現(xiàn)代分子生物學(xué)(第3版)總復(fù)習(xí)

1、分子生物學(xué)總復(fù)習(xí)分子生物學(xué)總復(fù)習(xí)題 型：1、單項選擇題 1分302、判斷題 1分103、名詞解釋 3分54、問答題 10分35、綜合題 15分1總評總評=70%考試成績考試成績+10%平時成績平時成績+20%實驗成績實驗成績 染色體與DNA真核細胞染色體與原核細胞染色體的主要區(qū)別：真核細胞染色體與原核細胞染色體的主要區(qū)別：數(shù)量：數(shù)量：真核數(shù)量多真核數(shù)量多原核一般只有一條原核一般只有一條位置：位置：真核的染色體位于細胞核的核仁真核的染色體位于細胞核的核仁原核的染色體位于擬核原核的染色體位于擬核組成方式：組成方式：真核染色體的真核染色體的DNADNA與蛋白質(zhì)完全融合在一起與蛋白質(zhì)完全融合在一起原核

2、染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)原核染色體外裹著稀疏的蛋白質(zhì)原核生物與真核生物基因組的特點原核生物結(jié)構(gòu)簡練結(jié)構(gòu)簡練存在轉(zhuǎn)錄單元：多順反子存在轉(zhuǎn)錄單元：多順反子有重疊基因有重疊基因含有大量重復(fù)序列：含有大量重復(fù)序列：有哪幾種重復(fù)序列？有哪幾種重復(fù)序列？功能功能DNA序列大多被非功能序列大多被非功能DNA所隔開（外顯子和內(nèi)含子）所隔開（外顯子和內(nèi)含子）存在C值矛盾（C-value paradox)真核生物2.1.3 2.1.3 染色體的組裝染色體的組裝核小體的組成成分？核小體的組成成分？核小體是如何一步一步組裝成染色體的？整個過程中的壓縮情況如何？核小體是如何一步一步組裝成染色體的？整個過程中的壓縮情況如

3、何？ 2.3 DNA2.3 DNA復(fù)制的幾個基本原則復(fù)制的幾個基本原則半保留復(fù)制：半保留復(fù)制： 含義及具體過程含義及具體過程半不連續(xù)復(fù)制：半不連續(xù)復(fù)制：含義及具體過程；崗崎片斷、前導(dǎo)鏈、隨從鏈含義及具體過程；崗崎片斷、前導(dǎo)鏈、隨從鏈 RNARNA引物：引物： 作用，為什么需要作用，為什么需要RNARNA引物？引物？復(fù)制的真實性的保證：復(fù)制的真實性的保證： DNADNA復(fù)制過程中有哪些機制保證其遺傳復(fù)制過程中有哪些機制保證其遺傳 信息的穩(wěn)定性信息的穩(wěn)定性 DNA解開成單鏈的過程中，解開成單鏈的過程中，拓?fù)洚悩?gòu)酶、解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白分別起什么作用？復(fù)制叉、復(fù)制子的概念復(fù)制叉、復(fù)制子的概念無論是原

4、核生物還是真核生物，無論是原核生物還是真核生物，DNA的復(fù)制的復(fù)制主要是從固定的起始點以主要是從固定的起始點以雙向雙向等速等速復(fù)制方式進行的復(fù)制方式進行的。RNA引物在復(fù)制過程中的作用？引發(fā)體的大概組裝過程引物在復(fù)制過程中的作用？引發(fā)體的大概組裝過程復(fù)制的延長其化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵復(fù)制的延長其化學(xué)反應(yīng)的本質(zhì)是生成磷酸二酯鍵復(fù)制的終止過程：復(fù)制的終止過程：線性線性DNA雙鏈的復(fù)制和環(huán)狀雙鏈的復(fù)制和環(huán)狀DNA雙鏈的復(fù)制的雙鏈的復(fù)制的常見復(fù)制類型常見復(fù)制類型 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA聚合酶聚合酶I和和III的特點的特點2.1 DNA2.1 DNA損傷的原因及部位：損傷的原因及部位：損傷原

5、因：復(fù)制錯誤、損傷原因：復(fù)制錯誤、DNA重組、物理化學(xué)因子重組、物理化學(xué)因子損傷部位：損傷部位：堿基、戊糖或是磷酸二酯鍵堿基、戊糖或是磷酸二酯鍵2.2 DNA2.2 DNA損傷修復(fù)的類型：損傷修復(fù)的類型：錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、 核苷酸切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、 DNA直接修直接修復(fù)復(fù)DNADNA轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座一段一段DNADNA順序可以從原位上單獨復(fù)制或斷裂下來，順序可以從原位上單獨復(fù)制或斷裂下來，環(huán)化后插入另一位點，并對其后的基因起調(diào)控作用，環(huán)化后插入另一位點，并對其后的基因起調(diào)控作用，此過程稱此過程稱轉(zhuǎn)座轉(zhuǎn)座。這段序列稱。這段序列稱跳躍基因跳躍基因或或轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子. .

6、 麥克林托克麥克林托克(B. McClintock)(B. McClintock)因首先在玉米中因首先在玉米中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座因子而獲得了發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座因子而獲得了19831983年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。轉(zhuǎn)座子的種類：轉(zhuǎn)座子的種類：插入序列、類插入序列、復(fù)合轉(zhuǎn)座插入序列、類插入序列、復(fù)合轉(zhuǎn)座子、子、 TnATnA家族家族 轉(zhuǎn)錄（從轉(zhuǎn)錄（從DNA-RNADNA-RNA） 轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄：生物體以生物體以DNADNA的一條鏈為模板，按照堿基配對原則，在的一條鏈為模板，按照堿基配對原則，在依賴依賴DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶的作用下合成一條與的作用下合成一條與DNADNA鏈的一定區(qū)段互補的鏈的一定

