川佛手總黃酮提取及抗氧化性研究pdf

1、340一江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年第 3期姜立春，黃成思，楊 澈，等川佛手總黃酮提取及抗氧化性研究J江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(3)：340342川佛手總黃酮提取及抗氧化性研究姜立春，黃成思 ，楊 澈 ，阮期平(1綿陽師范學(xué)院分子生物學(xué)與生物制藥重點實驗室 ，四川綿陽 621000；2吉林師范大學(xué)，吉林四平 136000)摘要：研究藥用植物川佛手總黃酮的最佳提取工藝，為該藥材質(zhì)量研究奠定基礎(chǔ)。以佛手作為研究材料，采用單 因素和正交試驗優(yōu)化了提取工藝，用 pH值梯度法和溶劑萃取法對粗黃酮進行了純化精制，并對其抗氧化性進行了研 究。結(jié)果表明：川佛手總黃酮的最適宜提取工藝是提取溫度 60 ，超聲功率為 4

2、20W，提取時間40 min，超聲提取 2 次，采用乙醇濃度 70，料液比為 1：15。精制后的佛手總黃酮對豬油抗氧化能力較強，其抗氧化能力強于檸檬酸。 該提取工藝操作簡單，經(jīng)濟省時，方便可行。關(guān)鍵詞：川佛手；總黃酮；超聲 波輔助法；提取 工藝；抗氧化性中圖分類號：$666901 文獻標志碼：A 文章編號：10021302(2010)03034003佛手(bergamot)系蕓香科柑橘屬植物佛手 CitrusmedicaLvarsarcodactylis(Noot)Swingle的干燥果實。味辛、苦、 酸，性溫，人肝、胃、肺經(jīng)。有舒肝理氣，和胃止痛之功，用于肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔

3、吐等癥 J，主要分 布于 熱帶和亞熱帶。佛手在我國栽培歷史悠久，分布 較廣，四川 、 浙江、福建、江蘇、廣東、廣西等省區(qū)都有種植。在中國藥典(2005年版)和其他文獻記載中，不同產(chǎn)地佛手均來源于 同一種植物，商品佛手因產(chǎn)地不同有廣佛手、川佛手、金佛手和建佛手之分 。藥理實驗表明，佛手 有解痙與中樞抑制作用、對心血管系統(tǒng)作用、抗過敏和抗炎等作用 。黃酮類物 質(zhì)是一類有多種生物學(xué)功能特性的物質(zhì)，廣泛用于醫(yī)藥、保健 食品中，具有抗菌消炎、抗輻射、調(diào)節(jié)毛細血管壁的滲透、血管的脆性、防止血管破裂、止血和對紫外線有極強的吸收以及很 好的抗氧化等作用 。本研究以總黃酮為檢測指標，紫外分 光光度法為檢測手段，

4、利用單因素分析和正交試驗設(shè)計，對川佛手中總黃酮提取 工藝進行了研究，為質(zhì)量控制以及藥理活性等方面研究提供 技術(shù)依據(jù)。1 材料與方法11 材料和儀器川佛手(四川省中江縣)、蘆丁(上海試劑二廠)、豬油(濕 法熬制，市售板油洗凈后文火中熬煉而成，裝入容器中低溫保 存)，其他試劑均為分析純。紫外可見分光光度計(Uhrospec 3300pro)，超純水系統(tǒng)(MilliQ)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BuChi)，數(shù)控超聲波清洗器(KH一600DB)，電子天平 (FA1104)，真空 干燥 箱 (DZF一6050)，恒溫水浴鍋 (HH一6)。12 試驗方法121 材料處理 將川佛手飲片放入恒溫干燥箱內(nèi) ，調(diào)節(jié)溫度5O

