sumchan/caltor.html原核表達(dá)蛋白可溶性預(yù)測網(wǎng)址：/綜合以上，選取合適的表達(dá)載體及宿主菌。注意：不是所有的標(biāo)簽都是用來純化蛋白的，有的標(biāo)簽有促進(jìn)蛋白溶解的作用，有的則是二硫鍵形成或利于表達(dá)后蛋白的檢測。一般我們最常用的是胞內(nèi)誘導(dǎo)型表達(dá)（即蛋白翻譯后是存在于細(xì)胞內(nèi)，通過加誘導(dǎo)物的方法來控制表達(dá)水平）。2. 搜索要表達(dá)的目

27、的基因的序列，根據(jù)其編碼區(qū)序列來設(shè)計(jì)引物；注意：要注意在引物上加入限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)（首先應(yīng)分析蛋白編碼區(qū)內(nèi)是否含有相同的內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)），并通過查閱資料看兩種酶（上下游引物分別加入酶切位點(diǎn)）是否可以在同一反應(yīng)體系中起作用，并注意標(biāo)簽序列是在N端還是在C端，若要在C端保留標(biāo)簽，則需要將下游引物的終止密碼子替換掉；若要在引物上引入標(biāo)簽序列，則引物上應(yīng)加入標(biāo)簽序列堿基（即在上游引物或下游引物處引入His的密碼子）；另外，還要注意引物不能造成蛋白的編碼框發(fā)生改變；1，2步的分析至關(guān)重要，只有在完成前兩步的工作后才可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。3. 搖菌，進(jìn)行RNA抽提（注意選取不同表現(xiàn)型的菌株），搖菌的

28、時(shí)間一定不要太長，太長的話RNA活性不高；4. mRNA反轉(zhuǎn)成cDNA（此步應(yīng)在第三步完成后立即操作，RNA存放時(shí)間長易降解）；5. 以cDNA為模板，利于設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；6. 通過膠回收試劑盒回收目的DNA片段。真核基因組DNA的克隆cDNA的克隆化技術(shù)的成熟，很多染色體的mRNA互補(bǔ)的序列已弄清楚，為豐富人體遺傳信息庫做出了貢獻(xiàn)。除此以外，真核細(xì)胞染色體DNA消化后的片段，合適的載體進(jìn)行克隆，也是得到目的基因的重要方法。染色體DNA序列大部分含有插入序列，即內(nèi)含子（intron)內(nèi)含子的數(shù)量不等。而cDNA則僅代表了外顯子(exon）的序列。大腸桿菌等原核細(xì)胞不能識(shí)別真核細(xì)胞染

29、色體DNA的內(nèi)含子，因此其表達(dá)研究，僅可應(yīng)用cDNA，而不能應(yīng)用真核基因組帶有內(nèi)含子的DNA，基因治療中的目的基因，既可選擇。DNA，也可選擇染色體DNA。一、染色體DNA克隆的載體構(gòu)建染色體DNA文庫并進(jìn)行克隆的載體有兩大類：入噬菌體載體和粘粒載體。質(zhì)粒載體其容量有限，而染色體DNA由于帶有內(nèi)含子序列而較長；單鏈絲狀噬菌體載體僅用于克隆單鏈DNA,因此質(zhì)粒載體和單鏈絲狀噬菌體載體都不適用干染色體DNA的克隆。由于粘?？山蛹{近45kb的外源DNA，幾乎是入噬菌體載體載量的2倍，因此，在一個(gè)哺乳動(dòng)物基因組DNA文庫中，僅需350000個(gè)重組枯粒，則可望某一特定的單拷貝序列存在于其中的概率達(dá)99。

30、然而，在粘粒中構(gòu)建和貯存文庫要比在入噬菌體中更困難得多，因而只有當(dāng)靶基因過大，而不能為單個(gè)入噬菌體所包容，或者要分離一系列跨過染色體DNA特大區(qū)段的重疊克隆時(shí)，才采用粘粒。染色體DNA克隆最為常用的載體還是入噬菌體載體。以入噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體盡管已是分離眾多真核cDNA及基因組DNA的有力工具，但它們也只能接納大小在一定范圍內(nèi)的插入片段。許多基因由于過于龐大，而不能作為單一片段克隆于這些載體之中，如人凝血因子訊基因長達(dá)180kb，肌營養(yǎng)不良基因至少長1800kb，因此需要建立容量更大的克隆載體。酵母人工染色體（YAC）方法的建立，使克隆DNA大區(qū)段的工作至少有了可循之經(jīng)。使用YAC載體進(jìn)行克隆時(shí)，基因組DNA須在剪切力較小的條件下從實(shí)驗(yàn)組織中小心制備，以便得到平均數(shù)百萬堿基對大小的片段。隨后應(yīng)用一限制酶（如EcoRD部分消化DNA，以產(chǎn)生平均大小為20。一500kb的大片段這些片段再連接到經(jīng)過適當(dāng)處理以防止自身環(huán)化的YAC載體兩臂上。除EooRI以外，也可用Notl和Mlul一類切點(diǎn)稀少的限制酶進(jìn)行完全消化。二、從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離高分子量D