7、區(qū)段互補的RNARNA鏈，這個過程稱鏈，這個過程稱為轉(zhuǎn)錄。為轉(zhuǎn)錄。編碼鏈：編碼鏈：與與RNARNA序列相同的那條序列相同的那條DNADNA鏈，又稱鏈，又稱模板鏈：模板鏈：指導(dǎo)指導(dǎo)RNARNA合成的合成的DNADNA鏈稱，又稱鏈稱，又稱不對稱轉(zhuǎn)錄：不對稱轉(zhuǎn)錄：在多基因的雙鏈在多基因的雙鏈DNADNA分子中，每個基因的模板不是全在同一條分子中，每個基因的模板不是全在同一條鏈上，也就是在雙鏈鏈上，也就是在雙鏈DNADNA分子中的一條鏈，對于某基因是有義鏈，但對另分子中的一條鏈，對于某基因是有義鏈，但對另一個基因則可能是反義鏈。這就是我們所說的不對稱轉(zhuǎn)錄，即模板鏈并一個基因則可能是反義鏈。這就是我們所

8、說的不對稱轉(zhuǎn)錄，即模板鏈并非永遠在同一條單鏈上。不對稱轉(zhuǎn)錄。它有兩方面含義：一是在非永遠在同一條單鏈上。不對稱轉(zhuǎn)錄。它有兩方面含義：一是在DNADNA雙鏈雙鏈分子上，分子上，相對某基因來說相對某基因來說，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模，一股鏈可轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄；其二是模板鏈并非永遠在同一單鏈上板鏈并非永遠在同一單鏈上1 1，信使信使RNA(mRNA)RNA(mRNA)：它占全部它占全部RNARNA的的5%5%左右。大腸桿菌中左右。大腸桿菌中占總占總RNARNA的的2%2%。2 2，轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)RNA(tRNA)：tRNAtRNA在全部在全部RNARNA中約占中約占15

9、%15%，種類在，種類在4040種以上種以上3 3，核糖體核糖體RNA(rRNA)RNA(rRNA)： rRNArRNA一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一般與核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成核糖體。在大腸桿一起形成核糖體。在大腸桿 菌中，菌中，rRNArRNA占細胞總占細胞總RNARNA的的75%75%85% 85% 。 除了上述除了上述3 3種主要的種主要的RNARNA外，還有一些類型的外，還有一些類型的RNA RNA 相同：模板，新鏈延伸方向，堿基的加入原則。相異：引物。信息全保留與信息半保留。底物、與T配對的堿基模板的數(shù)量（一條與兩條）。所需要的酶，及酶的外切活性的有無。大腸桿菌RNA聚合酶的組成1

10、1，E. coliE. coli RNA聚合酶的核酶（ core enzymecore enzyme ）：由2. E. coliE. coli RNA聚合酶的全酶 (holoenzyme)(holoenzyme)：核酶因子l因子負(fù)責(zé)模板鏈的選擇與轉(zhuǎn)錄的起始。不僅能增加聚合酶對啟動子的親和力，還降低它對非專一位點的親和力 聚合酶的組成分析 RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8105dol小，1.09105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5 33 5校對合成能力無有修復(fù)能力無有啟動子（啟動子（ Promoter Promot

11、er ）：位于結(jié)構(gòu)基因5，端上游的一段DNA序列，能被RNA聚合酶識別,結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列 轉(zhuǎn)錄起點轉(zhuǎn)錄起點：指：指RNARNA開始轉(zhuǎn)錄的第一個堿基，此點通常用開始轉(zhuǎn)錄的第一個堿基，此點通常用+1+1表示表示上游（上游（upstreamupstream）：轉(zhuǎn)錄起點的左側(cè)，用負(fù)的數(shù)碼表示：轉(zhuǎn)錄起點的左側(cè)，用負(fù)的數(shù)碼表示 下游（下游（downstreamdownstream）：轉(zhuǎn)錄起點右側(cè)（轉(zhuǎn)錄區(qū)），用正的數(shù)碼表示：轉(zhuǎn)錄起點右側(cè)（轉(zhuǎn)錄區(qū)），用正的數(shù)碼表示 轉(zhuǎn)錄單元轉(zhuǎn)錄單元(transcription unit)(transcription unit)：一段從啟動子開始至終止子結(jié)束的

12、DNA序列.在細菌中，一個轉(zhuǎn)錄單元可以是一個基因，也可以是幾個基因。 啟動子是RNA聚合酶識別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。利用DNase 足跡法和DNA測序法可以確定啟動子的序列結(jié)構(gòu)。DNase 足跡法的基本原理與DNA 化學(xué)測序法有些相似. 首先將待測雙鏈DNA 片段中一條單鏈的一端選擇性地進行末端標(biāo)記, 然后加入恰當(dāng)濃度的DNase , 使在DNA 鏈上隨機形成缺口, 經(jīng)變性后電泳分離, 放射自顯影, 即可形成以相差一個核苷酸為梯度的DNA 條帶. 但當(dāng)DNA 片段與相應(yīng)的序列特異性DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合后, DNA 結(jié)合蛋白可保護相應(yīng)的DNA 序列不受DNase 的攻擊, 因而在放射

13、自顯影圖譜上, DNA 梯度條帶在相應(yīng)于DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷, 從而形成一空白區(qū)域, 恰似蛋白質(zhì)在DNA 上留下的足跡,因而被形象地稱作足跡法. 如果同時進行DNA 化學(xué)測序, 即可判斷出結(jié)合區(qū)的精確順序. 10區(qū)（Pribnow區(qū)） 保守序列： TATAATTATAAT35區(qū)（ sextama box ） 保守區(qū)序列： TTGACATTGACA1 1， sextama box(-35sextama box(-35區(qū)區(qū)) )：RNARNA聚合酶識別位點，聚合酶識別位點，該序列提供了該序列提供了RNARNA聚合酶識別的信號。聚合酶識別的信號。 亞基識別-35序列，為轉(zhuǎn)錄選擇模板。這一序

14、列的核苷這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動子的強度。酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動子的強度。2 2，Pribnow boxPribnow box（-10-10區(qū)）：區(qū)）： RNARNA聚合酶牢固結(jié)合聚合酶牢固結(jié)合位點，此處位點，此處ATAT含量多，有助于含量多，有助于DNADNA局部雙鏈解開。局部雙鏈解開。是使起始復(fù)合物由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變成啟動狀態(tài)的特是使起始復(fù)合物由關(guān)閉狀態(tài)轉(zhuǎn)變成啟動狀態(tài)的特定序列定序列 1，啟動子的識別2，轉(zhuǎn)錄起始3，RNA鏈的延伸4，終止 1.全酶與模板的DNA接觸，生成非專一的,不穩(wěn)定的復(fù)合物在模板上移動；2. 起始識別：全酶與35序列結(jié)合，產(chǎn)生封閉的酶-啟動子二元復(fù)