5、，干燥 24h。將干燥后的佛手飲片用藥物粉碎機粉收稿日期：20091015 作者簡介：姜立春(1977一 )，男，四川綿陽人，碩 士，講師，從事天然產(chǎn)物和微生物方面的研究。Email：jiangjichun126COI1。 通信作者：阮期平，博士，教授，從事微生物與生化藥學(xué)方面的研究。E mail：rqp2200070 yahoocornvii。碎，將粉末過 3號篩，收集過篩后的粉末 。122 標準曲線繪制 準確稱取經(jīng)干燥恒重的蘆丁標準品 200mg，用濃度 30的乙醇溶解并定容至 100mL，搖勻得濃 度為 02mgmL的蘆丁標準液。分別稱取此標準溶液 0、 10、20、40、60、80、1

6、00mL于 7支 25mL容量瓶中。分別于 7支容量瓶依續(xù)首先加入 30 乙醇溶液至 l25mL，再 加入 07 mL質(zhì) 量分數(shù)為 5 的亞硝酸鈉溶液，搖 勻，放置6min，然后加入 07mL質(zhì)量分數(shù)為 10的硝酸鋁溶液，搖 勻，放置6min，后加入 5mL1molL的氫氧化鈉溶液混勻，最 后用30的乙醇定容至刻度，放置 10rain。以蒸餾水為空白 參比，于 510nm測定吸光度值，以吸光度 Y為縱坐標，黃酮濃度 為橫坐標，繪制標準曲線 。123 提取溶劑的選擇 (1)水提取法。精確稱取佛手粉 4g共4份，各用20mL石油醚回流 2h脫脂去雜質(zhì)。分別將 4份脫脂后的佛手粉用定性濾紙過濾，用石

7、油醚洗脫濾液直 至無色，收集濾渣。將濾渣放入烘箱內(nèi) 50干燥，收集干燥 后的干粉。向干粉中加入蒸餾水 ，將 3份混合物分別放入 50、60、70、80恒溫水浴鍋中浸提 1h，浸提過程中定時振 蕩。1h后將浸提液分別過濾，收集濾液得到粗黃酮提取液， 然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至 25 mL，準備測吸光度計算提取率 和測定提取物中黃酮含量。(2)乙醇提取法。方法見水提取 法，其中用冷凝回流裝置分別置于 50、6O、7O、8O恒溫水浴鍋回流 1h，測定提取物中黃酮含量。 (3)超聲波輔助法提取工藝。方法見水提取法，其中加入70的乙醇40mL，分別于50、60、70、80，360W 超聲輔助提取 1h，測定

8、提取物中黃 酮含量。124 正交試驗方案設(shè)計 試驗結(jié)果可知超聲輔助提取佛手中總黃酮得率最高，為了綜合考慮各種影響因素的主次順序，從單因素試驗結(jié)果中挑選出影響提取率較大的4個因素， 為了全面考察這4個因素的作用大小和優(yōu)化組合，根據(jù)超聲 時間、提取次數(shù)、超聲溫度、超聲頻率設(shè)計了4因素 3水平的 正交試驗(其中固定因素乙醇濃度為 70，料液 比為 1g：15 mL)。125 粗黃酮純化 獲得川佛手中總黃酮的粗提液 ，首先用 試紙檢測其 pH值在 46之 問，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃 縮，得到浸膏，用蒸餾水溶解 約至 10mL，將 得到的樣品溶液姜立春等：川 佛手總黃酮提取及抗氧化性研究341，轉(zhuǎn)入分液

9、漏斗，用等體積正丁醇(約為 10mL)萃取 46次，直至正丁醇顏色基本恢復(fù)原色為宜，收集幾 次萃取的正丁醇層，棄去下層水層。將合并的46次正丁醇層約為 4060mL，用等體積的 1 NaOH溶液同樣萃取 46次，棄去上層有機溶劑正丁醇層，合并幾次 1 NaOH層，將合并后的溶 液用濃鹽酸調(diào)節(jié) pH值重回到46，再用正丁醇反萃取 46 次，最后收集幾次萃取后的正丁醇層，棄去下層水層。將最后合并得到的正丁醇層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到浸膏，稱 重，再用 70的乙醇溶解成相應(yīng)濃度的精制黃酮提取液 ，為下一步抗 氧化試驗做準備。126 總黃酮含量測定 取定容后的佛手提取液 1 mL于25mL容量瓶 ，加入

