分子生物學(xué)：第十三章 基因治療原理與研究進(jìn)展

1、1第十三章第十三章 基因治療原理與研基因治療原理與研究進(jìn)展究進(jìn)展2根據(jù)靶細(xì)胞不同，基因治療分為：根據(jù)靶細(xì)胞不同，基因治療分為：體細(xì)胞體細(xì)胞( (somatic somatic cell)cell)基因治療基因治療生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞( (germline)germline)基因治療基因治療v只限于某一體細(xì)胞的只限于某一體細(xì)胞的基因的改變基因的改變v只限于某個(gè)體的當(dāng)代只限于某個(gè)體的當(dāng)代v對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正行矯正v當(dāng)代及子代當(dāng)代及子代3基因治療的概念基因治療的概念n將某個(gè)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者將某個(gè)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病

2、目的方用，以達(dá)到治療疾病目的方法。法。41. 基因治療的策略基因治療的策略 內(nèi)容提要內(nèi)容提要2. 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 4. 治療基因的受控表達(dá)治療基因的受控表達(dá)3. 基因干預(yù)基因干預(yù)5. 基因治療的應(yīng)用研究基因治療的應(yīng)用研究6 基因治療的問題與展望基因治療的問題與展望5 第一節(jié)第一節(jié) 基因治療的策略基因治療的策略6一、基因置換（一、基因置換（gene replacement） 定義：定義：將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過通過定位重組定位重組，導(dǎo)入的正常基因置換基因組，導(dǎo)入的正常基因置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。內(nèi)原有的缺陷基因。 目的：目的：將缺陷基因的異常

3、序列進(jìn)行校正。將缺陷基因的異常序列進(jìn)行校正。 對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。 7n定向整合的條件定向整合的條件: :轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組因組DNA具有相同的序列。帶有目的基具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換，使基因置換這行部分基因序列的交換，使基因置換這一治療策略得以實(shí)現(xiàn)。一治療策略得以實(shí)現(xiàn)。n又稱又稱基因打靶基因打靶( (gene targeting）基因同源重組技術(shù)基因同源重組技術(shù)8缺陷基因缺陷

4、基因正?；蛘；蛑亟M載體重組載體正?；蛘；蚨ㄎ恢亟M技術(shù)定位重組技術(shù)染色體染色體9二、基因添加二、基因添加 (gene augmentation) 定義：定義：通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。身不表達(dá)的基因。類型：類型：A.在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；谟腥毕莼虻募?xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正常基因，細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)因，細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正常基因的表達(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；功能；B.向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)

5、物達(dá)到治療疾病的目的。利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。10定義：定義：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。例如例如反義核酸反義核酸、核酶核酶或或干擾干擾RNARNA技術(shù)等。技術(shù)等。三、基因干預(yù)三、基因干預(yù)（gene interference）11 為惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。為惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。n原理原理: :將將“自殺自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物這種基因編碼的酶能

6、使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞產(chǎn)生“自殺自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。除腫瘤細(xì)胞的目的。四、自殺基因治療四、自殺基因治療12自殺基因的作用機(jī)制自殺基因的作用機(jī)制 13A.A. T K / G C VT K / G C V ： 單 純 皰 疹 病 毒 （： 單 純 皰 疹 病 毒 （ h e r p s h e r p s simplex virus, simplex virus, HSVHSV）型胸苷激酶型胸苷激酶（thymidine kinase, thymidine kinase, tktk）基因編碼胸基

7、因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（丙氧鳥苷（ganciclovir, ganciclovir, GCVGCV）轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)變成毒性毒性GCVGCV三磷酸核苷，抑制三磷酸核苷，抑制DNADNA聚合酶活聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（一）自殺基因系統(tǒng)（一）自殺基因系統(tǒng)14B.B. CD/5-FCCD/5-FC：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosine deaminase, cytosine deaminase, CDCD）基因，在基因，在細(xì)胞內(nèi)將無毒性細(xì)胞內(nèi)將無毒性5-5-氟胞嘧啶（氟胞嘧啶（5-5-FCFC）轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變成