15、合物（closed binary complex）；3.全酶緊密地結(jié)合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復(fù)合體；4. 酶移動到起點，第一和二個NTP相連,因子釋放,形成酶-啟動子-NTP三元復(fù)合體（ternary complex）。延伸的過程中，RNA聚合酶沿著轉(zhuǎn)錄泡（DNA雙鏈解開而形成，約18堿基對）向前移動轉(zhuǎn)錄泡（transcription bubble）：在轉(zhuǎn)錄延長過程中，由局部打開的DNA雙鏈、RNA聚合酶核心酶及新生成的RNA三者結(jié)合在一起的復(fù)合體，為空泡狀結(jié)構(gòu)，又稱轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。l1，不依賴于(rho)因子 的終止（強終止子）結(jié)構(gòu)特點(1) 有富含GC的二重對

16、稱區(qū)；(2)莖的區(qū)域富內(nèi)含G-C；(3) 強終止子3端上有poly(U) ，一般為6個轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄的終止強終止子終止轉(zhuǎn)錄的機制：強終止子終止轉(zhuǎn)錄的機制：l發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu)改變改變RNARNA聚合酶構(gòu)象，使聚合酶構(gòu)象，使酶停止移動酶停止移動；lDNADNA、RNARNA各自形成自身雙鏈?zhǔn)垢髯孕纬勺陨黼p鏈?zhǔn)闺s交體不穩(wěn)定雜交體不穩(wěn)定而分離；而分離；l3 3 端一連串端一連串U U，UAUA配對最不穩(wěn)定配對最不穩(wěn)定，易從模板上脫落。，易從模板上脫落。依賴于因子的終止的特點：1，轉(zhuǎn)錄的RNA也具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但發(fā)夾結(jié)構(gòu)后無poly(U)2,形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)較疏松，莖環(huán)上不富含GC3，終止需要因子的參與4，

17、與不依賴于因子的終止一樣，終止信號存在于新生的RNA鏈上而非DNA鏈上 RNA Pol轉(zhuǎn)錄DNA 因子附著到RNA 識別位點上 因子跟在RNAPol 后沿RNA移動 RNA Pol在終止位 點停下，并被因 子追上 在轉(zhuǎn)錄泡中因子 使DNA-RNA雜種雙 鏈解開 轉(zhuǎn)錄終止,釋放出 RNA Pol,子 和 RNA返回真核生物的轉(zhuǎn)錄和原核轉(zhuǎn)錄的不同點： (1) 原核只有一種RNA聚合酶，而真核細胞有三種聚合酶； (2) 啟動子的結(jié)構(gòu)特點不同，真核有三種不同的啟動子和有關(guān)的元件； (3) 真核的轉(zhuǎn)錄有很多蛋白質(zhì)因子的介入。 真核生物啟動子的基本結(jié)構(gòu)75區(qū)25區(qū) 1CAAT boxTATA box (h

18、ogness box)80110區(qū)GC box上游啟動子元件（UPE）核心啟動子（core promoter）核心啟動子核心啟動子上游啟動子元件上游啟動子元件1，核心啟動子：指保證RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄正常起始所必需的，最少的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始位點及起始位點上游的TATA盒。核心啟動子單獨起作用時，只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄 起始位點： mRNA的第一個堿基傾向A TATA框： 其一致序列是T T8585A A9797T T9393A A8585A A6363A A8383A A5050， TATA框的作用： (1) 選擇正確的轉(zhuǎn)錄起始位點，保證精確起始， 故也稱為選擇子（sel

19、ector）。 (2) 影響轉(zhuǎn)錄的速率。包括通常位于75 bp 附近的CAAT box（相當(dāng)于原核啟動子的sextama box）和GC box作用：控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，基本不參與起始位點的確定 P 早期轉(zhuǎn)錄基因 A1 A2 A3 0.3 0.7 1 1.1 1.2 1 .3 t RNase pppPu CoH pppPu 前導(dǎo)序列 0.3 0.7 1 1.1/1.2 1.3 mRNA 圖13- T7噬菌體早期區(qū)轉(zhuǎn)錄單條前體RNA，經(jīng)RNase剪切成5條成熟的mRNA,在末端鳥苷的第7位上存在單個甲基化位點的稱O型帽子型帽子,在次末端核苷酸的核糖上的2-0H位點上還有一個甲基位點的稱1型帽子型

20、帽子,此外，在第三個核苷酸的核糖上（2-0H）有甲基化位點的稱2型帽子型帽子 這三種帽子都有特殊面對面核苷酸結(jié)構(gòu)(1)有助于mRNA越過核膜，進入胞質(zhì)；(2)保護5不被酶降解；(3)翻譯時供IF（起始因子）和核糖體識別。加加 帽帽1，特殊組分(CPSF)識別AAUAAA并指導(dǎo)其它的活性2，剪切因子(CF)在加尾位點 AAUAAA下游1130nt 處剪切RNA；3，末端腺苷轉(zhuǎn)移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；4，PBP（poly A結(jié)合蛋白）與poly(A)結(jié)合，反應(yīng)停止。尾巴的功能：尾巴的功能：1,PolyA是mRNA由核進入胞質(zhì)所必需的形式。2,PolyA大大提高mRNA在胞質(zhì)

21、中的穩(wěn)定性。 過過 程：程：選擇性剪接：基因的初始轉(zhuǎn)錄物通過不同的剪接方式而實現(xiàn)的外顯子的選擇性使用。選擇性剪接可以利用同一初級轉(zhuǎn)錄物得到不同的mRNA，翻譯成不同的蛋白質(zhì)。 在人類基因中大約有的基因具有選擇性剪接的形式選擇性剪接的意義：1，選擇性剪接極大地增加了蛋白質(zhì)的多樣性和基因表達的復(fù)雜程度2，性別決定與發(fā)育：選擇性剪接可以調(diào)節(jié)決定性別及發(fā)育相關(guān)蛋白的表達3，許多疾病與mRNA前代選擇性剪接有關(guān)RNARNA編輯編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉(zhuǎn)換等現(xiàn)象。它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變。形式：，單堿基突變，尿苷酸的缺失和添加比較類別原核生物真核生