10、14mL30的乙醇 ，再加 07mL質(zhì)量分 數(shù)為 5的亞硝酸鈉溶液，搖勻，放 置 6min，然后 加入 07mL質(zhì)量分數(shù)為 10 的硝酸鋁溶液，搖勻，放置 6 min，再加入5mL1molL的氫氧化鈉溶液混勻 ，最后用 30的乙醇定容 至刻度，放置 10min。于波 長 510nm處測定 吸光度值，根 據(jù) 標準曲線計算總黃酮含量。13 抗氧化性能測定新鮮豬板油切成Q小 塊，濕法 熬煉，雙 層紗布過濾除去殘O O O O O 0 O O 0渣，冷卻密封后放人低溫冰箱備用。添加物用少量乙醇溶解，各加入 20g新鮮豬油 中，置 50水浴中緩慢加 熱融化油樣，并在升溫過程中不時攪拌使成均相，另取一瓶加

11、同樣豬油為空白。(60±1)恒溫箱中強化保存，每隔 12h攪拌 1次， 并交換在烘箱中的位置，以確保環(huán)境條件 相同。每 24h定 時 測定 POV值 。每次樣后充分振搖，以混入 足夠的空氣。取雙 份平行樣，按 GBT5009·37一 l996測定 POV值，以 POV值達到 20meqkg油計算其誘導(dǎo)期，比較不同抗氧化劑的抗氧化性 。計算公式為：POV()=1269×C×( 一 )×100 (1000×m)；式中， 為樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積 (mL)； 為空白試劑消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積 (mL)；C為硫代硫酸鈉標準溶液

12、的濃度 (molL)；m 為樣品 質(zhì)量 (g)；1269為碘 的摩爾質(zhì)量 (gmo1)。 和 的測定 是精確稱取 3g樣品，置 于碘量瓶中，加入 30mL氯仿 一冰乙 酸混合溶液樣品，再加入 1mL飽和碘化鉀溶液，搖勻，放置暗 處 5min，然后加水 100mL，以 0002molmL硫代硫酸鈉標準 溶液滴定至淡黃色時，加 1mL淀粉指 示劑，繼續(xù) 滴定至藍色 消失為止。以空白試劑滴定為參考。空白試劑消耗硫代硫酸 鈉標準溶液的體積為 296mL。分別在豬油 中加入了同濃度 的提取液己二酸四乙酸二鈉 (EDTA)和檸檬酸，每 24h測 定1次 POV值，確定其抗氧化性強弱。2 結(jié)果與分析21 標

13、準曲線繪制以“122”所示方法進行測定，由 圖 1得 回歸方程 Y= 11578x+00028，r =09999。由 r2值可知，吸光度與蘆丁 濃度有良好的線性關(guān)系。22 正交試驗設(shè)計通過預(yù)試驗，比較提取方法，包括水提取 、乙醇回流提取、超聲提取，結(jié)果超聲提取法提取率較高。從以上單因素試驗 可以看出，提取率受到超聲時間、浸提次數(shù)、提取溫度、超聲頻濃度 (mgmL) 圖1 蘆丁標準曲線率這 4個因素的影響較大，為了全面考察這 4個因素的作用 大小和優(yōu)化組合，設(shè)計了4因素 3水平 【J9(3 )的正交表進行試驗 (表 1)。其結(jié)果見表 2和表 3。表 1 正交試驗因素水平1553077651434

14、P <O050916045830332P <O05003000151O00P >OO50225O1137460尸 >Oo5F0()5(2，2)=19，F(xiàn)o0l(2，2)=99。由表 2、表 3可知，以上 4個因素對佛手黃酮提取率 的影 響大小依次為：提取 時間 (A)>提 取溫度 (B)>提取 次數(shù)(D)>超聲功率(C)，提取時間的影響最大。表明佛手黃酮 超聲提取最佳工藝組合為：A，B：C D：，即在溫度為 6O，料 液比為 1g：15mL，用 70乙醇超聲提取 2次，每次40ainr。 在此條件下佛手黃酮得率達512。在最優(yōu)條件下，重復(fù)試驗 5次，平