8、毒性產(chǎn)物變成毒性產(chǎn)物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-5-FUFU）。）。（一）自殺基因系統(tǒng)（一）自殺基因系統(tǒng)15 旁觀者效應(yīng)旁觀者效應(yīng)：“自殺基因自殺基因”導(dǎo)入后，不僅導(dǎo)入后，不僅使導(dǎo)入了使導(dǎo)入了“自殺基因自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰或遠(yuǎn)處的未轉(zhuǎn)導(dǎo)后被殺死，而且與其相鄰或遠(yuǎn)處的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。的腫瘤細(xì)胞也被殺死。增強(qiáng)了自殺基因的腫瘤殺傷作用。增強(qiáng)了自殺基因的腫瘤殺傷作用。（二）旁觀者效應(yīng)（二）旁觀者效應(yīng)16五、基因免疫治療五、基因免疫治療 通過將抗癌免疫增強(qiáng)的通過將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子細(xì)胞因子或或MHCMHC基因基因?qū)肽[瘤組

9、織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的導(dǎo)入腫瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)?？拱┟庖叻磻?yīng)。 17第二節(jié)第二節(jié) 基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 18基因基因轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移的兩種方式的兩種方式載體載體目的基因目的基因in vivoex vivo靶細(xì)胞靶細(xì)胞將目的基因直將目的基因直接輸入體內(nèi)接輸入體內(nèi)將目的基因?qū)牖颊邔⒛康幕驅(qū)牖颊甙屑?xì)胞靶細(xì)胞, ,體外培養(yǎng)體外培養(yǎng)將重組靶細(xì)將重組靶細(xì)胞回輸體內(nèi)胞回輸體內(nèi)19基因治療基因治療轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移的方式的方式1. 1. 直接體內(nèi)療法（直接體內(nèi)療法（in vivoin vivo） 是指將目的基因是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并

10、進(jìn)行表達(dá)。器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。2. 2. 間接體內(nèi)療法（間接體內(nèi)療法（ex vivoex vivo） 在體外將目的基因在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選導(dǎo)入靶細(xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。目的。 20 一、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)一、病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) 病毒載體病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，是使用最多的基因治療載體。其中用得是使用最多的基因治療載體。其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。21（一）逆轉(zhuǎn)

11、錄病毒（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒（Retrovirus）載體載體+ssRNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶核心蛋白核心蛋白膜蛋白膜蛋白人類免疫缺陷病毒人類免疫缺陷病毒 （HIV） 22逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期23逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期24逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期2526（1 1）兩端各有一長末端重復(fù)序列）兩端各有一長末端重復(fù)序列LTRLTR。 1. 1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（2 2）LTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分組成。三部分組成。A.A.U3U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子； B.B.U3U3和和U5U5

12、兩端分別有病毒整合序列兩端分別有病毒整合序列( (IS)IS) ； C.C.在在R R內(nèi)還有內(nèi)還有poly(A)poly(A)加尾信號(hào)。加尾信號(hào)。 27 1. 1. 逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) （3 3）病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因：）病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因： gaggag、polpol和和envenv基因基因（4 4）5 5端端LTRLTR下游有一段病毒包裝所必需的序列（下游有一段病毒包裝所必需的序列（）及剪接供體位點(diǎn)及剪接供體位點(diǎn)( (SD)SD)和剪接受體位點(diǎn)和剪接受體位點(diǎn)( (SA)SA)。282.2.逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) (1) (1)

13、 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 保留病毒顆粒的包裝信號(hào)，而缺失病毒顆保留病毒顆粒的包裝信號(hào)，而缺失病毒顆粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源基因，粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。LTR therapeutic gene LTR292.2.逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) (2) (2) 輔助細(xì)胞株輔助細(xì)胞株 它由另一種缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建它由另一種缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒感染構(gòu)建而成。該細(xì)胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉(zhuǎn)而成。該細(xì)胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝。由于缺乏包裝型號(hào)，本

14、身錄病毒載體包裝。由于缺乏包裝型號(hào)，本身不能被包裝成病毒顆粒。不能被包裝成病毒顆粒。gag pol env30Retroviral packaging system31 逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和和pol的缺的缺失不影響其他部分的活性。失不影響其他部分的活性。 包裝好的假病毒顆粒易于分離制備。包裝好的假病毒顆粒易于分離制備。 逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。靶細(xì)胞。 前病毒通過前病毒通過LTR高效高效整合整合至靶細(xì)胞基因至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永永久表達(dá)久表達(dá)。 3.逆轉(zhuǎn)錄