22、物轉(zhuǎn)錄發(fā)生的場所類核/擬核核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的形式多順反子，有操縱子單順反子，無操縱子轉(zhuǎn)錄所需要蛋白質(zhì)RNA聚合酶聚合酶加大量輔助因子轉(zhuǎn)錄后是否需要加工不需加工與翻譯相偶聯(lián)需加工故與翻譯相分離mRNA的壽命短較長 需要掌握的幾個要點：1，翻譯：以mRNA為模板，按照mRNA分子上的三個核苷酸決定一種氨基酸的規(guī)則（三聯(lián)體密碼）合成具有特定氨基酸順序的蛋白質(zhì)。包括翻譯的起始、肽鏈的延伸、肽鏈的終止與釋放。2，核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，mRNA是蛋白質(zhì)合成的模板，轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）是模板與氨基酸之間的接合體。 此外，在合成的各個階段還有許多蛋白質(zhì)、酶和其他生物大分子參與。 （遺傳學(xué)證據(jù)）1、mRNA模板中

23、插入、刪除一個核苷酸后，該密碼子后面的氨基酸序列全部改變。2、同時插入、刪除一個不同核苷酸后，后續(xù)蛋白質(zhì)不變。3、同時刪除三個核苷酸后，翻譯減少一個氨基酸，序列沒有變化。 煙草花葉病毒外殼蛋白亞基由400個氨基酸組成，而相應(yīng)的RNA片段長約1200個核苷酸一，一，以均聚物、隨機共聚物和特定序列的共聚物為模板指以均聚物、隨機共聚物和特定序列的共聚物為模板指導(dǎo)多肽的合成導(dǎo)多肽的合成二，二， 核糖體結(jié)合技術(shù)核糖體結(jié)合技術(shù)/ /三聯(lián)體結(jié)合實驗：三聯(lián)體結(jié)合實驗： 核糖體結(jié)合技術(shù)的原理及實驗操作核糖體結(jié)合技術(shù)的原理及實驗操作 實驗破譯三聯(lián)子密碼遺傳密碼的性質(zhì)遺傳密碼的性質(zhì)一、遺傳密碼的簡并性：簡并的含義、

24、什么叫同義密碼子、密碼子簡并的一、遺傳密碼的簡并性：簡并的含義、什么叫同義密碼子、密碼子簡并的 生物學(xué)意義、一些常見的密碼子（如起始密碼子、終止密碼子）生物學(xué)意義、一些常見的密碼子（如起始密碼子、終止密碼子）二、密碼子的普遍性與特殊性：含義二、密碼子的普遍性與特殊性：含義三、密碼子的變偶性：含義、擺動假說三、密碼子的變偶性：含義、擺動假說四、密碼子無標(biāo)點、不重疊四、密碼子無標(biāo)點、不重疊tRNAtRNA在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，它不但為每個三聯(lián)密碼子翻譯成氨在蛋白質(zhì)合成中處于關(guān)鍵地位，它不但為每個三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了基酸提供了接合體接合體，還為準(zhǔn)確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供，

25、還為準(zhǔn)確無誤地將所需氨基酸運送到核糖體上提供了了運送載體運送載體tRNAtRNA的三葉草型二級結(jié)構(gòu)：五臂四環(huán)、各區(qū)的作用的三葉草型二級結(jié)構(gòu)：五臂四環(huán)、各區(qū)的作用tRNAtRNA的三級結(jié)構(gòu)：的三級結(jié)構(gòu)：L L型型tRNAtRNA的功能：的功能：識別識別mRNAmRNA鏈上的密碼子；轉(zhuǎn)移氨基酸作用鏈上的密碼子；轉(zhuǎn)移氨基酸作用tRNAtRNA的分類的分類無義突變校正與錯義突變校正的概念、校正無義突變校正與錯義突變校正的概念、校正tRNAtRNA在怎么校正無義突變及錯義突變在怎么校正無義突變及錯義突變原核與真核生物中核糖體的組成分別怎樣？原核與真核生物中核糖體的組成分別怎樣？ 原核生物的起始tRNA是

26、fMet-tRNAfMet，而真核生物是Met-tRNAiMet。原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結(jié)合，再與fMet-tRNAfMet結(jié)合，最后與50S大亞基結(jié)合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結(jié)合，再與模板mRNA結(jié)合，最后與60S大亞基結(jié)合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始復(fù)合物。起始復(fù)合物的生成除了需要GTP提供能量外，還需要Mg2+、NH4+及3個起始因子（IF-1、IF-2、IF-3）。 真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始機制與原核生物基本相同，其真核生物蛋白質(zhì)生物合成的起始機制與原核生物基本相同，其差異主要是核糖體較大，有較多的起始因子參與

27、，其差異主要是核糖體較大，有較多的起始因子參與，其mRNA具有具有m7GpppNp帽子結(jié)構(gòu)，帽子結(jié)構(gòu)，Met-tRNAMet不甲酰化，不甲酰化，mRNA分子分子5 端端的的“帽子帽子”和和3 端的多聚端的多聚A都參與形成翻譯起始復(fù)合物。都參與形成翻譯起始復(fù)合物。 生成起始復(fù)合物，第一個氨基酸（生成起始復(fù)合物，第一個氨基酸（fMet/Met-tRNAfMet/Met-tRNA）與核糖體結(jié)合）與核糖體結(jié)合以后，肽鏈開始伸長。按照以后，肽鏈開始伸長。按照mRNAmRNA模板密碼子的排列，氨基酸通過新生肽模板密碼子的排列，氨基酸通過新生肽鍵的方式被有序地結(jié)合上去。肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個氨基鍵