15、均得率為 536。江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)23 方法學(xué)考察231 精確度試驗 精確量取20mL質(zhì)量濃度為020gL 的標準溶液，置于25mL量瓶，加體積分數(shù) 95乙醇至刻度，測吸光度。重復(fù)操作 5組，RSD值為 0683 。232 重復(fù)性試驗 根據(jù)正交試驗結(jié)果 ，重復(fù)操作 5組，根據(jù)測定結(jié)果計算 RSD值為 1489。233 加樣回收率試驗 取藥材 05 g，加入質(zhì)量濃度為20gL的標準溶液25mL，按照試驗所得最佳提取工藝處 理藥材，得到供試液，重復(fù)操作 6組。510nm處測其吸光度， 計算藥材總黃酮含量。測得加樣回收率為 9958，RSD值為 2589 。24 佛手中黃酮類化舍物對豬油的抗氧化活性研究

16、 大量研究結(jié)果表明，黃酮類化合物 B環(huán)中的鄰二羥基對黃酮類化合物的抗氧化活性起主要作用。黃酮類化合物是通 過形成共振穩(wěn)定的具有醌式結(jié)構(gòu)的自由基而起抗氧化作用的，在這一點上，C4 一羥基和 c4一羰基對黃酮和異黃酮的穩(wěn) 定作用是最重要的因素。除此之外，影響黃酮類化合物抗氧 化作用的結(jié)構(gòu)因素還有 c3位羥基和 c5位羥基。黃酮類與0 、·OH的反應(yīng)相當于一個連鎖反應(yīng)在終結(jié)階段的反應(yīng) ，在消除0 、·OH一FgI)的反應(yīng)0中起著氫供體的作用，使具有高度氧化活性的自由基還原，從而達到消除的 目的。241 佛手不同濃度提取物的抗氧化性能比較 川佛手總黃酮粗提物、精制物對豬油的抗氧化能

17、力隨時間變化情況見圖 2。試驗結(jié)果表 明：在豬油中添加佛手總黃酮后，可顯著抑制豬油的氧化，無論是粗提物還是精制物均具有明顯的抗氧化性，且隨濃度 的增大而增強。在初期，二者 均可降低 POV值，說明佛手黃酮不僅能抑制豬油的自動氧化，而且能很好地 去除豬油中已有的過氧化物 。川I佛手精制黃酮與同濃度 的粗制黃酮相比，其抗氧化能力均強于同濃度粗制黃酮，并且隨著時間的延長，抑制能力降低。1008060402O2010年第 3期lOO一 。目一>0山8060402O001 2 3 4 5時間 (d)圖3 不同抗氰劑對豬油的抗氧化作用3 討論通過單因素和正交試驗設(shè)計確定超聲波輔助法提取川佛手黃酮的最

18、適宜工藝條件為：乙醇體積分數(shù) 70，提取時間 40rain，提取溫度60，提取2次，超聲功率為420w，固定因 素料液比為 1g：15mL。各因素對黃酮提取量影響的主次順 序為：提取時間(A)>提取溫度(B)>提取級數(shù)(D)>超聲功率 (C)。在最優(yōu)條件下，重復(fù) 5次，平均得率為 536。該法簡便快捷，得率較高，重現(xiàn)性好，可為工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)參考。將川佛手粗黃酮溶于 70乙醇中，過濾、減壓蒸餾，分別 依次加入正丁醇和 1氫氧化鈉進行萃取精制。將精制后的 黃酮提取液和粗黃酮提取液同濃度用于抗氧化試驗，結(jié)果表 明精制后的黃酮提取液抗氧化能力有所增強，說明這種簡單的精制方法比較有效。川佛手黃酮在豬油中的抗氧化性能試驗說明川佛手黃酮對豬油有較強的抗氧化能力，隨添加量的增加，抗氧化能力也隨之增強?？寡趸芰娪谕瑵舛葯幟仕岬陀?EDTA。表明佛手黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，可創(chuàng)造經(jīng)濟價值，值得進一步開發(fā)利用。參考文獻：1國家藥典委員會中國藥典：一部 s北京 ：化學(xué)工業(yè)出版社，