15、病毒載體的特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn) 32 4. 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn) 隨機(jī)整合隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基，有插入突變、激活癌基因的因的潛在危險(xiǎn)潛在危險(xiǎn)； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納容納7 7 kbkb以下以下的外源基因。的外源基因。33 （二）腺病毒（二）腺病毒( (adenovirus，AV) )載體載體34 （二）腺病毒（二）腺病毒( (adenovirus，AV) )載體載體 腺病毒是一種大分子腺病毒是一種大分子(36 kb)雙鏈無包雙鏈無包膜膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作病毒。它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)

16、，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。 35腺病毒的優(yōu)點(diǎn)腺病毒的優(yōu)點(diǎn)1.1.基因?qū)胄矢?；基因?qū)胄矢撸?.2.宿主范圍廣；宿主范圍廣；3.3.基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；4.4.重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；入或氣管內(nèi)滴注；5.5.腺病毒載體腺病毒載體容量較大容量較大，可插入，可插入7.5 7.5 kbkb外源基因。外源基因。36 腺病毒載體缺點(diǎn)腺病毒載體缺點(diǎn)2.2.宿主的免疫

17、反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。3.3.有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒：載體與輔有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒：載體與輔助細(xì)胞或患者體內(nèi)野生型病毒發(fā)生重組。助細(xì)胞或患者體內(nèi)野生型病毒發(fā)生重組。4.4.靶向性差。靶向性差。 1.1.不能整合不能整合到靶細(xì)胞的基因組到靶細(xì)胞的基因組DNADNA中。中。治療基因治療基因表達(dá)時(shí)間相對較短表達(dá)時(shí)間相對較短。37 （三）腺病毒相關(guān)病毒載體（三）腺病毒相關(guān)病毒載體AAV Virus Particle 腺病毒相關(guān)病毒腺病毒相關(guān)病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一類單鏈線狀是一類單鏈線狀DN

18、A缺陷型病毒。其基因組缺陷型病毒。其基因組DNA小于小于5 kb，無包膜，外形為裸露的無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。面體顆粒。AAV不能獨(dú)立不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞復(fù)制，只有在輔助病毒存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染潛伏感染。38Structure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒復(fù)制基因病毒復(fù)制基因, CAP:編碼衣殼蛋白的基因編碼衣殼蛋白的基因ITR：反向末端重復(fù)序列：反向末端重復(fù)序列39AAVAAV的特點(diǎn)的特點(diǎn) 以潛伏感染為主；以潛伏感染為主； AAVAAV可以高效可以

19、高效定點(diǎn)整合定點(diǎn)整合至人染色至人染色體中：可以避免隨機(jī)整合可能帶體中：可以避免隨機(jī)整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)?？梢猿掷m(xù)穩(wěn)定表達(dá)。40 AAVAAV載體的缺陷：載體的缺陷： AAVAAV載體載體容量小容量小，目前最多只能容，目前最多只能容納納5 5 kbkb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在在40%-80%40%-80%的成人中存在過感染，的成人中存在過感染，可能會(huì)引起免疫排斥?？赡軙?huì)引起免疫排斥。41常用基因治療載體常用基因治療

20、載體 整合特點(diǎn)整合特點(diǎn)安全性安全性感染細(xì)胞感染細(xì)胞克隆容量克隆容量逆 轉(zhuǎn) 錄 病逆 轉(zhuǎn) 錄 病毒載體毒載體隨機(jī)整合，隨機(jī)整合，效率高效率高可能致病可能致病分裂細(xì)胞分裂細(xì)胞 7kb腺 病 毒 載腺 病 毒 載體體不整合，可不整合，可能丟失能丟失安全性較安全性較高高分裂細(xì)胞、分裂細(xì)胞、非 分 裂 細(xì)非 分 裂 細(xì)胞胞 腺 相 關(guān) 病腺 相 關(guān) 病毒載體毒載體定點(diǎn)整合定點(diǎn)整合安全性較安全性較高高分裂細(xì)胞、分裂細(xì)胞、非 分 裂 細(xì)非 分 裂 細(xì)胞胞 5kb7.5kb42二、非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)二、非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng) （一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 基本原