28、的方式被有序地結(jié)合上去。肽鏈延伸由許多循環(huán)組成，每加一個氨基酸就是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括酸就是一個循環(huán)，每個循環(huán)包括AA-tRNAAA-tRNA與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和與核糖體結(jié)合、肽鍵的生成和移位、移位、 的脫落的脫落。 掌握肽鏈延伸的具體過程掌握肽鏈延伸的具體過程1 1）后續(xù)后續(xù)AA-tRNA與核糖體結(jié)合（與核糖體結(jié)合（）2）肽鍵的生成）肽鍵的生成(轉(zhuǎn)肽轉(zhuǎn)肽)3）移位）移位4）3 肽鏈的延伸 肽鏈的延伸過程中，當(dāng)終止密碼子肽鏈的延伸過程中，當(dāng)終止密碼子UAAUAA、UAGUAG或或UGAUGA出現(xiàn)在核糖出現(xiàn)在核糖體的體的A A位時，沒有相應(yīng)的位時，沒有相應(yīng)的AA-tRNAAA-tRNA能

29、與之結(jié)合，而釋放因子能識別能與之結(jié)合，而釋放因子能識別這些密碼子并與之結(jié)合，水解這些密碼子并與之結(jié)合，水解P P位上多肽鏈與位上多肽鏈與tRNAtRNA之間的二酯鍵。之間的二酯鍵。接著，新生的肽鏈和接著，新生的肽鏈和tRNAtRNA從核糖體上釋放，核糖體大、小亞基解從核糖體上釋放，核糖體大、小亞基解體，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。釋放因子體，蛋白質(zhì)合成結(jié)束。釋放因子RFRF具有具有GTPGTP酶活性，它催化酶活性，它催化GTPGTP水水解，使肽鏈與核糖體解離。解，使肽鏈與核糖體解離。 細菌細胞內(nèi)存在三種不同的終止因子（或稱釋放因子，細菌細胞內(nèi)存在三種不同的終止因子（或稱釋放因子，RF1RF1，RF2RF2

30、，RF3RF3），），RF1RF1能識別能識別UAGUAG和和UAAUAA，RF2RF2識別識別UGAUGA和和UAAUAA。一旦。一旦RFRF與與終止密碼相結(jié)合，它們就能誘導(dǎo)肽基轉(zhuǎn)移酶把一個水分子而不是終止密碼相結(jié)合，它們就能誘導(dǎo)肽基轉(zhuǎn)移酶把一個水分子而不是氨基酸加到延伸中的肽鏈上。氨基酸加到延伸中的肽鏈上。RF3RF3可能與核糖體的解體有關(guān)。真核可能與核糖體的解體有關(guān)。真核細胞只有一個（細胞只有一個（RFRF）終止因子。）終止因子。4 4 肽鏈的終止肽鏈的終止 蛋白質(zhì)前體的加工蛋白質(zhì)前體的加工 新生的多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必須經(jīng)過加工修飾才新生的多肽鏈大多數(shù)是沒有功能的，必須經(jīng)過加工修

31、飾才能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。能轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘牡鞍踪|(zhì)。1 1N N端端fMetfMet或或MetMet的切除的切除2 2二硫鍵的形成二硫鍵的形成3 3特定氨基酸的修飾特定氨基酸的修飾4 4切除新生肽鏈中非功能片段切除新生肽鏈中非功能片段 4.4.6 4.4.6 蛋白質(zhì)合成抑制劑蛋白質(zhì)合成抑制劑 蛋白質(zhì)生物合成的抑制劑主要是一些抗生素，如嘌呤霉素、鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素等，此外，如5-甲基色氨酸、環(huán)已亞胺、白喉毒素、蓖麻蛋白和其他核糖體滅活蛋白等都能抑制蛋白質(zhì)的合成。鏈霉素鏈霉素是一種堿性三糖，能干擾是一種堿性三糖，能干擾fMet-tRNA與核糖體的結(jié)合，與核糖體的結(jié)合，從而阻止蛋白質(zhì)合成

32、的正確起始，也會導(dǎo)致從而阻止蛋白質(zhì)合成的正確起始，也會導(dǎo)致mRNA的錯讀。的錯讀。嘌呤霉素嘌呤霉素是是AA-tRNA的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的的結(jié)構(gòu)類似物，能結(jié)合在核糖體的A位上位上，抑制，抑制AA-tRNA的進入，嘌呤霉素是通過的進入，嘌呤霉素是通過提前釋放肽鏈提前釋放肽鏈來抑制來抑制蛋白質(zhì)合成的蛋白質(zhì)合成的 蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)機制蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)機制一般說來，蛋白質(zhì)運轉(zhuǎn)可分為兩大類：翻譯運轉(zhuǎn)同步機制:蛋白質(zhì)的合成和運轉(zhuǎn)同時發(fā)生的翻譯后運轉(zhuǎn)機制：蛋白質(zhì)從核糖體上釋放后才發(fā)生運轉(zhuǎn)。 分子生物學(xué)研究方法分子生物學(xué)研究方法 劉劍劉劍 二、限制性核酸內(nèi)切酶二、限制性核酸內(nèi)切酶1.1.限制性核酸內(nèi)切酶的概念限制

33、性核酸內(nèi)切酶的概念是一類能夠識別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸水解酶。 3.3.限制性核酸內(nèi)切酶的分類限制性核酸內(nèi)切酶的分類根據(jù)限制性核酸內(nèi)切酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為、型三類。主要特性型型型型限制修飾蛋白結(jié)構(gòu)輔助因子識別序列切割位點切割位點多功能異源三聚體ATP Mg2+ SAM距識別序列1kb處隨機性切割單功能同源三聚體Mg2+ 4-8bp回文序列識別序列內(nèi)或附近特異切割雙功能異源二聚體ATP Mg2+距識別序列下游24-26bp處隨機性切割 4. 4.型限制性核酸內(nèi)切酶的功能型限制性核酸內(nèi)切酶的功能型限制性核酸內(nèi)切酶有嚴(yán)格

34、的識別、切割順序，識別序列一般為48個堿基對，具有迴文結(jié)構(gòu)。它以核酸內(nèi)切方式水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5端為P，3端為OH。限制性核酸內(nèi)切酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口。 5.II5.II型限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)操作型限制性核酸內(nèi)切酶酶切反應(yīng)操作大部分II型限制性核酸內(nèi)切酶需要相似反應(yīng)條件：Tris-HCl 50mmol/L pH7.5MgCl2 10mmol/LNaCl 0-100mmol/LDTT 1mmol/LVolume 20-100L Temperature Time 1-1.5h1 1個單位限制性核酸內(nèi)切酶：在建議使用的緩沖液個單位限制性核酸內(nèi)切酶：在建議使

35、用的緩沖液及溫度下，在及溫度下，在50L50L反應(yīng)液中反應(yīng)反應(yīng)液中反應(yīng)1h1h，使，使1g1g標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)DNADNA完全消化所需的酶量。完全消化所需的酶量。.限制性核酸內(nèi)切酶的星活性限制性核酸內(nèi)切酶的星活性指由于反應(yīng)條件改變，酶切的核酸序列不同于它特定的識別序列,即酶切反應(yīng)的特異性發(fā)生了改變。星活性產(chǎn)生的原因如下星活性產(chǎn)生的原因如下： 反應(yīng)體系中甘油的濃度大于5%。 酶用量過大，大于100U/微克DNA。 低離子強度，小于25mmol/L。 高pH，大于8.0。 含有機劑，如乙醇、二甲基亞砜、二甲基乙 酰胺等。 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二價離子的存在。常發(fā)生星活性的內(nèi)

36、切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。 5.2.2 5.2.2 DNADNA分子的連接分子的連接（運用（運用DNADNA連接酶進行連接）連接酶進行連接）DNA連接酶能催化雙鏈DNA切口處的5-磷酸根和3-羥基生成磷酸二酯鍵。這種反應(yīng)需要能量。大腸桿菌和其他細菌的DNA連接酶以NAD+作為能量來源，動物細胞和噬菌體的連接酶則以ATP作為能量來源。1.1.將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（00）預(yù)處理的低）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質(zhì)球）。 細菌轉(zhuǎn)化，是

37、指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的細菌菌株的DNADNA而導(dǎo)致遺傳性狀特征發(fā)生改變的生命過程。而導(dǎo)致遺傳性狀特征發(fā)生改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化提供轉(zhuǎn)化DNADNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNADNA的細菌菌的細菌菌株則被稱為受體菌株。株則被稱為受體菌株。 處于能夠接受外源處于能夠接受外源DNADNA狀態(tài)的細胞稱為狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞。5.2.3 5.2.3 細菌轉(zhuǎn)化細菌轉(zhuǎn)化步驟：步驟：2.2.外源外源DNADNA粘附在細胞表面粘附在細胞表面, ,形成復(fù)形成復(fù)合物。合物。 3.3.立即將該體系轉(zhuǎn)移

38、到立即將該體系轉(zhuǎn)移到4242下做短下做短暫的熱刺激，復(fù)合物便會被細胞所暫的熱刺激，復(fù)合物便會被細胞所吸收。吸收。4.4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復(fù)化基因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復(fù)5. 5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。子。5.2.3 5.2.3 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 自從瓊脂糖（自從瓊脂糖（agaroseagarose）和聚丙烯酰胺（）和聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝）凝膠被引入核酸研究以來，按膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離分子量大小分離DNADNA片

39、段片段的凝膠電泳技的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNADNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的分子生物學(xué)研究方法。作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的分子生物學(xué)研究方法。 一種帶電分子被放置到電場中，它就會以一種帶電分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的的遷移率遷移率，它與電場強度、電泳分子本身所，它與電場強度、電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)、分子大小、形狀、電泳介攜

40、帶的凈電荷數(shù)、分子大小、形狀、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)系質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān)系 。 在一般情況下，核酸分子之糖在一般情況下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基團，磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNADNA和和RNARNA多核苷酸鏈又被稱為多核苷酸鏈又被稱為多多聚陰離子聚陰離子，把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會向正，把這些核酸分子放置在電場當(dāng)中，它們就會向正電極的方向遷移。電極的方向遷移。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔2.4. PCR(2.4. PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒?/p>

41、應(yīng)) )及其應(yīng)及其應(yīng)用用概念：概念：在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定DNA序列進 行的體外擴增反應(yīng)。由多個循環(huán)組成。每個循環(huán)包括了變性、退火以及延伸三個階段。能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4 4種種dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0 0.1 12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2 2.5u5uMgMg2+ 2+ 1 1.5mmol/L5mmol/L五、PCR中應(yīng)注意的事項（一）防止污染（一）防止污染

42、試劑小量分裝試劑小量分裝吸頭及吸頭及EPEP管一次性使用管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對照（二）設(shè)立對照：陽性對照：陽性對照： 陽性模板陽性模板陰性對照：陰性對照： 陰性模板陰性模板試劑對照：試劑對照： 除模板外的所有組分除模板外的所有組分基因克?。ǚ肿涌寺』蚩寺。ǚ肿涌寺olecular cloningmolecular cloning）-通過體外重組技術(shù)通過體外重組技術(shù), ,將一段目的將一段目的DNADNA經(jīng)切割、連接經(jīng)切割、連接插入適當(dāng)載體插入適當(dāng)載體, ,并導(dǎo)入受體細胞，進行永久保存和并導(dǎo)入受體細胞，進行永久保存和復(fù)制的過程。復(fù)制

43、的過程。運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復(fù)制能力為外源基因的擴增提供必要的條件、載體特點、載體特點至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中至少有一個復(fù)制起點，因而至少可在一種生物體中自主復(fù)制。自主復(fù)制。2.2. 至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源至少應(yīng)有一個克隆位點，以供外源DNADNA插入。插入。3.3. 至少應(yīng)有一個至少應(yīng)有一個遺傳標(biāo)記遺傳標(biāo)記基因，以指示載體或重組基因，以指示載體或重組DNADNA分子是否進入宿主細胞分子是否進入宿主細胞酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)巧妙地利用了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)巧妙地利用了真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的組件式

44、結(jié)構(gòu)（控因子的組件式結(jié)構(gòu)（modularmodular）特征，酵母轉(zhuǎn)錄因）特征，酵母轉(zhuǎn)錄因子子GAL4GAL4 的的DNADNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合結(jié)構(gòu)域BD BD 和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域ADAD是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。只有當(dāng)只有當(dāng)他他們在空間上接近時才能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。們在空間上接近時才能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。 將編碼待測蛋白的基因分別與編碼將編碼待測蛋白的基因分別與編碼BDBD及編碼及編碼ADAD基因構(gòu)成融合基因，并導(dǎo)入酵母細胞中。如果待測基因構(gòu)成融合基因，并導(dǎo)入酵母細胞中。如果待測蛋白間存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子蛋白間存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子G