21、理基本原理：利用陽離子脂質(zhì)體單體：利用陽離子脂質(zhì)體單體與與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。 43 脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖44 （二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)（二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù) 將將DNADNA與細(xì)胞或組織親和性與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使的配體偶聯(lián)，可使DNADNA具有靶向性。具有靶向性。45受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖46 （三）基因直接

22、注射技術(shù)（三）基因直接注射技術(shù) 如：肌內(nèi)注射凝血因子如：肌內(nèi)注射凝血因子基因，可基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子產(chǎn)生血友病所需的凝血因子 。47第三節(jié)第三節(jié) 基因干預(yù)基因干預(yù)一、反義一、反義RNA二、二、RNA干擾干擾三、核酶三、核酶48 一、反義一、反義RNARNA （一）（一） 反義反義RNARNA與基因表達(dá)調(diào)控與基因表達(dá)調(diào)控 主要指能與特定基因主要指能與特定基因mRNAmRNA互補(bǔ)結(jié)互補(bǔ)結(jié)合的一類合的一類RNA,RNA,可抑制一些有害基因可抑制一些有害基因的翻譯。的翻譯。49 反義反義RNARNA的關(guān)鍵技術(shù)問題：的關(guān)鍵技術(shù)問題： 反義反義RNARNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題進(jìn)入靶細(xì)胞前的降

23、解問題 專一性轉(zhuǎn)移問題：專一性轉(zhuǎn)移問題： 舉例舉例: : 將將脫唾液酸血清類粘蛋白脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGPASGP）與多聚賴）與多聚賴氨酸（氨酸（PLPL）共價(jià)連接，得到共價(jià)連接，得到ASGP-PLASGP-PL復(fù)合物，成復(fù)合物，成為運(yùn)載核酸的工具?？梢詫Ｒ恍缘厥狗戳x為運(yùn)載核酸的工具。可以專一性地使反義RNARNA特特異進(jìn)入肝細(xì)胞。異進(jìn)入肝細(xì)胞。 50（二）受體介導(dǎo)反義（二）受體介導(dǎo)反義RNARNA技轉(zhuǎn)移術(shù)技轉(zhuǎn)移術(shù) 受體介導(dǎo)的受體介導(dǎo)的RNARNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；高；被轉(zhuǎn)移的被轉(zhuǎn)移的RNARNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨

24、酸的保護(hù)層間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層, , 可以抵抗可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。環(huán)境中的核酸酶的降解作用。 借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法法，可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNARNA轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移。51 （三）（三） 反義反義RNARNA的應(yīng)用前景的應(yīng)用前景 （l l）安全性高）安全性高 （2 2）反義）反義RNARNA設(shè)計(jì)和制備方便設(shè)計(jì)和制備方便 （3 3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng) （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒52二、二、RNA干擾干擾（RNA interference，RNAi）n由雙鏈由雙鏈RNA介

25、導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)特異性介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)特異性mRNA降降解過程，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默。解過程，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默。53（一）（一）RNARNA干擾機(jī)制示意圖干擾機(jī)制示意圖54（二）（二）RNARNA干擾的應(yīng)用前景干擾的應(yīng)用前景 1. 1. 研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 2. 2. 腫瘤的基因治療腫瘤的基因治療 3. 3. 病毒性疾病的基因治療病毒性疾病的基因治療55三、核酶三、核酶(ribozyme) 具有酶活性的具有酶活性的RNARNA，可降解特，可降解特異的異的mRNAmRNA序列。序列。l與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域與靶序列互補(bǔ)的區(qū)域l保守區(qū)域（構(gòu)成酶活性的結(jié)構(gòu)域）保守區(qū)域（構(gòu)成酶活性的結(jié)構(gòu)域