45、AL4GAL4發(fā)揮作用，發(fā)揮作用，促使報告基因表達；如果待測蛋白間不存在相互作促使報告基因表達；如果待測蛋白間不存在相互作用，則轉(zhuǎn)錄因子用，則轉(zhuǎn)錄因子GAL4GAL4不能發(fā)揮作用，報告基因不表不能發(fā)揮作用，報告基因不表達。達。 1）已知蛋白之間相互作用的檢測：已知蛋白之間相互作用的檢測：2 2）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定）蛋白質(zhì)的功能域研究：通過對其中某一個蛋白質(zhì)作缺失或定點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功點突變，再用此系統(tǒng)檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關(guān)鍵氨基酸；能域或關(guān)鍵氨基酸；3 3）克隆新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與）克隆新

46、基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質(zhì)基因與BDBD基因構(gòu)建基因構(gòu)建成成“誘餌誘餌”表達質(zhì)粒，將某一器官或組織的表達質(zhì)粒，將某一器官或組織的cDNAcDNA文庫與文庫與ADAD基基因構(gòu)建成因構(gòu)建成“獵物獵物”基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細胞，可篩到與感興基因庫，共轉(zhuǎn)化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的趣蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的cDNAcDNA序列，并推測其蛋白質(zhì)序序列，并推測其蛋白質(zhì)序列。列。 用途用途5.4 5.4 核酸雜交技術(shù)核酸雜交技術(shù)（一）（一）Southern BlotSouthern Blot原理：將待檢測的將待檢測的DNADNA分子經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠分子經(jīng)限制性內(nèi)切

47、酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的物標(biāo)記的DNADNA或或RNARNA探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針探針進行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。待檢的片段及其相對大

48、小。用途：檢測用途：檢測DNADNA樣品中的基因及其含量，了解基因的狀態(tài)樣品中的基因及其含量，了解基因的狀態(tài), , 如如是否有點突變、擴增重排等。是否有點突變、擴增重排等。 原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同Southern Blot相同的原理進行轉(zhuǎn)膜和用探針進行雜交檢測。用途：檢測RNA樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。 （二）Northern Blot 5.5 RNA 5.5 RNA 干擾干擾二、二、RNAiRNAi的基本原理的基本原理 RNAi具有特異性和高效性。是一個依賴ATP的過程，一種稱為Dicer的核酸酶負(fù)責(zé)將dsRNA酶切轉(zhuǎn)化為3

49、端有23nt突出、長2123bp 的小分子雙鏈RNA ，這種RNA稱為小干擾RNA（siRNA）。siRNA形成之后，與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA誘導(dǎo)干擾復(fù)合體(RISC)，此復(fù)合物通過堿基互補配對識別靶mRNA 并使其降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默。遺傳圖與物理圖遺傳圖與物理圖 遺傳作圖（遺傳作圖（Genetic mapping） 采用遺傳學(xué)分析采用遺傳學(xué)分析方法將基因或其它方法將基因或其它DNA順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建順序標(biāo)定在染色體上構(gòu)建連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分析等。連鎖圖。這一方法包括雜交實驗，家系分析等。物理作圖（物理作圖（Physical mapping） 采用分子生

50、物學(xué)采用分子生物學(xué)技術(shù)直接將技術(shù)直接將DNA分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基分子標(biāo)記、基因或克隆標(biāo)定在基因組實際位置。因組實際位置。常用的物理作圖方法： 由于遺傳圖的以上局限，須用物理圖對其進行驗證，由于遺傳圖的以上局限，須用物理圖對其進行驗證，校正和補充。校正和補充。限制性作圖（限制性作圖（Restriction mappingRestriction mapping） 熒光原位雜交（熒光原位雜交（Fluorescent in situ hybridization, Fluorescent in situ hybridization, FISHFISH）作圖）作圖順序標(biāo)簽位點（順序標(biāo)簽位點（Seq

51、uence tagged site, STSSequence tagged site, STS）作圖）作圖 各種作圖法比較限制性作圖快速，可提供詳細信息，但不適限制性作圖快速，可提供詳細信息，但不適合大基因組。合大基因組。熒光原位雜交操作困難，資料積累慢，一次熒光原位雜交操作困難，資料積累慢，一次實驗定位的分子標(biāo)記不超過實驗定位的分子標(biāo)記不超過3-43-4個。個。繪制詳細的物理圖還須尋找更有效方法。繪制詳細的物理圖還須尋找更有效方法。序列標(biāo)記位點（STS）作圖w 目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大基因組作出目前最有效的物理作圖技術(shù)，也是能對大基因組作出最詳盡圖譜的技術(shù)。最詳盡圖譜的技術(shù)。w序

52、列標(biāo)記位點序列標(biāo)記位點( (STS)STS)是一段短的是一段短的DNADNA序列，通常長度在序列，通常長度在100100到到500500bpbp，易于識別，每個基因組僅一份拷貝易于識別，每個基因組僅一份拷貝 。w作圖時，先獲取來自完整基因組的作圖時，先獲取來自完整基因組的DNADNA片段。使用片段。使用PCRPCR技術(shù)檢驗技術(shù)檢驗DNADNA片段中的片段中的STSSTS。兩個兩個STSSTS共存于同一片段的共存于同一片段的概率依賴于它們在基因組中的接近程度。據(jù)此可計算概率依賴于它們在基因組中的接近程度。據(jù)此可計算兩個兩個STSSTS間的距離。間的距離。 序列標(biāo)記位點（STS） 一個一個DNAD

53、NA序列要成為序列要成為STSSTS，須滿足兩個前提：，須滿足兩個前提： 1 1）首先它的序列必須是己知的，以便于用）首先它的序列必須是己知的，以便于用 PCRPCR方法檢測方法檢測STSSTS在不同在不同DNADNA片段中存在與片段中存在與 否。否。 2 2）第二個要求是）第二個要求是STSSTS必須在待研究的染色體必須在待研究的染色體 上有惟一的定位。如果上有惟一的定位。如果STSSTS序列具有多個序列具有多個 定位點，那么作圖數(shù)據(jù)將會模糊不清。因定位點，那么作圖數(shù)據(jù)將會模糊不清。因 此要確保此要確保STSSTS不包含重復(fù)不包含重復(fù)DNADNA序列。序列。最常見的來源是：最常見的來源是：