26、）56核酶的作用機(jī)制 57 （二）核酶的應(yīng)用（二）核酶的應(yīng)用 與一般的反義與一般的反義RNARNA相比，核酶具有較穩(wěn)相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNARNA酶的攻擊。更酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷重要的是，核酶在切斷mRNAmRNA后，又可從雜后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。 58 第四節(jié)第四節(jié) 治療基因的受控表達(dá)治療基因的受控表達(dá) 治療基因的受控表達(dá)包括控制治治療基因的受控表達(dá)包括控制治療基因表達(dá)的療基因表達(dá)的時(shí)間、空間和水平時(shí)間、空間和水平三個(gè)三個(gè)方面。方面。 其策略大致有

27、以下幾種：其策略大致有以下幾種：基因內(nèi)基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制部調(diào)節(jié)機(jī)制、基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制、利利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等。等。 59 使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件，例如酪氨酸酶基因。子元件，例如酪氨酸酶基因。 使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件，如甲胎蛋白子元件，如甲胎蛋白( (AFP)AFP)基因。基因。一、基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制一、基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制60二、基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制二、基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制 除利用基因

28、內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制以外，除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制以外，還可通過施加外部刺激，比如對病灶局還可通過施加外部刺激，比如對病灶局部進(jìn)行熱處理或電離輻射等，促進(jìn)治療部進(jìn)行熱處理或電離輻射等，促進(jìn)治療基因在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)?；蛟谔囟?xì)胞或組織中表達(dá)。61三、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)三、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá) 病灶微環(huán)境與正常時(shí)往往不同，因此可病灶微環(huán)境與正常時(shí)往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達(dá)。利用這些變化控制治療基因的表達(dá)。比如：比如：腫瘤組織往往會(huì)出現(xiàn)葡萄糖缺乏或缺氧等腫瘤組織往往會(huì)出現(xiàn)葡萄糖缺乏或缺氧等微環(huán)境；微環(huán)境；炎癥組織特殊微環(huán)境等。炎癥組織特殊微環(huán)境等。

29、62四、治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)四、治療基因的誘導(dǎo)表達(dá) 為了防止其表達(dá)不再受外界控制，所以有為了防止其表達(dá)不再受外界控制，所以有必要開發(fā)和完善一些必要開發(fā)和完善一些可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)統(tǒng)。 成分：一種是成分：一種是轉(zhuǎn)錄激活劑轉(zhuǎn)錄激活劑，它與，它與DNADNA結(jié)合結(jié)合的活性受某種誘導(dǎo)藥物控制；的活性受某種誘導(dǎo)藥物控制； 另一種則是另一種則是特異性基因表達(dá)調(diào)控元件特異性基因表達(dá)調(diào)控元件，僅對這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。僅對這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。 63四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理原理n四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受TetTet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控。阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控

30、。n無四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子無四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)。序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)。n四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。 64Tet-Off 系統(tǒng)中，系統(tǒng)中，Tet控制的轉(zhuǎn)錄活化子（控制的轉(zhuǎn)錄活化子（tTA）是野生型是野生型Tet阻遏蛋白（阻遏蛋白（TetR）與一活化蛋白）與一活化蛋白（AD）的融合體。）的融合體。65T

31、et-On 系統(tǒng)中，系統(tǒng)中，TetR中四個(gè)氨基酸變化使其結(jié)中四個(gè)氨基酸變化使其結(jié)合特性變?yōu)榉较颍ê咸匦宰優(yōu)榉较颍╮TetR)。66 第五節(jié)第五節(jié) 基因治療的應(yīng)用研究基因治療的應(yīng)用研究671 1腺苷脫氨酶腺苷脫氨酶( (ADA)ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 ( (PNP)PNP)缺乏癥缺乏癥 2 2珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病 3 3血友病和其他血漿蛋白缺乏癥血友病和其他血漿蛋白缺乏癥 4 4苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病 5 5萊萊- -納納( (Lesch-Nyhan)Lesch-Nyhan)綜合征綜合