54、1 1）表達序列標(biāo)簽（）表達序列標(biāo)簽（ESTEST）：是從）：是從cDNAcDNA克隆中獲得的克隆中獲得的短序列。須來自單拷貝基因而非基因家族成員。短序列。須來自單拷貝基因而非基因家族成員。 2 2）簡單序列長度多態(tài)性：）簡單序列長度多態(tài)性： SSLPSSLP在作圖中可被用作在作圖中可被用作STSSTS，具有多態(tài)性并已通過連鎖分析定位，直接建立遺，具有多態(tài)性并已通過連鎖分析定位，直接建立遺傳圖與物理圖的聯(lián)系。傳圖與物理圖的聯(lián)系。 3 3）隨機基因組序列）隨機基因組序列 可以通過對克隆的基因組可以通過對克隆的基因組DNADNA的隨機小片段進行測序或在數(shù)據(jù)庫中搜尋貯存序列獲的隨機小片段進行測序或在

55、數(shù)據(jù)庫中搜尋貯存序列獲得得STSSTS。 序列標(biāo)記位點（STS） 原核基因表達調(diào)控模式原核基因表達調(diào)控模式主講教師：郭主講教師：郭 芬芬 guofen_基因表達基因表達與與基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控組成型表達組成型表達和和適應(yīng)型表達適應(yīng)型表達調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因和和結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因操縱子操縱子意義意義 ：細胞在生命過程中，把蘊藏在DNA中的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成為蛋白質(zhì)或功能RNA分子的過程稱為基因表達。 圍繞基因表達過程中發(fā)生的各種各樣的調(diào)節(jié)方式都統(tǒng)稱為基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控。功能性功能性RNA的基的基因表達因表達二、基因表達的方式：二、基因表達的方式：組成型表達組成型表達及及適應(yīng)型表達

56、適應(yīng)型表達、組成型表達組成型表達(constitutive expression)(constitutive expression) ：指不大受環(huán)境：指不大受環(huán)境變動而變化的一類基因表達。如聚合酶，聚合酶等變動而變化的一類基因表達。如聚合酶，聚合酶等代謝過程中十分必需的酶或蛋白質(zhì)的表達。代謝過程中十分必需的酶或蛋白質(zhì)的表達。某些基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱某些基因在一個個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常被稱為管家基因為管家基因(housekeeping gene)(housekeeping gene)。管家基因無論表達水平高低，較少受到環(huán)境因素的影響。在基因管家基因無論表達

57、水平高低，較少受到環(huán)境因素的影響。在基因表達研究中，常作為對照基因表達研究中，常作為對照基因、適應(yīng)型表達（、適應(yīng)型表達（adaptive expression)adaptive expression)：指環(huán)境的變化容指環(huán)境的變化容易使其表達水平變動的一類基因表達。易使其表達水平變動的一類基因表達。應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達水平增高或從無到有的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)應(yīng)環(huán)境條件變化基因表達水平增高或從無到有的現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)(induction)(induction)，這類基因被稱為，這類基因被稱為可誘導(dǎo)的基因可誘導(dǎo)的基因(inducible gene)(inducible gene)；相反，隨環(huán)境條件變化而基因表

58、達水平降低或變?yōu)椴槐磉_的現(xiàn)象稱相反，隨環(huán)境條件變化而基因表達水平降低或變?yōu)椴槐磉_的現(xiàn)象稱為阻遏為阻遏(repression)(repression)，相應(yīng)的基因被稱為，相應(yīng)的基因被稱為可阻遏的基因可阻遏的基因(repressible gene)(repressible gene)。三、結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因三、結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因（structural genesstructural genes）：編碼蛋白質(zhì)或功能性）：編碼蛋白質(zhì)或功能性RNARNA的任何基因。的任何基因。所編碼的蛋白質(zhì)主要是組成細胞和組織基本所編碼的蛋白質(zhì)主要是組成細胞和組織基本成分的結(jié)構(gòu)蛋白、具有催化活性的酶和調(diào)

59、節(jié)蛋白等。成分的結(jié)構(gòu)蛋白、具有催化活性的酶和調(diào)節(jié)蛋白等。 原核生物的結(jié)構(gòu)基因一般成簇排列，真核生物獨立原核生物的結(jié)構(gòu)基因一般成簇排列，真核生物獨立存在。結(jié)構(gòu)基因簇由單一啟動子共同調(diào)控。存在。結(jié)構(gòu)基因簇由單一啟動子共同調(diào)控。調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因啟動子啟動子操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因ABC調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因（regulator genes）：參與其他基因表達調(diào)控：參與其他基因表達調(diào)控的的RNARNA或蛋白質(zhì)的編碼基因?；虻鞍踪|(zhì)的編碼基因。調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)基因編碼的調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)物質(zhì)通過與通過與DNADNA上的特定位點結(jié)合上的特定位點結(jié)合控制轉(zhuǎn)錄是調(diào)控的關(guān)鍵。控制轉(zhuǎn)錄是調(diào)控的關(guān)鍵。調(diào)節(jié)物與調(diào)節(jié)物與D

60、NADNA特定位點的相互作用能以特定位點的相互作用能以正調(diào)控的方式正調(diào)控的方式（啟動或增強基因表達活性）調(diào)節(jié)靶基因，也能以（啟動或增強基因表達活性）調(diào)節(jié)靶基因，也能以負(fù)調(diào)負(fù)調(diào)控的方式控的方式（關(guān)閉或降低基因表達活性）調(diào)節(jié)靶基因。（關(guān)閉或降低基因表達活性）調(diào)節(jié)靶基因。操縱子操縱子：由：由操縱基因操縱基因以及相鄰的若干以及相鄰的若干結(jié)構(gòu)基結(jié)構(gòu)基 因因所組成的所組成的功能單位功能單位，其中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)，其中結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄受操縱基因的控制。錄受操縱基因的控制。 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因啟動子啟動子操縱基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因A 操縱子（操縱子（operon）BC一、原核生物的基因調(diào)控特點：一、原核生物的基