32、征 6 6家族性高膽固醇血癥家族性高膽固醇血癥 7 7囊性纖維化病囊性纖維化病 一、遺傳病的基因治療研究一、遺傳病的基因治療研究 68第一例基因治療 腺苷脫氨酶缺乏癥n生理：腺苷脫氨酶是一種細(xì)胞內(nèi)酶，在核酸代生理：腺苷脫氨酶是一種細(xì)胞內(nèi)酶，在核酸代謝中起重要作用，使淋巴細(xì)胞中的脫氧腺苷脫謝中起重要作用，使淋巴細(xì)胞中的脫氧腺苷脫氨成為脫氧肌苷，最后代謝為尿酸，排出體外。氨成為脫氧肌苷，最后代謝為尿酸，排出體外。n病理：腺苷脫氨酶缺乏脫氧腺苷不能脫氨病理：腺苷脫氨酶缺乏脫氧腺苷不能脫氨脫氧腺細(xì)胞內(nèi)堆積淋巴細(xì)胞死亡機(jī)體免疫脫氧腺細(xì)胞內(nèi)堆積淋巴細(xì)胞死亡機(jī)體免疫功能缺乏。功能缺乏。69治療基礎(chǔ)治療基礎(chǔ)n

33、腺苷脫氨酶基因位于腺苷脫氨酶基因位于2020號(hào)染色體長臂號(hào)染色體長臂n19831983年腺苷脫氨酶基因被克隆年腺苷脫氨酶基因被克隆n應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒可將該基因送入缺乏腺苷脫氨應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒可將該基因送入缺乏腺苷脫氨酶基因的淋巴細(xì)胞酶基因的淋巴細(xì)胞n新輸入的腺苷脫氨酶基因可在原來沒有此基因新輸入的腺苷脫氨酶基因可在原來沒有此基因的淋巴細(xì)胞中表達(dá)的淋巴細(xì)胞中表達(dá) 70LTRADASV40LTR7172 治療步驟治療步驟n抽取病人骨髓，分離淋巴細(xì)胞抽取病人骨髓，分離淋巴細(xì)胞n將病人淋巴細(xì)胞與攜帶腺苷脫氨酶基因的逆轉(zhuǎn)將病人淋巴細(xì)胞與攜帶腺苷脫氨酶基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體混合培養(yǎng)，使腺苷脫氨酶進(jìn)入淋巴錄病毒載

34、體混合培養(yǎng)，使腺苷脫氨酶進(jìn)入淋巴細(xì)胞細(xì)胞n清洗淋巴細(xì)胞，去除多余病毒載體。應(yīng)用抗性清洗淋巴細(xì)胞，去除多余病毒載體。應(yīng)用抗性基因等方法選擇陽性細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)外腺苷基因等方法選擇陽性細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)外腺苷脫氨酶含量脫氨酶含量73 治療步驟治療步驟n確定腺苷脫氨酶在淋巴細(xì)胞有滿意表達(dá)后，將確定腺苷脫氨酶在淋巴細(xì)胞有滿意表達(dá)后，將帶有此基因的淋巴細(xì)胞輸回患者體內(nèi)帶有此基因的淋巴細(xì)胞輸回患者體內(nèi)。n密切觀察病人各項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化，必要時(shí)加密切觀察病人各項(xiàng)免疫指標(biāo)的變化，必要時(shí)加以調(diào)整和重復(fù)以調(diào)整和重復(fù)。 經(jīng)如上治療后，患病女童免疫功能基本恢復(fù)。經(jīng)如上治療后，患病女童免疫功能基本恢復(fù)。以后又連續(xù)進(jìn)行了多

35、次輸入以后又連續(xù)進(jìn)行了多次輸入。74v乙型血友病乙型血友病75n逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 +FcDNA +FcDNA 重組體重組體 5 LTR F neo SV PSO LTR 3n導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（導(dǎo)入倉鼠細(xì)胞（CHO CHO ）FF表達(dá)；表達(dá)；n導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）養(yǎng)）FF表達(dá)；表達(dá)；n9191年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞年，導(dǎo)入乙型血友病患者皮膚成纖維細(xì)胞（體外培養(yǎng)）（體外培養(yǎng)）回植病人皮下回植病人皮下FF基因表達(dá)，基因表達(dá)，F(xiàn)F基表達(dá)水平達(dá)正常人的基表達(dá)水平達(dá)正常人的5%5%。n是我國基因治療成功的例子。是我國基因治療成